張 宇，周佳偉，吳俊靜，喬 木，徐 忠，李梓芃，彭先文，梅書棋

（動物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢 430064）

生豬養(yǎng)殖業(yè)是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)，國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示2021 年度我國生豬存欄44 922 萬頭，出欄生豬67 128 萬頭，豬肉產(chǎn)量5 296 萬t，生豬飼養(yǎng)量和豬肉產(chǎn)量均居世界第一，占世界總量的50%以上。在生豬養(yǎng)殖和生產(chǎn)中，母豬繁殖能力的高低直接影響豬場的生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益。然而由于繁殖力屬于低遺傳力性狀，其遺傳力在0.06～0.30 之間，因此常規(guī)的育種工作很難有效提高繁殖性狀的遺傳進(jìn)展。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一批與繁殖性狀相關(guān)的重要功能基因，包括雌激素受體基因（ESR），卵泡生成素基因（FSHB）等在育種工作中廣泛應(yīng)用，有效提高了繁殖性狀的遺傳進(jìn)展。因此，進(jìn)一步挖掘繁殖性能相關(guān)的分子標(biāo)記和候選基因，并利用標(biāo)記輔助選擇和基因組選擇技術(shù)，能夠有效提升繁殖性狀等低遺傳力性狀的選育進(jìn)展。

基于高通量測序或者SNP 芯片的全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide Association Study，GWAS）已經(jīng)成為畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀候選基因挖掘的主要方法。例如，在清平豬的研究中，針對乳頭數(shù)性狀進(jìn)行GWAS 分析，挖掘到包括14 號染色體QTL 區(qū)域在內(nèi)的一系列候選基因和分子標(biāo)記。對于大白豬的研究中針對產(chǎn)仔數(shù)性狀進(jìn)行GWAS 分析，分別鑒定出1 號染色體、7 號染色體和18 號染色體上多個(gè)QTL 區(qū)域并確定和為繁殖性能的候選基因。

本研究收集1 100 頭大白豬繁殖群體，記錄總產(chǎn)仔數(shù)（Total Number Born，TNB）、產(chǎn)活仔數(shù)（Number Born Alive，NBA）和健仔數(shù)（Number Healthy Piglet，NHP）進(jìn)行GWAS 分析，鑒定與繁殖性狀相關(guān)的SNPs及候選基因，為后續(xù)通過分子育種手段進(jìn)一步加快繁殖性能的選育提供分子標(biāo)記并奠定遺傳基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和樣品采集 本研究中1 100 頭純種大白豬群體來自于貴州某商品豬育種場，采集群體耳尾組織，并記錄繁殖性狀和相關(guān)信息，包括TNB、NBA、NHP、與配公豬、分娩日期等。

1.2 “中芯一號”芯片基因分型 利用動物組織DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號DP304）提取群體樣品耳尾組織的基因組DNA，將質(zhì)檢合格的DNA 樣品利用“中芯一號”芯片進(jìn)行基因分型。利用PLINK v1.9 軟件對基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，剔除檢出率<90%、最小等位基因頻率（MAF）<0.05 以及哈代-溫伯格平衡<1×10的SNPs，剔除基因型缺失率>10%的個(gè)體。

1.3 群體結(jié)構(gòu)分析 為了確定樣本群體是否存在分層現(xiàn)象，本研究利用PLINK v1.9 軟件對有效SNPs 進(jìn)行主成分分析（PCA），獲得基因組數(shù)據(jù)特征值和特征向量，并利用MEGA X 軟件進(jìn)行鄰接樹分析，繪制個(gè)體間的遺傳距離圖譜。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 本研究采用rMVP 軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。rMVP 是一個(gè)用于GWAS 分析的經(jīng)典軟件，利用軟件中的混合線性模型（MLM）方法，將與配公豬效應(yīng)作為固定效應(yīng)加入關(guān)聯(lián)分析模型中，本實(shí)驗(yàn)采用的關(guān)聯(lián)分析模型如下：

其中，為對應(yīng)的繁殖性狀表型值包括總TNB、NBA和NHP；表示效應(yīng)矩陣；表示固定效應(yīng)向量，包括前3 個(gè)主成分和與配公豬效應(yīng)；表示SNPs 標(biāo)記分型向量；表示SNPs 標(biāo)記效應(yīng)向量；是隨機(jī)效應(yīng)，為的相關(guān)矩陣；表示殘差；其中服從正態(tài)分布N（0，K），表示SNPs 標(biāo)記解釋的加性遺傳方差；K 表示親緣關(guān)系矩陣。本研究采用 Bonferroni 多重檢驗(yàn)方法確定關(guān)聯(lián)顯性閾值，基因組水平顯著閾值為0.05/有效 SNPs 位點(diǎn)數(shù)量，染色體水平顯著閾值為1/ 有效SNP s 位點(diǎn)數(shù)量。

1.5 候選基因注釋 利用ENSEMBL（http://ftp.ensembl.org/pub/release-89/）數(shù)據(jù)庫，對GWAS 分析中顯著的SNPs 位點(diǎn)，在其上下游200 kb 區(qū)域進(jìn)行注釋，并結(jié)合文獻(xiàn)挖掘繁殖性狀相關(guān)候選基因。

2 結(jié)果

2.1 表型數(shù)據(jù)分析 對1 100 頭大白豬的頭胎產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，TNB 平均為13.13 頭，NBA 數(shù)平均為12.84 頭，NHP 平均為12.10 頭。考慮到與配公豬可能對繁殖性能產(chǎn)生影響，通過廣義線性模型對TNB、NBA 和NHP分別進(jìn)行分析，結(jié)果表明不同的與配公豬對產(chǎn)仔數(shù)性狀具有顯著影響（表1），因此在GWAS 分析過程中需要將與配公豬作為固定效應(yīng)，以提高關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確性。

表1 與配公豬對大白豬繁殖性狀的影響

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析 利用PLINK 將“中芯一號”芯片檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，共得到1 100 個(gè)有效個(gè)體及41 241個(gè)有效SNPs 位點(diǎn)，用于后續(xù)分析。通過主成分分析，繪制基于前2 個(gè)特征向量的主成分結(jié)構(gòu)圖（圖1），結(jié)果表明群體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，僅有少數(shù)個(gè)體表現(xiàn)出群體分層，因此須在關(guān)聯(lián)分析模型中加入相應(yīng)主成分進(jìn)行矯正，以減少關(guān)聯(lián)分析的假陽性。根據(jù)SNPs 位點(diǎn)計(jì)算遺傳距離，利用MEGA X 繪制群體鄰接樹（圖2），結(jié)果表明群體分支與系譜關(guān)系高度一致，可用于后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析。

圖1 群體主成分分析圖

圖2 群體結(jié)構(gòu)NJ-Tree 圖

2.3 GWAS 分析 采用rMVP 軟件分別對TNB、NBA和NHP 進(jìn)行GWAS 分析，檢測影響繁殖性能的顯著SNPs 位點(diǎn)，基因組水平顯著的閾值為1.21×10，染色體顯著水平為2.42×10，見圖3。結(jié)果表明，對于TNB 性狀，共有3 個(gè)顯著的標(biāo)記，分別位于3 號染色體10 004 418 bp、13 號染色體88 261 322 bp 和13 號染色體8 889 672 bp。對于NBA，顯著的標(biāo)記共有4 個(gè)，分別位于13 號染色體和X 染色體上，其中13 號染色體上有2 個(gè)位點(diǎn)與TNB 位點(diǎn)相同，另一位點(diǎn)位于84 631 745 bp處，X 染色體上的顯著位點(diǎn)位于7 643 578 bp 處。NHP相關(guān)的SNPs 共有18 個(gè)，其中1 號染色體上1 個(gè)，位于16 919 223 bp 處，其余均位于13 號染色體上，集中在84.5～85.6 Mb 之間。QQ 圖也表明模型擬合程度較好，3 個(gè)產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)性狀均有顯著SNPs 位點(diǎn)呈現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)。

圖3 繁殖性狀GWAS 分析曼哈頓圖和QQ 圖

進(jìn)一步對上述顯著位點(diǎn)上下游200 kb 的區(qū)域內(nèi)挖掘繁殖性狀相關(guān)候選基因，結(jié)果如表2 所示?？梢?，1 號染色體上與NHP 有關(guān)的位點(diǎn)附近包含基因；3 號染色體上與TNB 有關(guān)的位點(diǎn)附近包含基因；13 號染色體上與繁殖性狀相關(guān)的區(qū)域包含等17 個(gè)候選基因。以上基因中等基因均被報(bào)道與繁殖性狀相關(guān)。

表2 繁殖性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析顯著位點(diǎn)信息

3 討 論

繁殖性能是養(yǎng)豬業(yè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀，為了提升母豬繁殖性能，挖掘繁殖性狀相關(guān)候選基因和分子標(biāo)記，本研究收集1 100 頭純種大白豬的繁殖記錄，利用“中芯一號”芯片進(jìn)行基因分型，并分別對總TNB、NBA 和NHP 性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。

通過對繁殖性狀和相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，1 100 窩母豬的與配公豬共計(jì)19 頭，廣義線性模型和鄧肯多重比較的結(jié)果表明，不同與配公豬的繁殖性狀存在顯著差異，以TNB 性狀為例，與配公豬Y206402 相關(guān)的窩中，TNB 均值僅為10.45 頭，低于群體均值13.13 頭，因此GWAS 分析模型中考慮將與配公豬作為固定效應(yīng)。通過對群體進(jìn)行PCA 分析，結(jié)果表明少數(shù)個(gè)體存在分層，結(jié)合系譜信息和鄰接樹信息發(fā)現(xiàn)分層個(gè)體與血統(tǒng)相關(guān)，因此為了提高GWAS 分析的準(zhǔn)確性，考慮將前3 個(gè)主成分作為固定效應(yīng)加入關(guān)聯(lián)分析模型中。

通過關(guān)聯(lián)分析，鑒別到包括在內(nèi)的6個(gè)繁殖性狀相關(guān)候選基因，其中編碼雌激素受體基因1，是豬產(chǎn)仔數(shù)的主效基因之一，大量研究表明基因與不同品種豬的繁殖性狀相關(guān)?；蚴蔷幋a豬透明帶的一種重要的硫酸化糖蛋白，在精卵識別和結(jié)合的過程中發(fā)揮重要的作用，在豬中的相關(guān)研究表明ZP3 與透明帶粘粘蛋白的結(jié)合具有重要的生物學(xué)意義，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果也表明，該基因與繁殖性狀相關(guān)。基因全稱酪氨酸3 單加氧酶/色氨酸5 單加氧酶激活蛋白、肽，與癲癇等疾病相關(guān)，有報(bào)道指出，在該基因在豬卵巢從卵泡期到黃體期的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，因此可能是母豬卵巢發(fā)育相關(guān)的重要分子標(biāo)記。編碼熱休克27 kDa 蛋白1，主要參與細(xì)胞凋亡等多種免疫過程，研究表明初生時(shí)體重較輕的仔豬該基因表達(dá)量低于同窩較重的仔豬，因此基因可能與初生重性狀相關(guān)，可作為繁殖性狀的候選基因之一?；蚓幋a蘋果酸脫氫酶2，在大量動物的研究中表明在可育精子中均呈現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，可能是生育能力的重要生物標(biāo)記?；蚓幋a丙酰輔酶A 羧化酶的肽，大量報(bào)道與丙酸血癥有關(guān)，在牛的繁殖性狀相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)該基因與牛的妊娠率和生育率都有顯著的關(guān)聯(lián)，因此基因也可能作為繁殖性狀的分子標(biāo)記。

此外，基因編碼視黃醇結(jié)合蛋白1，是維生素A 代謝和維甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)因子，在針對非洲爪蟾的研究中發(fā)現(xiàn)該基因?qū)ι窠?jīng)組織的發(fā)育至關(guān)重要，本研究發(fā)現(xiàn)該基因與NHP 性狀有關(guān)?；蚓幋a基質(zhì)抗原1，參與細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂等多種生物學(xué)過程，研究表明與該基因同一家族的基因與人類的原發(fā)性卵巢功能不全有關(guān)，本研究結(jié)果表明基因可能與NBA 和NHP 有關(guān)，因此可能作為潛在的繁殖性狀相關(guān)候選基因。

4 結(jié) 論

本研究通過“中芯一號”芯片檢測1 100 頭經(jīng)產(chǎn)大白豬，并對繁殖性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測到22 個(gè)顯著的SNPs，根據(jù)上下游的基因和注釋篩選了包括和等重要基因可作為大白豬繁殖性狀相關(guān)候選基因，為后續(xù)通過基因組育種技術(shù)提高大白豬繁殖性能提供了遺傳基礎(chǔ)。