劉浩域，郭建華，羅 蘭，韓先杰，于光輝*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.膠州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東青島 266300）

自2018 年以來，非洲豬瘟在全球多個(gè)國家相繼爆發(fā)，嚴(yán)重時(shí)可致豬群大規(guī)模死亡，開展豬育種工作極其困難。在面臨像非洲豬瘟這樣的烈性傳染病突襲時(shí)，豬冷凍精液技術(shù)可以保護(hù)群體的遺傳資源，迅速重新建立種質(zhì)資源。與鮮精相比，冷凍精液可以解決場間精液交流的生物安全問題、遠(yuǎn)程精液運(yùn)輸?shù)臅r(shí)效性問題、優(yōu)質(zhì)種公豬遺傳物質(zhì)的最大限度的利用、地方豬遺傳資源的靜態(tài)保存、夏季常溫精液質(zhì)量差等一系列常溫精液不能解決的問題，冷凍精液在提高種公豬利用率的同時(shí)還可以提高群體生產(chǎn)力，并且大大降低疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。但豬精子細(xì)胞膜中富含多不飽和脂肪酸，且抗氧化物質(zhì)含量相對(duì)較少，其質(zhì)膜成分也與其他動(dòng)物精子存在差異，因此，豬精子對(duì)活性氧（ROS）的反應(yīng)更為敏感。近年來研究表明，在豬精液冷凍過程中添加維生素E、白藜蘆醇、抗壞血酸等抗氧化物質(zhì)可在一定程度上能夠減少ROS 對(duì)豬精子的侵害，有效提高豬冷凍精液質(zhì)量。

蝦青素（Astaxanthin，AST）是一種天然的類胡蘿卜素，作為一種脂溶性的萜烯類不飽和化合物，蝦青素中的共軛烯烴結(jié)構(gòu)可以減少細(xì)胞中的單線態(tài)氧造成的氧化損傷并降低自由基的生成，有效增加抗氧化酶活性并降低DNA 氧化損傷。研究表明，添加蝦青素可以有效提高公羊和公牛精子液態(tài)保存的精子活力，對(duì)于豬精液的液態(tài)保存也起著很好的調(diào)控作用。目前，有關(guān)蝦青素在豬冷凍精液的保存效果方面研究較少，本實(shí)驗(yàn)擬在冷凍保存I 液中添加0.5 mmol/L 蝦青素（參考文獻(xiàn)推薦濃度），在冷凍過程中與豬精子平衡不同時(shí)間，探究添加蝦青素與豬精子平衡不同時(shí)間對(duì)冷凍保存效果的影響，以期為豬精液超低溫冷凍保存研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 低溫離心機(jī)（D-37520，Thermo）、液氮罐、恒溫箱、光學(xué)顯微鏡（CX21，Olympus，日本）、熒光顯微鏡（BX63，Olympus，日本）、pH 計(jì)（FE20-K，梅特勒）、酶標(biāo)儀（RZ-9618，天津瑞澤分析儀器有限公司）、Luminometer（GloMax 20/20，Promega）、熒光分光光度計(jì)（F98，上海棱光技術(shù)有限公司）、計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASAS-QH-III，西班牙）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、ATP 含量等檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；ROS、JC-1 等檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；蝦青素、SYBR Green I、PI 染液、AO 染色試劑盒、臺(tái)盼藍(lán)染液等購自索萊寶公司；OEP 購自德國米尼圖、封口粉和0.5 mL 凍精細(xì)管購自法國卡蘇；基礎(chǔ)稀釋液的藥品購自國藥集團(tuán)（分析純）。

1.3 稀釋液配制 將Modena 稀釋液做為基礎(chǔ)稀釋液：稱取葡萄糖2.75 g、檸檬酸三鈉0.69 g、檸檬酸0.29 g、碳酸氫鈉0.125 g、EDTA-2Na 0.235 g、Tris 0.565 g、青霉素鈉1 000 IU/mL、硫酸鏈霉素0.1 g，用滅菌超純水定容至100 mL，調(diào)整pH 為7.2，然后用0.22 μm 濾頭過濾后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。冷凍保存液（I 液）：11%的乳糖溶液80%、卵黃20%、2 mol/L 蝦青素，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＠鋬霰４嬉海↖I 液）：95.5%的II 液、3%甘油、1.5% OEP，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 精液的采集與處理

1.4.1 精液采集 采用手握法采集山東省平度市環(huán)山托佩克種豬場的10 頭杜洛克種公豬的中段精液。采精前確保種公豬具備體質(zhì)強(qiáng)健、性欲旺盛和品質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)。采精后初步進(jìn)行精液質(zhì)量評(píng)價(jià)，保證采集的精子活率達(dá)到80%～90% 以上且精子畸形率≤20%。將符合上述條件的精液經(jīng)4～5 層無菌紗布過濾，將過濾完成的精液混合均勻，以消除個(gè)體差異，再用基礎(chǔ)稀釋液與混勻好的精液1:1 比例混合均勻后置于17℃恒溫箱內(nèi)，并在2 h內(nèi)用17℃恒溫箱保存運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.4.2 精液降溫平衡 精液稀釋平衡為通用步驟操作，分為3 個(gè)階段進(jìn)行：第1 階段先使用恒溫箱保存的基礎(chǔ)稀釋液與精液1:1 比例混合均勻，再用預(yù)冷17℃的冷凍離心機(jī)800 ×g 離心10 min，棄上清液。第2 階段用冷凍保存I 液對(duì)棄上清的精子進(jìn)行1:1～1:2 稀釋，隨后將離心管用紗布包裹好置于4℃冰箱平衡約2 h（空白對(duì)照組），或者在冷凍保存I 液中添加0.5 mmol/L蝦青素，置于4℃冰箱分別平衡2、4、6、8、12 h（試驗(yàn)組）。第3 階段使用含甘油的冷凍保存II 液對(duì)已平衡降溫至4℃的精液進(jìn)行第2 次稀釋，精子計(jì)數(shù)并調(diào)整最終濃度為5×10個(gè)/mL，做好標(biāo)記后放入4℃冰箱平衡內(nèi)0.5 h，最大限度減少降溫對(duì)精子造成的損傷。

1.4.3 精液冷凍與解凍程序 精液冷凍：精液稀釋平衡通用步驟操作完成后，分別把樣品快速用口吸法灌裝進(jìn)0.5 mL 細(xì)管，再用封口粉封口并做好標(biāo)記。將細(xì)管平鋪在細(xì)管托架上并迅速放入泡沫箱內(nèi)進(jìn)行熏蒸，熏蒸時(shí)保證每根細(xì)管之間間隔0.5 cm，細(xì)管托架距液氮面高4 cm，蓋上泡沫箱蓋子熏蒸10 min 后迅速置于液氮中。按時(shí)間做好標(biāo)記后將細(xì)管分別裝進(jìn)拇指管內(nèi)，然后裝入無菌紗布袋中，最后將紗布袋置于液氮罐中保存。解凍時(shí)將細(xì)管從液氮罐中取出，置于37℃水浴鍋中解凍20 s后撈出用紙巾擦干細(xì)管表面水漬，剪開細(xì)管后與解凍液1:4 混勻，于37℃水浴孵育10 min 后進(jìn)行檢測。

1.5 檢測指標(biāo)與方法

1.5.1 精子運(yùn)動(dòng)參數(shù) 參照Zhu 等的方法，將精子樣品解凍后600 ×g 4℃離心3 min，棄上清，PBS 重復(fù)清洗3 次，再用PBS 重懸，吸取5 μL 精液涂抹于載玻片上并將載玻片置于分析儀預(yù)熱好的37℃操作孔內(nèi)，每組各取3 份樣品使用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）進(jìn)行精子活力檢測。運(yùn)動(dòng)參數(shù)包括曲線速度（VCL）、直線速度（VSL）、平均路徑速度（VAP）、直線性（LIN）即VSL/VCL；向前性（STR）即VSL/VAP；擺動(dòng)性（WOB）即VAP/VCL。

1.5.2 質(zhì)膜完整率和頂體完整率 根據(jù)Zhu 等的方法，使用SYBR-14/PI 染色和異硫氰酸酯-花生凝集素FITC-PNA 染色對(duì)精子質(zhì)膜完整性和頂體完整性進(jìn)行評(píng)估，樣品前處理同上，重懸后與染液充分混合，30 min后觀察并計(jì)數(shù)。每組各取3 份樣品在熒光顯微鏡下使用200×鏡頭計(jì)數(shù)，每組保證至少分析200 個(gè)精子。

精子質(zhì)膜完整率=質(zhì)膜完整的精子（綠色）/計(jì)數(shù)的總精子數(shù)×100%

精子頂體完整率=頂體完整的精子（綠色）/計(jì)數(shù)的總精子數(shù)×100%

1.5.3 線粒體膜電位 采用JC-1 熒光探針法檢測，JC-1作為理想熒光探針，準(zhǔn)確反映了線粒體低電位時(shí)發(fā)散綠色熒光；線粒體高電位時(shí)發(fā)散紅色熒光。樣品前處理同上，每組各取3 份樣品在光顯微鏡下使用200×鏡頭計(jì)數(shù)，每組保證至少分析200 個(gè)精子。

精子線粒體膜電位=發(fā)紅光的精子/發(fā)綠光的精子數(shù)×100%

1.5.4 DNA 完整性檢測 采用AO 熒光染色標(biāo)記法檢測，樣品前處理同上，通過AO 熒光染料與細(xì)胞結(jié)合可區(qū)別細(xì)胞的生存狀況。AO 可透過完整細(xì)胞膜，使細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色或綠色熒光，壞死細(xì)胞熒光減弱甚至消失。每組各取3 份樣品在熒光顯微鏡下使用200×鏡頭計(jì)數(shù)，每組保證至少分析200 個(gè)精子。

精子DNA 完整率=DNA 完整的精子/計(jì)數(shù)的總精子數(shù)×100%

1.5.5 ROS 水平檢測 采用DCFH-Da 熒光檢測法檢測，DCFH-DA 本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH 不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH 生成有熒光的DCF。樣品前處理同上，每組各取3 份樣品用熒光分光光度計(jì)檢測。

1.5.6 ATP 含量、MDA 水平以及SOD、GSH-Px 和CAT檢測 用相應(yīng)的測試劑盒進(jìn)行檢測，樣品前處理同上，每組各取3 份樣品，按照試劑盒操作說明進(jìn)行處理，然后使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)采用單次試驗(yàn)中設(shè)置組內(nèi)重復(fù)的方法，所有數(shù)據(jù)均采用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（LSD）采用 Duncan's 法進(jìn)行數(shù)據(jù)多重比較，結(jié)果均用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，<0.05 表示差異顯著，>0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 蝦青素平衡不同時(shí)間對(duì)豬精子冷凍-解凍后運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響 如表1 所示，平衡2、4、6、8、12 h 后，與空白對(duì)照組相比，平衡4、6、8、12 h 的VCL、LIN、WOB 均顯著提高，其中以平衡6 h 的效果最為顯著，平衡8 h 次之，而平衡2 h 的對(duì)于LIN、WOB作用效果不顯著。與空白對(duì)照組相比，只有平衡6 h 的VSL、VAP 顯著提高，其余平衡不同時(shí)間較對(duì)照組變化不顯著。與空白對(duì)照組相比，平衡4、6、8 h 組STR顯著提高，其中以平衡6 h 的試驗(yàn)組最為顯著，平衡4 h次之。相較于平衡不同時(shí)間而言，平衡6 h 的豬精子在解凍后各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)均顯著提高，平衡4、8 h 的對(duì)于部分運(yùn)動(dòng)參數(shù)來說也有一定提高，而平衡2 h 的對(duì)于各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)不提高反而會(huì)造成部分運(yùn)動(dòng)參數(shù)降低。

表1 蝦青素平衡不同時(shí)間對(duì)豬精子冷凍-解凍后運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響

2.2 蝦青素平衡不同時(shí)間對(duì)豬精子冷凍-解凍后質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位、DNA 完整率以及ROS 水平的影響 由表2 可知，與空白對(duì)照組相比，平衡4、6、8 h 的質(zhì)膜完整性顯著提高。與空白對(duì)照組相比，試驗(yàn)組頂體完整率均有顯著提高，其中平衡6 h的效果最顯著，提高12.69%（<0.05），平衡4、8 h組次之，分別提高8.39%、8.44%。與空白對(duì)照組相比，除平衡2 h 外，其他試驗(yàn)組的線粒體膜電位、DNA 完整率均顯著提高，其中以平衡4、6 h 的效果最顯著，線粒體活性分別顯著提高11.75%、12.27%，DNA 完整率分別顯著提高6.84%、7.03%。與空白對(duì)照組相比，平衡2、12 h 的 ROS 水平顯著上升，其余組ROS 水平均顯著下降，其中平衡6 h 的效果最為顯著，降低12.24%。結(jié)果顯示，平衡4～8 h 對(duì)精子活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整性、線粒體膜電位、DNA 完整率均有顯著的提高作用，對(duì)于ROS 水平均具有顯著的降低作用。

表2 蝦青素平衡不同時(shí)間對(duì)豬精子冷凍-解凍后質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位、DNA 完整率以及ROS 水平的影響

2.3 蝦青素平衡不同時(shí)間對(duì)豬精子冷凍-解凍后ATP 含量、抗氧化機(jī)能的影響 由表3 可知，與空白對(duì)照組相比，平衡4、6 h 的ATP 含量顯著提高，平衡8、12 h的ATP 含量反而顯著降低。與空白對(duì)照組相比，除平衡2 h 的MDA 變化不顯著外，其余試驗(yàn)組均顯著降低，其中平衡6 h 的降低了4.74%（<0.05）。與空白對(duì)照組相比，SOD 酶的活性較對(duì)照組均顯著提高，其中平衡6 h 的效果最好，增加9.74%（。與空白對(duì)照組相比，平衡2、4、6 h 的GSH-Px 酶活性顯著提高，而CAT酶效果不顯著。平衡2、4、6 h 的SOD、CAT、GSHPx3 種抗氧化酶活性均顯著提高，平衡4、6 h 的ATP含量顯著提高，其余作用不太明顯，平衡6 h 的MDA水平下降最為顯著，下降4.74%。

表3 蝦青素平衡不同時(shí)間對(duì)豬精子冷凍-解凍后ATP 含量、抗氧化機(jī)能的影響

圖1 豬精液冷凍-解凍后質(zhì)膜完整率、頂體完整率、DNA 完整率、線粒體膜電位熒光顯微鏡圖

3 討 論

3.1 蝦青素平衡不同時(shí)間對(duì)豬精子冷凍-解凍后運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響 近年來，在冷凍精子制備過程中加入抗氧化劑以改善冷凍后精子質(zhì)量的研究越來越多，在人、雞、羊、牛上研究表明蝦青素可以有效提高精子質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)表明，與空白對(duì)照組相比，平衡6 h 的豬精子在解凍后各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)均提高顯著，平衡4、8 h的對(duì)于部分運(yùn)動(dòng)參數(shù)來說也具有一定提高的作用，而平衡2 h 的對(duì)于各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)提高作用不明顯反而會(huì)造成部分運(yùn)動(dòng)參數(shù)降低。在小型豬冷凍精子的研究中發(fā)現(xiàn)，添加500 μmol/L 的蝦青素精子活力和進(jìn)行性活動(dòng)精子數(shù)均顯著高于對(duì)照組，與本研究結(jié)果具有一定的相關(guān)一致性。

3.2 蝦青素平衡不同時(shí)間對(duì)豬精子冷凍-解凍后質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位、DNA 完整率以及ROS 水平的影響 精子低溫保存過程與氧化應(yīng)激和過量的ROS 產(chǎn)生有關(guān)。有研究表明，在冷凍稀釋液中添加2 μmol/L 蝦青素可抑制脂質(zhì)過氧化和調(diào)節(jié)精子膜的脂肪酸組成，改善解凍后的精子質(zhì)量。在冷凍稀釋液中添加1 μmol/L 蝦青素有利于提高狗精子凍融后的質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位以及DNA完整率等。陳海敏等研究得出，在冷凍稀釋液中添加蝦青素能有效減少核DNA 受損，質(zhì)膜和線粒體明顯受到保護(hù)。在關(guān)于心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，蝦青素可以減弱信號(hào)刺激從而減少ROS 水平的提高，對(duì)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。本研究中，蝦青素平衡4～8 h 對(duì)ROS 水平均具有顯著的降低作用，對(duì)精子活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整性、線粒體膜電位、DNA 完整率均有顯著的提高作用。

3.3 蝦青素平衡不同時(shí)間對(duì)豬精子冷凍-解凍后ATP 含量及抗氧化機(jī)能的影響 蝦青素作為一種有效的抗氧化劑，在冷凍精液過程中發(fā)揮重要作用。在冷凍稀釋液中添加25 mg/kg 的蝦青素，在保護(hù)公雞睪丸免受鎘誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激方面起到了有效的抗氧化劑作用。Liu 等證實(shí)蝦青素能有效提高大鼠的精子中的GSH-Px、CAT和SOD 活性，而MDA 含量顯著降低。Mansour 等研究表明在飼料中添加蝦青素可抑制精液中的脂質(zhì)過氧化。本研究中，平衡2～6 h 對(duì)SOD、CAT、GSH-Px3種抗氧化酶活性均顯著提高，平衡4～6 h 的ATP 含量顯著提高。

3.4 蝦青素平衡不同時(shí)間對(duì)豬精子冷凍-解凍的影響目前關(guān)于冷凍保存液中添加抗氧化物質(zhì)來減少氧化損傷方面的研究較多，并且也取得了較好的效果。但是添加物質(zhì)的作用時(shí)間方面研究甚少，本試驗(yàn)證明添加蝦青素后需要跟精子作用一段時(shí)間才能獲得較好的效果。陳世偉等研究發(fā)現(xiàn)，將雞精液與加有抗凍劑的稀釋液平衡不同時(shí)間，解凍后精子活力隨著平衡時(shí)間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。薛曉蓉等研究發(fā)現(xiàn)，將藏獒精液稀釋后平衡1、2、3.5 h，解凍后平衡2 h 組的各項(xiàng)質(zhì)量檢測數(shù)據(jù)最好。由于不同物質(zhì)分子量和理化性質(zhì)不同，對(duì)精子細(xì)胞膜的通透性不同，需要作用的時(shí)間也不一樣，本研究選用的蝦青素是一種類胡蘿卜素，具有脂溶性，不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，所以與豬精子作用6 h 效果較好。

4 結(jié) 論

綜上所述，冷凍保存I 液中添加0.5 mmol/L 蝦青素對(duì)豬冷凍精液保存具有良好的效果，其中以平衡6 h的效果最佳。盡管本試驗(yàn)對(duì)于豬冷凍精液的各項(xiàng)指標(biāo)檢測顯示，添加蝦青素對(duì)豬冷凍精液保存品質(zhì)具有良好的效果，但冷凍后的精液并未進(jìn)行人工授精檢驗(yàn)其是否真正可以提高受胎率，關(guān)于此方面的研究還需進(jìn)一步研究。