吳正明，龔紹榮，趙加鼎，邱丙姍，李再磊，程 娜，李文君，周戚斌，趙桂英*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南省保山市保山豬研究所，云南保山 678200）

保山豬屬于我國西南型地方豬種，是云南省較早認(rèn)證且保存較完善的一個(gè)地方優(yōu)良品種，其具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、對(duì)青綠飼料的利用能力較好、飼料的利用轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高等優(yōu)良特性。脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase，）基因，是一個(gè)復(fù)雜的多功能大分子聚合酶，分子量為270 kDa，通常以和2 種形式存在于生物體中。Munoz 等將豬的基因定位于12 號(hào)染色體。有研究證實(shí)，基因是一種基本的代謝酶類基因，在動(dòng)物脂肪合成代謝與貯存、脂肪沉積、膽固醇運(yùn)輸和調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡等過程中均發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平可對(duì)動(dòng)物體脂沉積有調(diào)控作用?；蛟趧?dòng)物組織中表達(dá)廣泛，宮強(qiáng)等研究表明基因在延邊黃牛和延黃牛的脂肪、肝臟、背最長肌等9 個(gè)組織中均有表達(dá)?；蛲ㄟ^調(diào)控脂肪生成從而對(duì)肉品質(zhì)產(chǎn)生影響。Lim 等以107 頭伯克希爾豬為研究對(duì)象，將其分為高肌內(nèi)脂肪組和低肌內(nèi)脂肪組，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選豬背最長肌肌內(nèi)脂肪相關(guān)的差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示基因的表達(dá)量在克希爾豬高肌內(nèi)脂肪組顯著高于低肌內(nèi)脂肪組，進(jìn)一步通過GO 功能富集分析表明，基因介導(dǎo)的脂肪代謝過程是導(dǎo)致肌內(nèi)脂肪含量差異的重要因素，說明基因表達(dá)量上調(diào)有助于肌內(nèi)脂肪的沉積，改善豬肉品質(zhì)。Grzes 等研究結(jié)果表明基因多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)豬脂肪酸沉積有顯著影響，說明基因可能是豬脂肪酸沉積相關(guān)的主效基因。目前關(guān)于基因的研究主要集中在牛、雞及外來豬種上，在國內(nèi)地方豬中的研究報(bào)道較少，同時(shí)基因在不同組織中的表達(dá)量與地方豬氨基酸、脂肪酸間的關(guān)聯(lián)分析也較少。本實(shí)驗(yàn)以保山豬為研究對(duì)象，通過熒光定量PCR 技術(shù)，檢測(cè)保山豬肝臟、背脂和背肌中基因的相對(duì)表達(dá)量，探究保山豬3 個(gè)組織中基因的表達(dá)量與保山豬肉氨基酸、脂肪酸有無關(guān)聯(lián)性，以期為保山豬的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和樣品采集 由保山市保山豬研究所提供胎次、產(chǎn)仔日期相近的12 頭（6 ♂，6 ♀）70 日齡保山豬，在相同的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下飼養(yǎng)至260 日齡后結(jié)束，隨機(jī)屠宰6 頭（3 ♂，3 ♀）。采集肝臟、背最長肌和背部脂肪3 個(gè)組織的RNA 樣品置于無RNA 酶的凍存管中，并立即放入液氮罐保存，后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱用于RNA 的提取及定量實(shí)驗(yàn)，采集背最長肌樣品置于-20℃冰箱備用。

1.2 肌肉營養(yǎng)成分測(cè)定 氨基酸測(cè)定參考GB 5009.124-2016 方法，茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀；脂肪酸測(cè)定參考GB 5009.168-2016 第三法，歸一化法、水解提取法。

1.3 總RNA 的提取和檢測(cè) 利用北京擎科生物技術(shù)有限公司RNAPreP FastPure 動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA 提取試劑盒（雙柱型）提取保山豬肝臟、背最長肌和背脂的總RNA。

取0.3 g 瓊脂糖和30 mL TAE 溶液，制備濃度為1%的瓊脂糖凝膠，樣品的RNA 原液和上樣緩沖液各取2 μL混勻后依次加入到凝膠孔中，在110 V 穩(wěn)定電壓的條件下電泳35 min。電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶情況。將保山豬3 個(gè)組織的RNA 原液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，用核酸濃度檢測(cè)儀測(cè)量每個(gè)樣品的RNA 濃度以及OD（260/280）值。

1.4 反轉(zhuǎn)為cDNA 按照北京擎科生物科技有限公司TSK302S 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（GoldenstarRT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2）說明書，將質(zhì)檢合格的RNA 樣品反轉(zhuǎn)為cDNA。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量 參照NCBI 數(shù)據(jù)庫中（Gene Bank 登錄號(hào)：NM_205518.1）和（登錄號(hào)：NM_001099930）的基因序列，用在線軟件Primer 5.0完成引物設(shè)計(jì)，由北京擎科生物技術(shù)有限公司完成引物合成，引物序列及退火溫度見表1，RT-qPCR 反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃1 min，變性95℃10 s，退火61℃10 s，延伸72℃，10 s，循環(huán)40 次（）；預(yù)變性95℃1 min，變性95℃10 s，退火61℃10 s，延伸72℃ 10 s，循環(huán)40 次（）。

表1 引物序列及退火溫度

2 結(jié)果與分析

2.1 保山豬背最長肌氨基酸組成及含量測(cè)定結(jié)果 6 頭保山豬背最長肌中測(cè)定的氨基酸有16 種，結(jié)果如表2。其中，必需氨基酸（Lys、Met、Thr、Ile、Leu、Val）在總量中占比為40.59%，鮮味氨基酸（Glu、Asp、Phe、Ala、Gly、Tyr）在總量中占比為44.52%。

表2 保山豬背肌氨基酸的組成及含量測(cè)定結(jié)果

2.2 保山豬背最長肌脂肪酸組成和含量測(cè)定結(jié)果 在保山豬背最長肌脂肪酸含量測(cè)定中，一共測(cè)定了23種脂肪酸，其中，保山豬不飽和脂肪酸（Unsaturated Fatty Acids，UFA）在總量中比例為56.16%，飽和脂肪酸（Saturated Fatty Acids，SFA）在總量中比例為43.83%，多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids，PUFA）在總量中比例為11.30%，單不飽和脂肪酸（Monounsaturated Fatty Acids，MUFA）在總量中比例為44.36%，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 保山豬背肌脂肪酸的組成及含量測(cè)定結(jié)果

2.3 保山豬3 個(gè)組織總RNA 的提取及質(zhì)量檢測(cè) 分別對(duì)保山豬3 個(gè)組織提取的總RNA 進(jìn)行電泳，出現(xiàn)18S和28S 明亮清晰條帶，說明提取效果較好，結(jié)果如圖1。

圖1 保山豬3 個(gè)組織總RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

對(duì)提取的保山豬3 個(gè)組織的總RNA 進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，吸光度比值在1.8～2.2 之間，濃度等指標(biāo)具備實(shí)驗(yàn)的條件，可進(jìn)行后續(xù)的反轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4。

表4 樣品總RNA 質(zhì)量檢測(cè)

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)驗(yàn) 將保山豬基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，溶解曲線和擴(kuò)增曲線如圖2、圖3 所示，擴(kuò)增曲線模板呈平滑的“S”型，陰性對(duì)照基線平整未起峰，指數(shù)區(qū)較明顯，說明檢查結(jié)果的擴(kuò)增曲線較為可靠。溶解曲線為平穩(wěn)下滑的曲線，溶解峰單一整齊，陰性對(duì)照基線平整未起峰，說明沒有引物二聚體且引物擴(kuò)增的特異性較好，操作過程未受污染，能夠?qū)崟r(shí)準(zhǔn)確地反映目的基因的擴(kuò)增動(dòng)態(tài)。

圖2 FASN 基因溶解曲線圖

圖3 FASN 基因擴(kuò)增曲線圖

2.5基因在保山豬3 個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量分析對(duì)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，保山豬3個(gè)組織中基因的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果如表5 所示，背脂中的表達(dá)量最高，為9.76×10，與肝臟和背最長肌內(nèi)的表達(dá)量呈極顯著差異，在肝臟中的表達(dá)量次之，在背最長肌中表達(dá)量最少；相對(duì)應(yīng)的基因在保山豬3 個(gè)組織中的表達(dá)水平為背脂>肝臟>背肌。

表5 保山豬3 個(gè)組織中FASN 基因的相對(duì)表達(dá)量

2.6基因在保山豬3 個(gè)組織中的表達(dá)量與背肌營養(yǎng)物質(zhì)含量的關(guān)聯(lián)分析

2.6.1 與氨基酸含量的關(guān)聯(lián)分析基因在保山豬3個(gè)組織中的表達(dá)量與氨基酸含量無顯著相關(guān)關(guān)系，結(jié)果見表6。

表6 FASN 基因在保山豬3 個(gè)組織中的表達(dá)量與氨基酸含量的關(guān)聯(lián)分析

2.6.2 與脂肪酸含量的關(guān)聯(lián)分析基因在保山豬肝臟中的表達(dá)量與保山豬UFA 和芥酸含量呈極顯著正相關(guān)，與SFA 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與二十碳三烯酸、花生四烯酸和二十碳烷酸含量呈顯著正相關(guān)，與棕櫚酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)；基因在保山豬背脂和背肌中的表達(dá)量與脂肪酸含量無顯著的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果見表7。

表7 FASN 基因在保山豬3 個(gè)組織中的表達(dá)量與脂肪酸含量的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

氨基酸組成及含量是評(píng)價(jià)肉品蛋白質(zhì)的主要指標(biāo)，也是受消費(fèi)者青睞的重要因素。楊潔鴻等檢測(cè)了撒壩豬、大河豬、滇南小耳豬、麗江豬以及迪慶藏豬5個(gè)云南地方豬種肌肉氨基酸組成及含量，并與外來豬種長白豬進(jìn)行比較，結(jié)果表明6 個(gè)豬種均檢測(cè)到16 種氨基酸，云南地方豬肌肉氨基酸總量由高到低依次為：迪慶藏豬（21.40 g/100g）>大河豬（20.86 g/100g）>麗江豬（19.23 g/100g）>滇南小耳豬（18.43 g/100g）>撒壩豬（17.94 g/100g），均高于大白豬（15.70 g/100g）。其中氨基酸中含量最高的谷氨酸占比由高到低分別為：迪慶藏豬（3.62%）>大河豬（3.42%）>麗江豬（3.27%）>撒壩豬（3.11%）>滇南小耳豬（3.04%）。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)保山豬背最長肌氨基酸種類及含量測(cè)定，同樣檢測(cè)到16 種氨基酸，氨基酸總量為21.9 g/100g，谷氨酸占比為3.523%，高于云南其他6 個(gè)地方豬種，氨基酸與還原糖之間的美拉德反應(yīng)是導(dǎo)致豬肉制品風(fēng)味差異的重要原因，谷氨酸屬于呈味氨基酸，可提高肉品鮮味，這可能是保山豬肉質(zhì)鮮美的原因之一。

豬肉的脂肪酸含量是衡量豬肉營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，同時(shí)揮發(fā)性脂肪酸也是影響豬肉風(fēng)味的重要因素之一。脂肪酸既可以影響豬肉的營養(yǎng)與風(fēng)味，也可對(duì)人體健康產(chǎn)生影響。硬脂酸和亞油酸的含量是決定豬肉脂肪硬度的最重要因素，同時(shí)亞油酸對(duì)血清膽固醇水平有降低作用。多不飽和脂肪酸具有調(diào)節(jié)血脂、清理血栓以及參與人體免疫調(diào)節(jié)等功能?；ㄉ南┧岬拇x產(chǎn)物可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，已有研究證明花生四烯酸可減少腫瘤細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤血管新生，且不損害正常細(xì)胞。亞麻酸通過刺激棕色脂肪組織，可激活其中的線粒體活化，從而使多余熱量釋放，防止肥胖癥。章杰等選用180 日齡的長白豬和約克夏豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，檢測(cè)其背最長肌中脂肪酸含量，結(jié)果顯示長白豬和約克夏豬飽和脂肪酸含量分別為68.65 g/100g 和70.64 g/100g、單不飽和脂肪酸含量分別為30.32 g/100g和28.59 g/100g、多不飽和脂肪酸含量分別為21.03 g/100g和20.77 g/100g。本實(shí)驗(yàn)對(duì)保山豬背最長肌脂肪酸含量的測(cè)定中，飽和脂肪酸的平均含量為43.833 g/100g，不飽和脂肪酸的平均含量為56.168 g/100g，其中單不飽和脂肪酸（44.865 g/100g）占79.88%，多不飽和脂肪酸（11.304 g/100g）占20.12%，飽和脂肪酸的含量遠(yuǎn)低于長白和約克夏豬，不飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量比長白和約克夏豬高，說明保山豬肌肉營養(yǎng)價(jià)值更利于人體健康，具有較好的市場(chǎng)前景。

梁金輝等利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法，研究基因在藏豬、大約克夏豬以及滇南小耳豬肝臟、背脂、背最長肌組織中的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滇南小耳豬的基因表達(dá)水平在背脂組織中最高，背最長肌中最低；藏豬的基因表達(dá)量在背脂組織中最高，背最長肌次之，肝臟中表達(dá)量最少。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果得出，保山豬基因的表達(dá)量在不同組織中由高到低依次為：背脂>肝臟>背最長肌，與滇南小耳豬一致，與藏豬、大約克夏豬不同，這可能是由于豬種差異導(dǎo)致，滇南小耳豬與保山豬均為云南地方豬種，可能是地緣較近關(guān)系導(dǎo)致的。同時(shí)，梁金輝等人還發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)水平與脂肪含量以及肌內(nèi)脂肪含量呈一定的正相關(guān)，與本研究結(jié)果相符，但表達(dá)量與脂肪和肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)性不顯著。

PING 等通過轉(zhuǎn)錄水平的基因篩選，認(rèn)為基因具有調(diào)節(jié)十六酸、十六碳一烯酸、十八碳一烯酸和單不飽和脂肪酸的功能。秦文等研究證實(shí)，基因在牦牛背最長肌組織中的相對(duì)表達(dá)量與其脂肪酸中癸酸（C10:0）的含量呈極顯著正相關(guān)（<0.01），而與黃牛脂肪酸未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。但本研究結(jié)果顯示，基因與保山豬飽和脂肪酸含量、不飽和脂肪酸和棕櫚酸等7 種脂肪酸均呈顯著相關(guān)，與前人在牛上的研究結(jié)果存在較大的差異，這可能是由于種間差異所導(dǎo)致的。王昱丁通過對(duì)萊蕪豬背最長肌轉(zhuǎn)錄組以及DNA甲基化組的聯(lián)合分析，篩選基因?yàn)橹舅嵘锖铣傻挠嘘P(guān)基因。Renaville 等研究基因多態(tài)性和豬肉脂肪酸含量之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)基因與脂肪酸含量存在顯著相關(guān)性。本研究中經(jīng)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，保山豬基因表達(dá)量與脂肪酸相關(guān)，基因在肝臟中的表達(dá)量與保山豬飽和脂肪酸呈極顯著負(fù)相關(guān)，與不飽和脂肪酸和芥酸呈極顯著正相關(guān)，與棕櫚酸呈顯著負(fù)相關(guān)，與二十碳三烯酸、花生四烯酸和二十四烷酸均呈顯著正相關(guān)，與王昱丁研究結(jié)果一致，說明基因?yàn)橛绊懕Ｉ截i脂肪酸沉積的候選基因。綜上所述，基因?qū)I養(yǎng)物質(zhì)含量的調(diào)控偏向于對(duì)脂肪酸的影響，進(jìn)而影響豬肉品質(zhì)。

4 結(jié) 論

基因?qū)ΡＩ截i不飽和脂肪酸含量具有調(diào)控作用，可作為影響保山豬不飽和脂肪酸含量的候選基因。