喬 木，武華玉，彭兆坤，吳俊靜，梅書(shū)棋，彭先文

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064）

豬肉品質(zhì)性狀是影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要經(jīng)濟(jì)性狀，同時(shí)也是滿(mǎn)足消費(fèi)者對(duì)豬肉風(fēng)味、食品健康和營(yíng)養(yǎng)需求的重要保障。然而，由于肉質(zhì)性狀的復(fù)雜性且遺傳力偏低，傳統(tǒng)的基于表型選擇等的遺傳改良方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高；分子標(biāo)記輔助選擇（Marker-Assisted Selection，MAS）的出現(xiàn)大大加速了豬育種進(jìn)程，它是利用與特定性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記作為輔助手段進(jìn)行選擇育種，具有快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，不僅能大大減少育種的人力物力消耗，而且能縮短育種時(shí)限。用于MAS 的分子標(biāo)記種類(lèi)很多，其中，單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）由于其存在的廣泛性、遺傳的穩(wěn)定性、檢測(cè)方法的簡(jiǎn)便快捷性，在SNP 與畜禽經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)性研究中具有重要作用，因而挖掘豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的SNP，能有效加快豬肉質(zhì)性狀的改良進(jìn)展。

胞質(zhì)5' 核苷酸酶1A（Cytosolic 5'-Nucleotidase 1A，）基因在人的骨骼肌和小鼠的脛骨前肌表達(dá)量較高；抗NT5C1A 自身抗體可以作為包涵體肌炎（一種肌肉疾?。┑臉?biāo)記物。課題組前期利用RNA-seq 技術(shù)獲得了一批在硒都黑豬背最長(zhǎng)肌與腰大肌中的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)基因在2 種不同纖維類(lèi)型的肌肉中表達(dá)量差異顯著，因此，選擇其作為豬肉質(zhì)性狀候選基因。本研究檢測(cè)了基因在硒都黑豬各組織中的表達(dá)特征，此外，在硒都黑豬群體中開(kāi)展了基因的多態(tài)性位點(diǎn)挖掘與鑒定及與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性研究，為優(yōu)質(zhì)肉豬的遺傳選育提供了新的標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)群體及樣品 本實(shí)驗(yàn)選取硒都黑豬303 頭（用于性狀關(guān)聯(lián)分析），法系大白豬41 頭（用于與硒都黑豬基因型分布規(guī)律進(jìn)行對(duì)比），飼養(yǎng)于湖北省農(nóng)科院建始種豬場(chǎng)，采集血液樣品，用于DNA 提取。其中法系大白豬41 頭只采集血樣，303 頭硒都黑豬體重達(dá)100 kg 時(shí)進(jìn)行屠宰，測(cè)定瘦肉率、肥肉率、內(nèi)脂率等胴體性狀和背最長(zhǎng)肌pH 值、背最長(zhǎng)肌大理石紋等肉質(zhì)性狀，具體性狀的選擇參考相關(guān)文獻(xiàn)。選擇其中4頭硒都黑豬，取心臟、脾臟、肝臟、腎臟、肺臟、肌肉、脂肪、小腸等16 個(gè)組織，提取RNA，用于組織表達(dá)譜分析。分別采用百邁客生物科技公司Biomarker Blood/Cell/Tissue DNA Kit 試劑盒（RK02008）、碧云天公司RNAeasy動(dòng)物RNA 抽提試劑盒（R0024）和InvitrogenSuperScriptIII 逆轉(zhuǎn)錄酶（18080044）提取DNA、RNA 及合成cDNA。

1.2 基因表達(dá)量檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR），針對(duì)NCBI 中豬基因（登錄號(hào)：NM_138648.2）mRNA 序列，設(shè)計(jì)qPCR 引物Q-NT5C1A/Q-NT5C1A（序列見(jiàn)表1），送奧科生物有限責(zé)任公司合成。采用ABI公司的QuantStudio 5 熒光定量PCR 儀，20 μL 體系，以上述16 個(gè)不同組織的cDNA 為模板（100 ng/20 μL），上、下游引物各0.3 μL，Abclone 定量染料SYBR Green Fast qPCR Mix（RK21203）10 μL，加ddHO 至總體積20 μL。以-基因作為內(nèi)參（引物見(jiàn)表1），用2值表示基因表達(dá)量，設(shè)3 個(gè)重復(fù)，計(jì)算方法參加Qiao 等文章。反應(yīng)條件參照羅云彥等文章，退火溫度見(jiàn)表1。

1.3 SNPs 篩選 根據(jù)豬基因（GenBank ID:NC_010448）的DNA 序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物對(duì)NTSF 和NTSR，如表1 所示，由奧科生物有限責(zé)任公司合成。PCR 反應(yīng)體系（30 μL）的配制和反應(yīng)程序參見(jiàn)1.2。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳后，對(duì)目的條帶進(jìn)行回收和純化（北京艾得萊公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒DR01），純化產(chǎn)物送北京奧科公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAMAN 軟件進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合測(cè)序峰型圖篩選SNP。

表1 NT5C1A 基因引物序列信息

1.4 單倍型分析 用Haploview 軟件對(duì)基因各SNP 進(jìn)行單倍型及連鎖分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS 9.1 軟件進(jìn)行SNP 位點(diǎn)和單倍型組合與表型性狀的關(guān)聯(lián)分析，所用模型為：Y=+A+B+C+D+X+e，為性狀表型值，X為協(xié)變量，為群體均值，A、B、C和D依次為基因型、年度、性別和家系效應(yīng)，e為殘差效應(yīng)。結(jié)果表示為Mean±SE，具體參照彭雅鑫等文章。

2 結(jié)果

2.1基因在硒都黑豬不同組織中的表達(dá)特征由圖1 可知，基因在不同組織中表達(dá)量不同，在腰大肌中表達(dá)量最高，其次為心臟組織、比目魚(yú)組織、皮上脂肪組織，在肝臟、脾臟、肺臟、小腸、胃、子宮和卵巢組織基本沒(méi)有表達(dá)。

圖1 NT5C1A 基因在硒都黑豬中的組織表達(dá)譜

2.2 硒都黑豬基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果 采用上述引物，選取20 頭硒都黑豬基因組DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得片段長(zhǎng)度537 bp，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 硒都黑豬NT5C1A 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

測(cè)序發(fā)現(xiàn)在此段序列存在3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，分別為rs81390049 C>T、rs81390048 A>G 和rs339707155 C>T 突變，如圖3 所示。

圖3 硒都黑豬NT5C1A 基因SNP 測(cè)序結(jié)果

2.3 硒都黑豬和法系大白豬基因SNPs 遺傳分布特征分析 如表2 所示，rs81390049 C>T 位點(diǎn)存在3 種基因型，CC 基因型占優(yōu)勢(shì)，C 等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，在硒都黑豬和法系大白豬中差異不顯著。rs81390048 A>G 位點(diǎn)，硒都黑豬中G 等位基因占主要優(yōu)勢(shì)，法系大白豬中A 等位基因占主要優(yōu)勢(shì)，硒都黑豬和法系大白豬中存在顯著差異。rs339707155 C>T 位點(diǎn)，TT 基因型占優(yōu)勢(shì)，T 等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，在硒都黑豬和法系大白豬中差異不顯著。卡方檢驗(yàn)表明，3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)均處于Hardy-weinberg 平衡（>0.05）。

表2 NT5C1A 基因3 個(gè)SNPs 的位點(diǎn)在不同豬種中的分布特征

2.4 豬基因SNPs 位點(diǎn)與硒都黑豬性狀關(guān)聯(lián)分析 如表3 所示，rs81390049 C>T 與背最長(zhǎng)肌大理石紋、股二頭肌大理石紋和背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂肪含量顯著相關(guān)；rs81390048 A>G 與屠宰率、花油重、內(nèi)脂率、臀部膘厚和平均背膘厚顯著相關(guān)；rs339707155 C>T 與瘦肉率和背最長(zhǎng)肌pH 值顯著相關(guān)（<0.05）。

表3 NT5C1A 基因3 個(gè)SNPs 與硒都黑豬胴體和肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析

2.5 單倍型分析 利用Haploview 4.2 軟件分析了基因的3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)的連鎖關(guān)系，結(jié)果如圖4 所示，3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)可組成一個(gè)單倍型模塊，其中rs81390049 C>T 和rs339707155 C>T 處于完全LD（D'=1，=1），其余每2 個(gè)位點(diǎn)的組合處于強(qiáng)LD（D'=1，=0.743）。形成3 種單倍型H1（CGT）、H2（TAC）和H3（CAT），所占比例分別為0.495、0.431 和0.074，構(gòu)成6 種單倍型組合（表4）。

表4 硒都黑豬NT5C1A 基因3 個(gè)SNPs 構(gòu)成的單倍型組合

圖4 硒都黑豬NT5C1A 基因3 個(gè)SNP 位點(diǎn)連鎖不平衡分析結(jié)果

剔除數(shù)量較少的單倍型組合H2H3 和H3H3，將其余4 個(gè)單倍型組合與胴體和肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見(jiàn)表5，H1H3（CGT/CAT）雙倍型眼肌面積、瘦肉率、肌內(nèi)脂肪含量均顯著高于其他雙倍型個(gè)體，并且H1H3（CGT/CAT）具有較低的背膘厚（<0.05）。

表5 NT5C1A 基因單倍型組合與硒都黑豬胴體和肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

基因又被稱(chēng)作胞質(zhì)5'核苷酸酶1A，主要研究集中于人類(lèi)肌肉疾病、在骨骼肌嘌呤核苷酸池的調(diào)節(jié)中起核心作用，它能夠優(yōu)先將一磷酸腺苷轉(zhuǎn)化為腺苷，可以作為包涵體肌炎的標(biāo)記物、血清中胞漿5'-核苷酸酶IA 活性降低作為乳腺癌相關(guān)肌肉炎癥的潛在標(biāo)記物。敲除基因的小鼠會(huì)影響肌肉收縮。課題組前期通過(guò)RNA-seq 技術(shù)發(fā)現(xiàn)基因在硒都黑豬腰大肌中的表達(dá)量高于背最長(zhǎng)肌，不同部位的肌肉纖維類(lèi)型不同，肌肉品質(zhì)不同，推測(cè)基因與肌纖維類(lèi)型相關(guān)，綜上，基因可以作為影響豬肉質(zhì)性狀的候選基因進(jìn)行研究。

本研究通過(guò)熒光定量PCR，檢測(cè)了基因在硒都黑豬16 個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在腰大肌中表達(dá)量顯著高于背最長(zhǎng)肌，與RNA-seq 結(jié)果一致，進(jìn)一步證明其與肌纖維發(fā)育相關(guān)?；蛟谛呐K中表達(dá)量較高，這與該基因在人類(lèi)心肌炎等疾病中的表達(dá)相吻合。此外，在不同部位脂肪組織表達(dá)差異顯著（皮上脂肪的表達(dá)量較高），推測(cè)其與脂肪發(fā)育相關(guān)。

本研究在硒都黑豬群體中對(duì)基因進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，篩選到3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，rs81390049 C>T 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明CC 基因型個(gè)體背最長(zhǎng)肌大理石紋、股二頭肌大理石紋和背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂肪含量均顯著高于CT 型和TT 型個(gè)體，并且加性效應(yīng)達(dá)到了顯著水平。有研究表明，大理石紋評(píng)分與肌內(nèi)脂肪含量存在相關(guān)性，大理石紋評(píng)分越高，肌內(nèi)脂肪含量就越高，肌內(nèi)脂肪含量是影響肉質(zhì)性狀的重要指標(biāo)之一，由此可見(jiàn)，在豬群體中，繼代選育CC 基因型個(gè)體，可以培育大理石紋和肌內(nèi)脂肪較高的豬群體，進(jìn)而達(dá)到提高豬肉的風(fēng)味、嫩度和多汁性的目的，為育種生產(chǎn)活動(dòng)帶來(lái)較高的效益。rs81390048 A>G 位點(diǎn)與屠宰率、花油重、內(nèi)脂率、臀部膘厚和平均背膘厚具有顯著相關(guān)性。AA 基因型個(gè)體較AG 和GG 基因型個(gè)體具有較高的屠宰率以及較低的花油重，AA 基因型個(gè)體臀部膘厚和平均背膘厚都顯著低于AG 和GG 基因型，并且A 等位基因?qū)μ岣咄涝茁屎屯尾勘旌窬哂酗@著的加性效應(yīng)。由此可見(jiàn)，在豬群體中，選育AA 基因型個(gè)體，可以從一定程度上為提高屠宰率、降低背膘厚提供切實(shí)可行的方案。rs339707155 C>T 的TT 基因型個(gè)體較TC 和CC 基因型個(gè)體具有較高的瘦肉率和背最長(zhǎng)肌pH 值（<0.05），并且加性效應(yīng)顯著（<0.05）。肌肉pH 值對(duì)豬肉品質(zhì)和肉品加工具有較大的影響。由此可見(jiàn)，在豬群體中，繼代選育TT 基因型個(gè)體，可以提高瘦肉率，獲得優(yōu)良的肌肉pH 值。通過(guò)單倍型分析，獲得了優(yōu)勢(shì)單倍型組合H1H3（CGT/CAT），攜帶H1H3 的個(gè)體具有較高的瘦肉率、肌內(nèi)脂肪含量，選育H1H3 的個(gè)體有利于提供養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

4 結(jié) 論

本研究首次分析了基因在硒都黑豬不同組織中的表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)其在不同肌肉和脂肪組織中表達(dá)量差異顯著，為深入研究其在肌肉發(fā)育和脂肪沉積中的功能奠定了基礎(chǔ)。此外，在硒都黑豬群體中對(duì)基因的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了篩選和鑒定，發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，這3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)與胴體和肉質(zhì)性狀存在不同程度地顯著關(guān)聯(lián)，并且發(fā)現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)單倍型組合，為豬肉質(zhì)性狀的遺傳改良提供了新的分子標(biāo)記。