華永琳，張小玉，曹海港，楊公社，史新娥

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，動物脂肪沉積與肌肉發(fā)育實驗室，陜西楊凌 712100）

隨著生活水平的不斷提高，人們對肉品質(zhì)的需求也逐步提升。關(guān)中黑豬是陜西省地方優(yōu)良豬種資源，主要分布在咸陽、周至、楊凌等地區(qū)，因肉質(zhì)細(xì)嫩、大理石紋明顯及口感佳而備受青睞。決定肉品質(zhì)的因素有遺傳因素、環(huán)境因素、營養(yǎng)因素與管理因素等，其中肌纖維類型和肌內(nèi)脂肪含量是影響肉質(zhì)的關(guān)鍵。根據(jù)其肌球蛋白重鏈（Myosin Heavy chain，）亞型不同，肌纖維類型可分為型、型、型和型。其中豬背最長肌（Longissimus Dorsi，LD）以型為主，而比目魚肌（Soleus,Sol）以型為主。為研究不同肌纖維類型與肉品質(zhì)的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)理，需要檢測背最長?。↙D）和比目魚?。⊿ol）中肌纖維相關(guān)基因的表達(dá)情況。

實時熒光定量PCR（Real-time Quantitative System，RTqPCR）是現(xiàn)代分子實驗中分析基因表達(dá)的重要工具，其中內(nèi)參基因的正確選擇是RT-qPCR 相對定量的重點。近年來的研究表明，不同品種、不同類型的肌肉組織以及不同時期的肌肉組織中內(nèi)參基因的表達(dá)具有較大差異。如McBryan 等人發(fā)現(xiàn)在不同遺傳背景的豬胸肌和腰肌中2-微球蛋白（Beta-2-Microglobulin，是表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而Niu 等人卻表示在長白豬背最長肌中并不是最佳內(nèi)參基因。此外，Meng 等人的研究也表明內(nèi)參基因的選擇對于目的基因的準(zhǔn)確表達(dá)具有決定性作用。

因此，本研究以不同日齡、不同性別關(guān)中黑豬的LD 和Sol 為實驗材料，通過RT-qPCR 方法及geNorm和NormFinder 軟件篩選3-磷酸甘油醛脫氫酶（Glycer aldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，）、-肌動蛋白（-actin，）、肽基脯氨酰異構(gòu)酶A（Peptidylprolyl Isomerase A，）、TATA 盒結(jié)合蛋白（TATA Box-binding Protein Tyrosine，）、2-微球蛋白（Beta-2-microglobulin，）、酪氨酸3-單加氧酶/ 色氨酸5 單加氧酶活化蛋白（Tyrosine 3-monooxygenase/Tryptophan 5-monooxygenase Activation Protein，Zeta Polypeptide，）、真核延伸因子1樣蛋白（Eukaryotic Elongation Factor-1，）和18s 小亞基單位核糖體核酸（18S Ribosomal RNA，）8 個候選內(nèi)參基因中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，并以為目的基因進(jìn)行驗證，以期為關(guān)中黑豬骨骼肌纖維類型的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究骨骼肌發(fā)育不同階段的基因表達(dá)分析提供有價值的信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗所用組織來自于24 頭關(guān)中黑豬。其中3、30、90 d 和180 d 的閹割公豬及母豬各3 頭，采集背最長肌和比目魚肌，置于-80℃低溫冰箱保存，用于提取總RNA。

1.2 總RNA 的提取及cDNA 的合成 使用TRIZOL（TaKaRa，中國大連）試劑從采集的背最長肌和比目魚肌中提取總RNA。RNA 的質(zhì)量和濃度通過核酸濃度測定儀（Bio-Rad）進(jìn)行評估，其中將OD/OD在1.8～2.0 的樣品按照PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa，中國大連）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA 保存于-80℃低溫冰箱備用。

1.3 引物設(shè)計 本研究選取和等8 個 候選內(nèi)參基因。設(shè)計8 個候選基因的特異性引物（表1），由Invitrogen 公司（上海）合成。

表1 候選內(nèi)參基因的引物序列

1.4 實時熒光定量PCR RT-qPCR 的反應(yīng)體系是10 μL：熒光染料SYBR Green Mix 5 μL，F(xiàn)orward Primer和Reverse Primer 各0.3 μL（終濃度150 nmol/L），RNase Free ddHO 3.4 μL，cDNA(100 ng/μL)1 μL。實時熒光定量PCR 反應(yīng)條件如表2 所示。反應(yīng)后根據(jù)熔解曲線分析PCR 產(chǎn)物的特異性，分別導(dǎo)出目的基因和內(nèi)參基因的Ct 值。

表2 Real time-qPCR 操作過程

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用geNorm 和NormFinder 對候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。其中g(shù)eNorm 通過基因的相對表達(dá)水平（2）計算候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性（M 值），M 值越小，內(nèi)參基因的表達(dá)水平越穩(wěn)定；反之，M 值越大，內(nèi)參基因的表達(dá)越不穩(wěn)定。NormFinder 的原理和geNorm 相似，根據(jù)內(nèi)參基因的穩(wěn)定值大小來篩選最適的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)參基因引物的特異性及Ct 值變化 對等8 個候選內(nèi)參基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增，RT-qPCR 熔解曲線均表現(xiàn)為單個產(chǎn)物的峰值，即為特異性擴(kuò)增。通過梯度稀釋豬骨骼肌cDNA 樣品后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，繪制8 個候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算結(jié)果顯示擴(kuò)增效率E 在0.89～1.12，說明內(nèi)參基因的引物特異性較好，可用于后續(xù)分析。此外，qPCR 檢測內(nèi)參基因在豬骨骼肌中的循環(huán)閾值（Ct）的變化，結(jié)果顯示基因的Ct 值變化差異最大，即ΔCt 為4.32，而基因的Ct 值變化差異最小，ΔCt 為2.08（圖1）。

圖1 8 個候選內(nèi)參基因在豬骨骼肌中的Ct 值變化

2.2 內(nèi)參基因在不同日齡和不同性別的背最長肌（LD）及比目魚?。⊿ol）中的表達(dá)穩(wěn)定性 本實驗利用geNorm 和NormFinder 軟件進(jìn)行分析，選擇出不同實驗條件下最佳的內(nèi)參基因。對關(guān)中黑豬不同日齡及不同性別的LD 中穩(wěn)定內(nèi)參基因的geNorm 分析結(jié)果顯示：8 個候選內(nèi)參基因在不同樣品中的表達(dá)穩(wěn)定性存在較大差異。其穩(wěn)定性排序依次為>>>>>>，其中在關(guān)中黑豬不同日齡樣品中最穩(wěn)定（M=1.437），最不穩(wěn)定（M=2.434）；而在關(guān)中黑豬不同性別樣品中最穩(wěn)定（M=1.075），其次是和，最不穩(wěn)定，M 值達(dá)到3.203（圖2）。

圖2 內(nèi)參基因在不同日齡和不同性別背最長肌中的表達(dá)穩(wěn)定性

對關(guān)中黑豬不同日齡及不同性別的比目魚肌穩(wěn)定內(nèi)參基因的geNorm 分析結(jié)果顯示：在關(guān)中黑豬不同日齡的樣品中，內(nèi)參基因穩(wěn)定性依次為：>，其中的M 值最?。∕=1.084），其次是（圖3A）；而在關(guān)中黑豬不同性別樣品中，穩(wěn)定性排序為===，其中和的M 值最小（M=0.723），其次是和（圖3B）。

圖3 內(nèi)參基因在不同日齡和不同性別比目魚肌中的表達(dá)穩(wěn)定性

通過NormFinder 軟件分析關(guān)中黑豬不同日齡及不同性別的背最長肌中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，結(jié)果顯示：在不同日齡的樣品中，候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值（S 值）最小（S=0.355），表明其表達(dá)最穩(wěn)定，其次為和；而在不同性別樣品中，和的表達(dá)最穩(wěn)定（S=0.048），表達(dá)最不穩(wěn)定，S 值高達(dá)2.181（表3）。

表3 利用NormFinder 軟件分析不同實驗中8 個候選內(nèi)參基因在背最長肌中的表達(dá)穩(wěn)定性

在關(guān)中黑豬不同日齡及不同性別的比目魚肌中，NormFinder 分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，結(jié)果如表4 所示。在不同日齡的樣品中，候選內(nèi)參基因的S 值最小（S=0.257），表明其穩(wěn)定性最高，其次為和；而在不同性別樣品中，和的表達(dá)穩(wěn)定性最高（S=0.335），最不穩(wěn)定的是和基因。

表4 利用NormFinder 軟件分析不同實驗中8 個候選內(nèi)參基因在比目魚肌中的表達(dá)穩(wěn)定性

2.3 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的驗證 為進(jìn)一步驗證內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，以不同候選基因作為內(nèi)參基因，檢測背最長肌和比目魚肌中的表達(dá)。另外，對以上篩選出的3 個較穩(wěn)定基因（）進(jìn)行兩兩混合檢測的表達(dá)。圖4 結(jié)果表明和3 個候選基因中的穩(wěn)定性相對于和較好。和一起作為內(nèi)參基因、和作為內(nèi)參基因、和作為內(nèi)參基因、單獨作為內(nèi)參基因檢測在背最長肌和比目魚肌的相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，在2 種不同類型肌肉中并無差異，和單獨作為內(nèi)參基因?qū)M(jìn)行校正，顯示在背最長肌和比目魚肌中表達(dá)存在顯著差異。因此可作為關(guān)中黑豬不同類型骨骼肌中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。

圖4 以不同候選基因作為內(nèi)參分析不同肌纖維類型MyHC IIx 的表達(dá)

3 討 論

理想的內(nèi)參基因應(yīng)該在不同條件下都能穩(wěn)定表達(dá)，但目前為止，任何一種內(nèi)參基因只在特定實驗條件下穩(wěn)定表達(dá)，在不同的發(fā)育階段、細(xì)胞、組織、器官、個體以及不同的實驗條件下，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性存在顯著差異。目前的研究表明，采用多個內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行校正相對于單個內(nèi)參基因要更加準(zhǔn)確。

本研究通過geNorm 和NormFinder 軟件分析得出和基因在關(guān)中黑豬4 個不同日齡和2 種性別條件下的背最長肌和比目魚肌中表達(dá)較穩(wěn)定，進(jìn)一步驗證后發(fā)現(xiàn)相對其余2 個內(nèi)參基因更穩(wěn)定，可將其作為關(guān)中黑豬骨骼肌中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。Erkens 等在篩選豬的背膘和背最長肌中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因時也發(fā)現(xiàn)和分別是豬背膘和背最長肌中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，這與本實驗研究結(jié)果相一致。而Niu 等在篩選長白豬不同發(fā)育階段的背最長肌中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因時發(fā)現(xiàn)，和是背最長肌中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而和在候選內(nèi)參基因中具有最大的變異性。該結(jié)果與本研究中得出的結(jié)果有偏差，其中一個原因可能是實驗采集的樣本存在差異。另一方面，和可能更適用于不同的豬組織類型，而不是不同的豬骨骼肌發(fā)育階段。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（）因其在各個組織中高表達(dá)且蛋白表達(dá)量恒定而被認(rèn)為是“經(jīng)典管家基因”。有研究顯示，在腫瘤及衰老的骨骼肌中表達(dá)下降，因此適合作為骨骼肌中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。此外，馮小婷的研究結(jié)果也顯示不適合作為大白豬和梅山豬骨骼肌的內(nèi)參基因。而Gu 等發(fā)現(xiàn)是榮昌豬脂肪組織中的最佳內(nèi)參基因，是肌肉組織中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。同樣，陳利等在南江黃羊母羊不同發(fā)育時期的骨骼肌中篩選出的穩(wěn)定內(nèi)參基因也是。這與本實驗研究結(jié)果相似，即在關(guān)中黑豬的不同發(fā)育階段的骨骼肌中可將作為內(nèi)參基因。以上結(jié)果表明在特定的實驗條件下，研究人員需根據(jù)自身實驗要求來選擇合適的內(nèi)參基因，以免得出錯誤的結(jié)論。

4 結(jié) 論

綜上所述，本實驗成功篩選出在關(guān)中黑豬的不同發(fā)育階段、不同性別的骨骼肌中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因為，并以此為內(nèi)參基因來校正目的基因的表達(dá)，為后續(xù)豬骨骼肌相關(guān)類型的研究中準(zhǔn)確定量目的基因的mRNA 表達(dá)提供了可靠的依據(jù)。