鮑 菊，張 恬，郭 楊，劉洪亮，高 一，張 琪，張志彬，劉慶雨，李兆華，李 娜*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130000；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心道地藥材國家重點試驗室培育基地；北京 100700；3.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林省延邊朝鮮自治州 133002；4.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林公主嶺 136100）

發(fā)酵中草藥（Fermented Chinese Herbal Medicine，F(xiàn)CHM）是利用微生物在適宜的環(huán)境下通過自身生長代謝和生命活動將中藥大分子轉(zhuǎn)化為能被腸道吸收的小分子物質(zhì)，還能將中草藥中的活性物質(zhì)如多糖、生物堿、皂苷等分解出來。發(fā)酵后的中草藥具有調(diào)節(jié)腸道微生物群落，提高生物活性成分含量、降低副作用及產(chǎn)生新的有效成分等多種功效。車前子中的黃酮類化合物、三萜類化合物、多糖類成分（含車前子膠）、生物堿等化合物對機體抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等具有一定的藥理作用；人參莖葉含有人參皂苷、多糖類、有機酸等成分，對機體抗氧化、促生長具有顯著作用；五味子中含有木脂素類（含五味子乙素）、揮發(fā)油、多糖類等成分，具有抗氧化和提高免疫力等藥理作用，發(fā)酵后的五味子抑菌能力增強，木脂素含量增加；山麥冬含有黃酮、皂苷和多糖等，具有降血糖、抗氧化和抗炎等多種藥理作用。FCHM 作為一種飼料添加劑，具有綠色、安全、無殘留等優(yōu)點，是替代抗生素的不二選擇。本試驗采用乳酸菌（Lactobacillus）發(fā)酵上述4 種中草藥，研究FCHM 對斷奶仔豬抗應(yīng)激、抗氧化、提高免疫力的影響，為FCHM 在斷奶仔豬斷奶應(yīng)激及提高免疫力等多方面提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 將車前子、五味子、人參莖葉及山麥冬按照一定比例混合，加入乳酸菌（添加量為10CFU/g）和40 mL 水在37℃下發(fā)酵48 h 后，烘干粉碎，密封保存。

1.2 試驗設(shè)計及試驗日糧 選用54 頭日齡在（35.00±1.00）d，體重為（22.32±0.15）kg，體況良好的松遼黑豬的斷奶仔豬，采用完全隨機試驗設(shè)計，按照體重與性別分為3 個處理組，每個處理3 個重復(fù)（n=3），每個重復(fù)組里6 頭豬。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧；0.5% 發(fā)酵中草藥組飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.5%發(fā)酵中草藥；0.5%不發(fā)酵中草藥組飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.5% 不發(fā)酵中草藥。試驗仔豬統(tǒng)一管理，自由采食和飲水，按照養(yǎng)殖場正常程序進行免疫和管理。試驗期共35 d，其中預(yù)試驗5 d，正式試驗30 d。試驗期飼糧由禾豐牧業(yè)有限公司提供，基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 樣品采集 第34 天對仔豬進行12 h 斷食，各組隨機選取 6 頭，用采血針在斷奶仔豬的頸靜脈抽取 10 mL血液，5 mL 血液收集至抗凝管中，5 mL 血液收集至非抗凝管中。此后，將所有非抗凝采血管，靜置15 min 后，離心（3500 r/min，15 min），取上清液于離心管中，保存至-20℃下備用。

1.4 生長性能指標(biāo)測定 正式試驗第1 天和第30 天，對所有試驗仔豬進行空腹稱重，記錄初始體重（IW）和末重（FW）。每日記錄各組添加和剩余的飼料量，計算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。

平均日增重=（末重-初始體重）/試驗天數(shù)

平均日采食量=（總添加量-總剩余量）/試驗天數(shù)

料重比=平均日采食量/平均日增重

1.5 測定指標(biāo)及方法 血清生長激素包括生長激素（GH）、胰島素（INS）、胰島素生長因子-1（IGF-1）、生長抑素（GHRIH）、三碘甲腺原氨酸（T3）和四碘甲腺原氨酸（T4），采用雙抗體夾心法測定，試劑盒為上海泛柯實業(yè)有限公司產(chǎn)品。血清抗應(yīng)激激素為皮質(zhì)醇（COR）和促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）采用雙抗體夾心法測定，試劑盒來源于上海泛柯實業(yè)有限公司產(chǎn)品，肌酸激酶（CK）采用磷酸肌酸底物法測定，試劑盒來源于中生北控生物科技有限公司產(chǎn)品。血清生化指標(biāo)包括總蛋白（TP）采用雙縮脲法測定、白蛋白（ALB）采用溴甲酚綠法測定、GLB 球蛋白（GLB）=TP-ALB、尿素氮（BUN）采用脲酶法測定、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）采用天門冬氨酸底物法測定、谷丙轉(zhuǎn)氨（ALT）采用丙氨酸底物法測定、堿性磷酸酶（ALP）采用NPP底物-AMP 緩沖液法測定、總膽固醇（TC）采用CODPAP 法測定、甘油三脂（TG）采用GPO-PAP 法測定、高密度脂蛋白（HDL）采用直接法-過氧化氫酶清除法測定、低密度脂蛋白（LDL）采用直接法-表面活性劑清除法測定，試劑盒均來源于中生北控生物科技有限公司產(chǎn)品，極低密度脂蛋白（vLDL）采用雙抗體夾心法測定，試劑盒來源于上海泛柯實業(yè)有限公司產(chǎn)品。血清抗氧化指標(biāo)包括超氧化物歧化酶（SOD）采用羥胺法測定、過氧化氫酶（CAT）采用鉬酸銨法測定、總抗氧化能（T-AOC）采用ABTS 法測定、丙二醛（MDA）采用TAB 法測定、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）采用比色法測定，試劑盒均來源于南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。血清免疫指標(biāo)包括免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白E（IgE）、免疫球蛋白（G2a）、免疫球蛋白（G2b）、白細胞介素4（IL-4）、R-干擾素（IFN-r）、補體C3、補體C4，采用雙抗原夾心法測定，試劑盒均來源于上海泛柯實業(yè)有限公司產(chǎn)品。以上指標(biāo)測定均在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜產(chǎn)品及飼料品質(zhì)實驗室測定。血清測定用半自動生化分析儀（北京普朗新科技有限公司產(chǎn)PUS-2018）和酶標(biāo)儀（賽默飛產(chǎn)Multiskan FC）測定。

1.6 統(tǒng)計分析 采用Excel 2016 整理試驗相關(guān)數(shù)據(jù)，且采用 IBM SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件處理試驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準差表示，采用Duncan's 和LSD 法進行多重比較，<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬生長性能影響 與對照組相比，0.5%發(fā)酵中草藥組和0.5%不發(fā)酵中草藥組的斷奶仔豬FW 分別提高2.6% 和2.0%（>0.05），ADG 分別提高5.9% 和5.1%（<0.05），F(xiàn)/G 分別降低5.6%和4.9%（<0.05）。2 個試驗組的FW、ADG 和F/G無顯著差異，3 組的IW 和ADFI 無顯著差異。

2.2 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清生長激素指標(biāo)的影響 如表3 所示，與對照組相比，0.5% 發(fā)酵中草藥和0.5% 不發(fā)酵中草藥組的GH 分別提高29.4% 和17.8%（<0.05），GHRIH 含量分別降低18.3%和 11.0%。0.5%發(fā)酵中草藥組血清中的T3 和T4 含量較對照組分別提高16.7% 和13.5%（<0.05）；對 于GH 和GHRIHR在試驗組間無顯著性差異。與對照組相比，0.5% 發(fā)酵中草藥組INS 提高15.4%（<0.05），0.5% 不發(fā)酵中草藥組的INS 無顯著變化，IGF-1 含量在各組間無顯著差異。

表2 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬生長性能的影響

表3 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清生長激素指標(biāo)的影響

2.3 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清抗應(yīng)激相關(guān)激素的影響 如表4 所示，與對照組相比，0.5% 發(fā)酵中草藥組和0.5%不發(fā)酵中草藥組的的CK 分別減少4.5%和3.9%（<0.05），COR 含量分別減少6.0%和1.5%（<0.05），ACTH 含量分別減少5.6%和4.7%（<0.05），但上述3 個指標(biāo)在試驗組間無顯著性差異。

表4 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清抗應(yīng)激相關(guān)激素的影響

2.4 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響 如表5 所示，與對照組相比，0.5% 發(fā)酵中草藥組的TP 和ALB 含量分別提高17.6% 和22.6%（<0.05），0.5%不發(fā)酵中草藥組的TP 含量提高13.2%（<0.05），0.5%發(fā)酵中草藥組和0.5% 不發(fā)酵中草藥組的BUN 含量分別降低20.8% 和14.7%（<0.05），0.5% 發(fā)酵中草藥組的GLB 含量提高19.0%（<0.05），對于上述指標(biāo)試驗組間無顯著性差異；與對照組相比，對于ALB 和GLB 含量0.5%不發(fā)酵中草藥組差異不顯著。

表5 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清蛋白指標(biāo)的影響

由表6 可知，與對照組相比，0.5% 發(fā)酵中草藥組和0.5% 不發(fā)酵中草藥組的AST 含量分別提高8.0%和6.11%（<0.05），ALT 含量分別降低18.3% 和9.6%（<0.05），0.5%發(fā)酵中草藥組ALP 含量22.2%（<0.05）。AST 和ALT 在試驗組間無顯著性差異，但0.5%發(fā)酵中草藥組的ALP 含量低于與0.5%不發(fā)酵中草藥組（<0.05）。

表6 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清轉(zhuǎn)氨酶的影響 U/L

由表7 可知，與對照組相比，0.5% 發(fā)酵中草藥組和0.5% 不發(fā)酵中草藥組的HDL 含量分別提高16.6%和7.7%（<0.05），試驗組間無顯著差異。與對照組相比，0.5% 發(fā)酵中草藥組中的TC 含量降低17.4%（<0.05），0.5% 不發(fā)酵中草藥組與對照組無顯著性差異。各組間TG、LDL 和vLDL 無顯著性差異。

表7 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血脂指標(biāo)的影響 mmol/L

2.5 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響 由表8 可知，與對照組相比，0.5%發(fā)酵中草藥組的SOD、CAT、T-AOC 和GSH-Px 分別提高17.1%、10.6%、36.5%和15.2%（P <0.05），0.5%不發(fā)酵中草藥組中SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px 分別提高16.7%、9.5%、33.8%和18.8%（P <0.05），2 個試驗組間無顯著差異。與對照組相比，0.5% 發(fā)酵中草藥和0.5% 不發(fā)酵中草藥組的MDA 含量分別降低19.7%和15.6%（P <0.05），試驗組間無顯著差異。

表8 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.6 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響 如表9 所示，與對照組相比，0.5%發(fā)酵中草藥組與0.5%不發(fā)酵中草藥組的IgA 分別提高20.2%、12.0%，G2a 提高14.5%、9.5%（<0.05），0.5% 發(fā)酵中草藥組C3和IgM 提高9.6% 和19.4%（<0.05），上述指標(biāo)試驗組間無顯著性差異。各組間IgG、IgE、G2b、IL-4 和C4 含量無顯著性差異。

表9 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響 g/L

3 討 論

3.1 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬生長性能的影響 復(fù)方中草藥用益生菌發(fā)酵后可以提高飼料在動物體內(nèi)的利用率,促進營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，促進動物生長發(fā)育。韓乾杰等研究表明添加人參多糖的飼糧組仔豬的日增重顯著提高，仔豬的耗料增重比降低。羅杰發(fā)現(xiàn)經(jīng)過蟲草真菌發(fā)酵過的五味子藥渣可提高斷奶仔豬的增重率。上述研究結(jié)果與本試驗結(jié)果一致，原因可能是微生物將中藥復(fù)方中多糖、皂苷以及木質(zhì)素等化學(xué)成分釋放出來，提高了動物機體的表觀消化率，從而加快動物機體生長。

3.2 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清生長激素指標(biāo)的影響GH、INS 可加快生長、蛋白質(zhì)合成和影響脂肪代謝，IGF-1 與GH 協(xié)同作用促進生長，T3 和T4 可增強仔豬機體的基礎(chǔ)代謝率，GHRIH 可抑制促生長相關(guān)激素的分泌，影響胃腸道蛋白酶的生成和消化液活性。研究表明，五味子多糖可提高血清INS 水平，人參果膠具有延緩疲勞的效果。劉旭發(fā)現(xiàn)人參莖葉總皂苷降低血清中生長激素釋放激素GHRH 和GH 水平，上升血清中生長抑素SST 水平，且影響IGF-1/INS 通路介導(dǎo)的宮內(nèi)生長受限大鼠，還可促進T4、T3 的產(chǎn)生。本試驗中，試驗組GH 含量較對照組顯著提高，GHRIH含量顯著降低，0.5% 發(fā)酵中草藥組血清中的INS、T3和T4 含量顯著提高，原因可能是乳酸菌破壞了中草藥的細胞內(nèi)層及細胞壁，將人參果膠、人參莖葉總皂苷和五味子多糖等多種有效成分釋放出來，促進斷奶仔豬生長發(fā)育。

3.3 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清抗應(yīng)激相關(guān)激素的影響當(dāng)動物機體腎上腺素和 COR 大量產(chǎn)生或者長期處于較高水平時，生長發(fā)育、免疫會受到抑制，而ACTH 是COR 合成和分泌的最重要調(diào)節(jié)劑，因此，二者含量的變化可用作衡量動物免疫應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)。CK 能促進ATP 恢復(fù)，運動時細胞膜通透性增加，使得肌細胞內(nèi)的CK 進入血液，導(dǎo)致CK 含量升高，適量五味子多糖可促進CK 含量恢復(fù)。陳娟娟發(fā)現(xiàn)人參果膠可顯著降低力竭小鼠血清中MDA 含量以及CK 和乳酸脫氫酶的活性。肖燕等將人參、麥冬、五味子按照一定比例制成生脈制劑運用于小鼠，發(fā)現(xiàn)可以顯著提高小鼠的抗應(yīng)激反應(yīng)能力。本試驗中，中草藥能夠降低血清CK、ACTH 和COR 含量，說明可能是中草藥中的多糖、皂苷和有機酸等有效成分通過保護免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)及抗氧化等途徑從而提高仔豬抗應(yīng)激能力。

3.4 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響 動物機體的代謝和器官健康的狀況可通過血清生化指標(biāo)反映，其中TP 和ALB 含量可反映機體免疫力強弱，BUN 濃度可判斷飼糧中氨基酸均衡狀況；GLB 在一定程度上可反映機體抗體水平，ALT、ALP 和AST 是血清轉(zhuǎn)氨酶中最重要的幾種轉(zhuǎn)氨酶。血清中TC 和TG是動物體質(zhì)代謝的重要產(chǎn)物，HDL 主要合成部位是肝臟，其對血管具有保護防栓塞作用。曹阿芳等研究表明車前子多糖可顯著降低大鼠血清內(nèi) TC、AST、ALT 含量，車前子膠能降低喂飼高脂飼料大鼠的血清總TC、LDL-C 水平。Wang 等發(fā)現(xiàn)將五味子木脂素灌喂給經(jīng)50%酒精處理的雄性小鼠可增強肝細胞的抗氧化能力。劉雪梅等研究表明人參糖肽能夠降低大鼠血清甘油三酯、膽固醇等水平，具有明顯的降血脂作用。韓乾杰等研究表明，添加人參多糖組的ACP、ALB、IgA 與 IgM 均顯著高于飼喂基礎(chǔ)日糧組，而且顯著降低了 BUN 和 AST 含量。本試驗中，5% 發(fā)酵中草藥組TP、ALB 和HDL 含量顯著增加，血清中的BUN 含量降低，原因可能是乳酸菌發(fā)酵將車前子多糖、車前子膠、人參糖肽、人參莖葉多糖、五味子木脂素和五味子多糖等釋放出來，從而改善動物組織器官及其功能狀態(tài)，并增強斷奶仔豬機體免疫力。

3.5 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響 血清中的SOD 可加快自由基的歧化反應(yīng)，GSH-Px 可清除過氧化物，T-AOC 代表血清中氧化酶系統(tǒng)的活性，上述抗氧化酶共同作用可有效保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的相對完整性，是動物機體內(nèi)各項代謝活動及正常功能發(fā)揮的重要保障。王宇卿等發(fā)現(xiàn)由人參、麥冬、五味子制成的生脈散通過其糖類、氨基酸類大極性物質(zhì)和部分木脂素類成分實現(xiàn)直接抗氧化作用。另有研究表明，山麥冬總黃酮提取液也具有一定的抗氧化性及還原作用。李斌等研究表明五味子乙素對自由基的清除效果明顯，人參莖葉多糖對血清自由基也具有一定的清除能力。丘富安等研究表明車前子黃酮可顯著提高氧化應(yīng)激雞血清的T-AOC，提高SOD、GSH-Px 和CAT活性，并可以降低血清中MDA 濃度。上述研究結(jié)果與本試驗結(jié)果一致，原因可能是車前子中的多糖、五味子多糖、山麥冬總黃酮及木質(zhì)素等成分具有抗氧化活性,可清除機體內(nèi)的活性氧類物質(zhì)，特別是自由基,可防止體內(nèi)活性氧類物質(zhì)對細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，能使SOD 活性增加，提高了斷奶仔豬自由基的清除能力，最大程度上減小自由基對機體的傷害。

3.6 發(fā)酵中草藥對斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響 免疫球蛋白主要有IgA、IgG 和IgM，還包括IgE、IgG2a、IgG2b，它們可與抗原相結(jié)合，參與體液免疫，其含量直接反映機體免疫能力的強弱。補體C3 是具有酶活性的免疫球蛋白，IL-4 可協(xié)助體液免疫，IFN-主要由巨噬細胞及自然殺傷細胞產(chǎn)生，有利于機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的識別和清除。郭海林等研究表明短葶山麥冬皂甙可顯著延長小鼠存活時間,極顯著增加小鼠免疫器官胸腺、脾臟的重量，山麥冬多糖對免疫低下有缺陷的小鼠具有很好的保護作用。姚莉媛等研究表明人參復(fù)合多糖可顯著提高母豬泌乳IgA 和 IgG 的表達水平，與本試驗結(jié)果一致，原因可能是中草藥中所含的皂苷、多糖促進T 淋巴細胞的增殖與轉(zhuǎn)化，促進細胞因子的分泌，提高T 淋巴細胞的百分率，從而增強機體細胞免疫的功能，也促進T 淋巴細胞的分化與增殖、促進T 淋巴細胞IgM 抗體的產(chǎn)生與分泌，延緩抗體的下降，從而增強機體的體液免疫功能。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果顯示，F(xiàn)CHM 添加劑對仔豬血清指標(biāo)有調(diào)控作用，提高血清抗氧化活性、生化及血清機體免疫力，減少應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，提高免疫力。中草藥添加劑可以作為一種綠色安全的添加劑在斷奶仔豬生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。