謝穎瑜，曹嘉程，宋紅兵，王 靜，吳艷玲，肖天放，林瑞意

（福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福建福州 350002）

豬體細胞核移植技術(shù)對豬遺傳改良、種質(zhì)資源保護及生物醫(yī)學(xué)研究等具有重要意義。然而，豬克隆胚胎發(fā)育效率低下，其主要原因之一是體細胞核重編程異常，這與表觀遺傳修飾密不可分。DNA 甲基化作為一種常見的表觀遺傳修飾，對哺乳動物的胚胎發(fā)育至關(guān)重要。供體細胞DNA 甲基化狀態(tài)不完全重編程是影響克隆胚胎成功率的主要原因之一，使用高度甲基化的體細胞作為核供體，會降低克隆效率。研究發(fā)現(xiàn)，抑制DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的活性是一種有效可行的方法。因此，許多DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（DNMTis）被研究并應(yīng)用于降低供體細胞的DNA 甲基化水平，提高克隆胚胎的成功率，如5-aza-dC、RG108、毛殼素、Zebularine等。S-腺苷高半胱氨酸（SAH）是一種無毒的DNMTi，研究表明，SAH 處理供體細胞可降低細胞的DNA 甲基化水平，提高供體核的重編程效率，促進克隆胚胎的早期發(fā)育，但其對豬供體細胞的最佳作用濃度與時間尚不清楚，缺乏SAH 對豬體細胞核移植效率的影響研究。本實驗以豬成纖維細胞為供體細胞，通過使用不同濃度的SAH 處理豬成纖維細胞，檢測其對細胞活力、周期、凋亡和甲基化水平等的影響，從而篩選SAH 的最佳作用濃度與時間，為后期探究SAH 對豬體細胞核移植的影響奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗所用成纖維細胞分離自官莊花豬保種場4 周齡母豬的耳組織。

1.1.1 主要試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基、膠原酶、胰酶、雙抗青鏈霉素、PBS 緩沖液、FBS 胎牛血清（美國Hyclone 公司）；無血清凍存液（蘇州新賽美生物科技有限公司）；CCK8 試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒（上海百賽生物技術(shù)股份有限公司）；DAPI、BSA 封閉液、Triton X-100（北京索萊寶科技有限公司）；多聚甲醛（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；抗體通用稀釋液、Alex Flour488 標記山羊抗兔IgG（H+L）、兔抗人Vimentin 抗體（杭州華安生物技術(shù)有限公司）；MethylFlashGlobal DNA Methylation (5-mC) ELISA Easy Kit（武漢艾美捷科技有限公司）；SAH（美國MedChemexpress 生物科技公司）；總RNA 提取試劑盒（北京天漠科技開發(fā)有限公司）；Vazyme R223-01 合成試劑盒（南京諾維贊生物技術(shù)有限公司）；HieffTM qPCR SYBRGreen Master Mix（Low Rox Plus）（翊圣生物科技上海有限公司）；DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。

1.1.2 溶液配制 完全培養(yǎng)液的配制：44 mL DMEM高糖培養(yǎng)基+5 mL FBS 胎牛血清+1 mL 雙抗青鏈霉素；SAH 儲備液的配制：10 mg SAH 粉末+2.6014 mL DMSO，配置成10 mmol/L 的SAH 儲備液，分裝置于-80℃專用冰箱中冷凍保存。

1.1.3 實驗設(shè)計 以0 mmol/L SAH 為對照組，每組3個重復(fù)，實驗包括3 個部分，第1 部分：分別使用不同濃度的SAH（0、0.01、0.1、0.5、1 mmol/L）處理豬成纖維細胞12、24、48、72 h，對處理后各組的細胞活力進行檢測，篩選SAH 的最佳作用時間。第2 部分：根據(jù)細胞活力的檢測結(jié)果，使用不同濃度的SAH（0、0.01、0.1、0.5、1 mmol/L）處理豬成纖維細胞24 h，檢測細胞形態(tài)、周期、凋亡及DNA 甲基化水平的變化，篩選SAH 的最佳作用濃度；第3 部分：根據(jù)前文實驗結(jié)果，以0.1 mmol/L SAH 處理豬成纖維細胞24 h 為實驗組，通過qRT-PCR 比較對照組與實驗組中相關(guān)基因表達的差異。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代成纖維細胞的分離與培養(yǎng) 耳組織刮毛清洗干凈后置于無菌環(huán)境中，使用眼科剪將耳組織剪碎成1 mm大小，轉(zhuǎn)移至5 mL 離心管中，加入2 mL 膠原酶充分混勻，置于搖床中，37℃、220 rpm 消化2～4 h，加入完全培養(yǎng)基終止消化。1 000 rpm 離心3 min，棄上清，加入4 mL 完全培養(yǎng)基吹打混勻，轉(zhuǎn)移至T-25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每2 d 更換一次培養(yǎng)液。

1.2.2 成纖維細胞的傳代培養(yǎng) 當(dāng)細胞生長匯合至80%～90%，吸棄原培養(yǎng)液，加入適量PBS 清洗2 次；加入2 mL 胰酶消化1 min 左右，置于倒置顯微鏡（Nikon，TS100）下觀察，若細胞開始回縮變圓，則終止消化并輕輕反復(fù)沖洗瓶底，使細胞脫落下來；移入5 mL 離心管中，1 000 rpm 離心3 min，棄上清，加入3 mL 完全培養(yǎng)液吹打重懸細胞，按1:3 的比例進行分瓶，后置于CO培養(yǎng)箱（賽默飛，Midi40 CO培養(yǎng)箱）中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 成纖維細胞的凍存與復(fù)蘇 消化離心步驟同1.2.2，棄上清，加入1 mL 無血清凍存液吹打重懸細胞，轉(zhuǎn)移至2 mL 凍存管后，梯度降溫保存至-80℃冰箱中過夜后移入液氮罐中。取出凍存管，迅速放入37～39℃恒溫水浴鍋中解凍1～2 min，同時，輕輕晃動凍存管，至凍存液完全融化；將解凍后的細胞融液轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，1 000 rpm 離心3 min；棄上清，加入2 mL完全培養(yǎng)液后輕輕吹打重懸細胞，吸取細胞懸液至T-25培養(yǎng)瓶中；加入3 mL 完全培養(yǎng)液，吹打混勻后放入CO培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每2 d 更換一次培養(yǎng)液。

1.2.4 成纖維細胞純度檢測 成纖維細胞屬于間充質(zhì)細胞，常使用Vimentin 細胞免疫熒光染色檢測成纖維細胞純度。將第4 代成纖維細胞鋪至六孔細胞板（2×10/孔），待細胞貼壁生長匯合至70% 左右時，吸棄原培養(yǎng)基，加入PBS 重復(fù)清洗2 次；每孔中加入1 mL 4% 多聚甲醛溶液，室溫固定20 min，使用PBS 洗滌細胞3 次；加入1 mL 0.5% TritonX-100 孵育15 min，PBS 洗滌3次；加1 mL 10%山羊血清室溫封閉2 h，PBST 洗滌2次；加入1 mL 專用型抗體稀釋液稀釋的兔抗人Vimentin 抗體（1:200），室溫孵育1 h，PBST 洗滌3 次；加入1 mL DAPI 復(fù)染5 min，PBST 洗滌3 次后，避光保存，熒光顯微鏡（Nikon，Ts2R-FL 倒置熒光顯微鏡）下觀察細胞形態(tài)并計數(shù)Vimentin 陽性細胞。

1.2.5 細胞活力檢測 當(dāng)?shù)? 代成纖維細胞生長匯合至80%～90%進行胰酶消化，消化完成的細胞制成懸液后接種于96 孔板中（100 μL/孔，細胞數(shù)量約為6 000 個）；放入CO培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h；使用不同濃度的SAH處理供體細胞；加入10 μL CCK8 溶液，置于培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，使用酶標儀（賽默飛，MK3 型酶標儀）在450 nm 波長下測定CCK8 的吸光度值。

1.2.6 細胞周期檢測 參照百賽生物細胞周期檢測試劑盒說明書進行細胞周期檢測樣品制備，24 h 內(nèi)完成流式檢測。

1.2.7 細胞凋亡檢測 參照百賽生物細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行細胞凋亡檢測樣品制備，2 h 內(nèi)通過流式細胞儀（BD AccuriC6 Plus 個人型流式細胞儀）檢測細胞凋亡情況。

1.2.8 細胞整體DNA 甲基化水平檢測 ①DNA 的提取：按照DNA 提取試劑盒操作說明書進行DNA 提取，使用NanoDrop分光光度計（賽默飛NanoDrop分光光度計）檢測DNA 純度和濃度；②整體DNA 甲基化水平檢測：用5-mC ELISA Kit 檢測各組的DNA整體甲基化水平，每組設(shè)3 個復(fù)孔，每孔加入100 ng DNA 樣品，在酶標儀450 nm 波長下測定其吸光度。

1.2.9 細胞相關(guān)基因表達 ①細胞中總RNA 的提?。哼\用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA 的完整性，并使用NanoDrop分光光度計測定總RNA 的濃度和純度；②引物設(shè)計：采用NCBI 在線軟件進行實時熒光定量PCR 引物設(shè)計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1；③cDNA 合成：反應(yīng)條件依次為37℃2 min；55℃5 min；85℃5 min，反應(yīng)體系為：RNA Template 5 μL，MonScrip5*RTIII AII-in-One mix 4 μL，MonScriptTMdsDNase 1 μL，Nuclease-Free Water 10 μL；④qRT-PCR 檢測：反應(yīng)體系為：cDNA 4 μL，HieffqPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，F(xiàn)orward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，RNase-free ddHO 5.2 μL；反應(yīng)條件為：第1 階段預(yù)變性95℃5 min；第2 階段循環(huán)反應(yīng)95℃10 s 與60℃30 s，進行40 個循環(huán)；第3 階段溶解曲線階段使用儀器（Lightcycler 480）默認設(shè)置，依照2計算相關(guān)基因表達量。

表1 qRT-PCR 引物

1.3 統(tǒng)計分析 使用Modfit LT 進行細胞周期分析，F(xiàn)lowJo_V10 進行細胞凋亡分析，SPSS 軟件（21.0 版）進行統(tǒng)計學(xué)分析，GraphPad Prism 8.0.2 進行繪圖，實驗結(jié)果以“平均值±標準差”的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 豬成纖維細胞的純度檢測 成纖維細胞傳代培養(yǎng)至第4 代時鋪6 孔板，待生長匯合至70% 左右，進行Vimentin 免疫熒光化學(xué)染色，在熒光顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)Vimentin 陽性細胞發(fā)出綠色熒光（圖1），同時DAPI 染色計算總細胞數(shù)，算出Vimentin 陽性細胞率>95%，說明第5 代成纖維細胞純度較高，可用于進行后續(xù)實驗。

圖1 豬成纖維細胞純度檢測結(jié)果

2.2 SAH 對豬成纖維細胞活力的影響 從不同濃度SAH 處理不同時間對豬成纖維細胞活力的影響可知（圖2），細胞活力隨著SAH 作用時間的增加而逐漸降低，作用時間越長細胞活力下降愈明顯。12 h，各組的細胞活力無顯著差異；24 h，與對照組相比，0.01 mmol/L及0.1 mmol/L SAH 處理對細胞活力無明顯影響，但0.5 mmol/L 和1 mmol/L SAH 處理會導(dǎo)致細胞活力極顯著下降；48 h 和72 h，各實驗組呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著處理濃度的增加，細胞活力顯著降低。

圖2 SAH 對細胞活力的影響

2.3 SAH 對豬成纖維細胞形態(tài)學(xué)的影響 從不同濃度SAH 處理成纖維細胞24 h 對細胞形態(tài)學(xué)的影響可知（圖3），與對照組相比，0.01 mmol/L 與0.1 mmol/L SAH 處理后細胞能正常生長，形態(tài)學(xué)無明顯變化，但0.5 mmol/L 和1 mmol/L SAH 處理成纖維細胞會使細胞拉伸變長，并離壁懸浮，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。

圖3 SAH 對細胞生長的影響

2.4 SAH 對豬成纖維細胞周期的影響 依據(jù)細胞內(nèi)DNA 含量，可將細胞分為3 個時期：G0/G1 期、S 期、G2/M 期，經(jīng)PI 染色后，根據(jù)熒光強度可將處于不同細胞周期中的細胞區(qū)分開來，從而判斷細胞所處的周期，結(jié)果如圖4 與圖5 所示?？梢姡c對照組（0 mmol/L）相比，0.1 mmol/L SAH 處理可顯著提高細胞中G0/G1期的占比；不同濃度SAH 處理后細胞中G2/M 期的占比均顯著高于對照組；當(dāng)SAH 作用濃度≥0.1 mmol/L時，細胞中S 期的占比顯著低于對照組。由此可見，添加濃度為0.1 mmol/L 的SAH 處理豬成纖維細胞24 h可誘導(dǎo)細胞阻滯在G0/G1 期和G2/M 期。

圖4 SAH 對細胞周期圖譜的影響

圖5 SAH 對細胞周期分布的影響

2.5 SAH 對豬成纖維細胞凋亡的影響 使用不同濃度的SAH 處理豬成纖維細胞24 h，經(jīng)流式細胞儀檢測，結(jié)果如圖6 與圖7 所示?？梢?，0.01 mmol/L 和0.1 mmol/L 處理組的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率與對照組（0 mmol/L）相比，均無顯著變化，但0.5 mmol/L 和1 mmol/L SAH 處理后，細胞早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著提高。

圖6 SAH 對細胞凋亡圖譜的影響

圖7 SAH 對細胞凋亡的影響

2.6 SAH 對豬成纖維細胞整體DNA 甲基化水平的影響 從不同濃度SAH 處理24 h 后對豬成纖維細胞整體DNA 甲基化水平的影響可知（圖8-a），與對照組相比，SAH 處理可極顯著降低細胞整體DNA 甲基化水平，SAH 作用濃度越高，下降越明顯。

2.7 SAH 對成纖維細胞相關(guān)基因表達的影響 對0.1 mmol/L SAH 處理24 h 后的豬成纖維細胞進行相關(guān)基因表達分析可知（圖8-b），與對照組相比，0.1 mmol/L SAH 處理24 h 可顯著上調(diào)和的表達，同時使的表達極顯著降低，但對和的表達無顯著影響。

圖8 SAH 對細胞整體甲基化水平及相關(guān)基因表達的影響

3 討 論

3.1 SAH 處理對豬成纖維細胞周期的影響 SAH 是一種非細胞毒性的DNMTi，在體細胞核移植前使用SAH 處理供體細胞可以顯著抑制DNMTs 的活性，促進克隆牛胚胎的體外發(fā)育。本研究結(jié)果表明，使用0.1 mmol/L SAH 處理豬成纖維細胞24 h 可將成纖維細胞阻滯在G0/G1 期，并顯著提高細胞中基因和基因的相對表達量。研究表明，增強和的表達可誘導(dǎo)細胞周期阻滯在GO/G1 期，而使用或的siRNA 轉(zhuǎn)染細胞，會導(dǎo)致和表達下調(diào)，同時誘導(dǎo)細胞G0/G1 期阻滯減弱。使用G0/G1 期阻滯的供體細胞進行體細胞核移植可提高克隆效率，供體細胞G0/G1 期的染色質(zhì)被認為是影響克隆胚胎發(fā)育的最有效因素之一。有報道稱，供體細胞周期同步化在G0/G1 期對胚胎發(fā)育至關(guān)重要，在克隆胚胎移植到代孕母體后，可以提高其存活率。

3.2 SAH 處理對豬成纖維細胞增殖和凋亡的影響 細胞增殖是細胞生命活動的重要特征，是生物繁育的基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)各實驗組呈現(xiàn)時間和劑量依賴性，隨著SAH 作用時間和濃度的增加，成纖維細胞生長增殖受到抑制，細胞活力逐漸下降。該實驗結(jié)果與王文璐的研究結(jié)論相似，高濃度的小分子化合物作用于供體細胞可導(dǎo)致細胞DNA 的損傷，激活相關(guān)凋亡基因的表達，抑制細胞生長，降低細胞增殖活力。

凋亡的發(fā)生受促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白共同調(diào)控，二者比例決定了細胞對凋亡信號的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，使用DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理供體細胞，可增加細胞對凋亡信號的敏感度，且DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑對供體細胞凋亡的影響具有累加效應(yīng)。本研究結(jié)果表明，使用0.5 mmol/L 和1 mmol/L SAH處理豬成纖維細胞24 h 會導(dǎo)致細胞出現(xiàn)大量凋亡，但0.1 mmol/L SAH 處理豬成纖維細胞24 h 對細胞凋亡率及凋亡相關(guān)基因（）表達無明顯影響。SAH作為一種DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可降低細胞中基因的表達，促使細胞對凋亡過程敏感。基因?qū)儆贐CL2 蛋白家族，其編碼的Bcl-xL蛋白被歸類為凋亡抑制劑，通過阻斷電壓依賴性陰離子通道（VDAC），從而阻止細胞色素c1 的釋放。

3.3 SAH 處理對豬成纖維細胞DNA 甲基化水平的影響 DNA 甲基化是一種重要的表觀遺傳標記，與染色質(zhì)的狀態(tài)密切相關(guān)，可抑制基因的活性。SAH 作為一種DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，通過與DNMTs 結(jié)合從而抑制其催化作用，調(diào)節(jié)生物體轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，SAH 處理豬成纖維細胞24 h可降低細胞整體DNA 甲基化水平和DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因的表達。該結(jié)果與Schumann 等人的研究結(jié)果一致，SAH 處理可降低基因的表達水平。主要以復(fù)制依賴的方式維持體細胞中的甲基化模式，而和可在DNA 上建立新的甲基化模式。其中，是早期發(fā)育過程中關(guān)鍵的從頭DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，對染色體和基因組結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。有研究表明，體細胞中的一種特定亞型會阻礙合子基因組激活和基因組甲基化重編程，導(dǎo)致克隆胚胎發(fā)育停止，而敲除可有效激活胚胎發(fā)育所需基因的表達，提高克隆效率。

SAH 處理成纖維細胞可在不影響細胞正常生長增殖和形態(tài)的基礎(chǔ)上，降低DNMT 轉(zhuǎn)錄水平和整體DNA甲基化水平，說明SAH 具有誘導(dǎo)成纖維細胞進入低分化狀態(tài)、改善克隆效率的潛能。

4 結(jié) 論

0.1mmol/L SAH 處理豬成纖維細胞24 h 可降低細胞整體DNA 甲基化水平和DNMT 相關(guān)基因的表達，對細胞損傷較小，且可提高細胞中周期調(diào)控關(guān)鍵基因的表達，將細胞阻滯在G0/G1 期，適合用于開展后續(xù)的豬體細胞核移植研究。