吳俊靜，陳南琦，劉曉哲，喬 木，周佳偉，彭先文，梅書棋

（動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢 430064）

隨著居民消費提質(zhì)升級，豬肉消費已由滿足“量”的需求，向“量質(zhì)并舉”的優(yōu)質(zhì)化、多元化方向發(fā)展，迫切需要構(gòu)建兼顧生產(chǎn)效率與肉品質(zhì)的優(yōu)質(zhì)豬生產(chǎn)體系，滿足人民對幸福生活的向往。因此，近年來豬肉質(zhì)性狀的選育與提高已備受關(guān)注。然而，豬肉品質(zhì)性狀難以活體測量，屠宰成本高，制約了該性狀的選育進展。因此，尋找調(diào)控豬肉質(zhì)關(guān)鍵性指標肌內(nèi)脂肪（Intramuscular Fat，IMF）含量性狀的功能基因和有效分子育種標記對該性狀的快速選育具有重要意義。

核酸內(nèi)切酶/ 核酸外切酶/ 磷酸酶家族結(jié)構(gòu)域1（Endonuclease/Exonuclease/Phosphatase Family Domain Containing 1，EEPD1）是一種DNA 5'端核酸內(nèi)切酶，參與DNA 修復(fù)，促進DNA 雙鏈斷裂處的應(yīng)激復(fù)制叉的重啟，同時EEPD1 通過經(jīng)典非同源末端連接和微量同源介導(dǎo)末端連接抑制DNA 損傷修復(fù)。研究表明，EEPD1 參與膽固醇外排的正向調(diào)節(jié)，提示EEPD1 可能在脂質(zhì)代謝的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

硒都黑豬是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牽頭培育的優(yōu)質(zhì)黑豬新品種，具有肉質(zhì)優(yōu)良、繁殖性能好、抗逆性強等突出特色。為了挖掘影響其肉質(zhì)的關(guān)鍵基因，課題組利用RNA-seq 技術(shù)分析了IMF 高低極端差異個體的硒都黑豬背最長肌組織中基因表達情況，發(fā)現(xiàn)基因在高低IMF 個體中顯著差異表達，推測基因可能對IMF 性狀有影響。因此，本研究擬在硒都黑豬群中篩選鑒定豬基因的遺傳變異及其對IMF 性狀的影響，為IMF 性狀的遺傳改良提供新的分子育種標記。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 218 頭健康硒都黑豬飼養(yǎng)于建始縣紅巖寺湖北天之力育種科技有限公司，當體重達95～105 kg時進行屠宰，采集背肌、腰肌、比目魚肌、股二頭肌、心、肝、脾、肺、腎、胃、皮下脂肪、腹脂、腸脂、十二指腸、小腸、盲腸、卵巢、子宮等組織黃豆大小樣本于2 mL 凍存管中，置于液氮保存。同時，采集200 g 左右背肌低溫條件（4℃）下保存帶回實驗室，收集并記錄屠宰日齡、屠宰日期、屠宰體重、系譜等基本信息備用。

1.2 IMF 性狀測定 IMF 測定采用索氏抽提法，具體參見姜愛文等文章。

1.3 基因組DNA 和RNA 提取 采用天根生化科技有限公司動物組織DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，利用Invitrogen TRIzol 和氯仿試劑提取組織總RNA。通過1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 和RNA 質(zhì)量，并用Nanodrop 2000 分光光度計檢測核酸濃度。

1.4 豬基因變異位點篩選 根據(jù)豬基因序列（GenBank 登錄號：NC_010460.4），采用Primer 5.0軟件設(shè)計正向和反向引物對（表1），由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。將隨機選擇的37 個硒都黑豬DNA樣本組成混合DNA 池作為模板進行PCR 擴增，擴增程序為：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性20 s，57℃退火30 s，72℃延伸60 s，35 個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收、純化后送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司進行Sanger 測序，結(jié)合測序峰形圖篩選基因變異位點。

1.5 豬基因變異位點基因分型 利用上述EEPD1-E8 引物對，采用上述PCR 產(chǎn)物直接測序法在218 頭硒都黑豬群中進行基因分型檢測。

1.6 豬基因熒光定量檢測 取1 μg 的RNA 樣本，利用Thermo ScientificRevertAidTM First Strand cDNA Synthesis 試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA。采用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 試劑盒，在Applied Biosystems 公司QuantStudio 6 熒光定量PCR 儀上進行qPCR 檢測。以基因為內(nèi)參，采用2法計算相對表達量，每組實驗做3 個平行，每個實驗重復(fù)3 次。qPCR 引物及退火溫度見表1，采用20 μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，循環(huán)40 次。

表1 豬EEPD1 基因序列引物信息

1.7 生物信息學(xué)分析與統(tǒng)計分析 利用RNAfold WebServer 在線軟件（http://nibiru.Tbi.univie.ac.at/cgibin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）預(yù)測mRNA 最小自由能和質(zhì)心二級結(jié)構(gòu)。采用SPSS 26 統(tǒng)計軟件的GLM 模型進行SNP 位點與IMF 的關(guān)聯(lián)分析。所采用模型為：Y=+G+A+X+S+e，其中：Y表示表型值；表示群體均值；G表示基因型效應(yīng)；A表示年季效應(yīng)；X表示性別效應(yīng)；S表示父本效應(yīng)；e表示隨機殘差效應(yīng)。結(jié)果以最小二乘均值± 標準誤表示，<0.05判定為差異顯著；<0.01 判定為差異極顯著。應(yīng)用檢驗檢測是否符合哈代-溫伯格平衡（>0.05 表示處于遺傳平衡狀態(tài)，<0.05 則相反）。

2 結(jié)果與分析

2.1基因組織表達譜 利用qPCR 方法檢測了豬基因組織表達譜情況，發(fā)現(xiàn)該基因在肌肉、脂肪、各內(nèi)臟器官等組織中廣泛表達，在背肌組織中表達量最高，其次是小腸和皮下脂肪組織（圖1）。同時，選取4 頭IMF 低組（平均IMF 為1.49%）和4 頭IMF 高組（平均IMF 為4.48%）硒都黑豬背肌組織樣本RNA，檢測基因表達水平與IMF 的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因的表達量在IMF 低組個體中極顯著高于IMF 高組個體（圖2）。

圖1 豬EEPD1 基因組織表達譜

圖2 豬EEPD1 基因在高低IMF 背肌組織表達量

2.2 豬基因變異檢測結(jié)果 利用DNA 混合池PCR 測序方法，在基因第8 外顯子中檢測發(fā)現(xiàn)5 個SNP 位點，分別為g.123857 C>G、g.123907 A>G、g.124024 A>G、g.124050 G>A 和g.124222 A>G，如圖3 所示。

圖3 豬EEPD1 基因第8 外顯子SNP 位點的Sanger 測序圖譜

2.3 豬基因變異對IMF 性狀的影響 屠宰測定了218 頭硒都黑豬100 kg 體重IMF 性狀，其表型分布頻率如圖4 所示。利用PCR 產(chǎn)物直接測序法檢測獲得這218 頭個體基因各SNP 位點的基因型，并將基因型與其IMF 性狀進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，g.123857 C>G、g.123907 A>G、g.124024 A>G、g.124050 G>A和g.124222 A>G 均顯著影響IMF 性狀（表2），且這5 個位點均符合哈代-溫伯格平衡。例如，g.123907 A>G 位點GG 純合基因型個體的IMF 極顯著高于AA純合基因型個體，且IMF 性狀存在GG>AG>AA 的關(guān)系。

表2 豬EEPD1 基因SNP 位點與硒都黑豬肌內(nèi)脂肪含量性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

圖4 群體IMF 性狀分布頻率

2.4 豬基因單倍型對IMF 性狀的影響 利用Haploview 軟件分析了基因的5 個SNP 位點的連鎖關(guān)系（圖5），發(fā)現(xiàn)它們存在不同程度的連鎖，其中g(shù).123907 A>G、g.124024 A>G 和g.124050 G>A 緊密連鎖，處于同一個連鎖不平衡模塊。在硒都黑豬群體中，這3 個位點共檢測到7 種組合基因型，且不同單倍型組合基因型顯著影響IMF 性狀（表3）。GGGGAA 基因型個體的IMF 含量最高，極顯著高于AAAAGG 基因型個體，且顯著高于AGAAGG、AGAGGA、AGAGAA基因型個體。

圖5 豬EEPD1 基因5 個SNP 位點的連鎖不平衡（r2）分析結(jié)果

表3 EEPD1 基因單倍型與IMF 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

2.5 豬mRNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測利用RNAfold WebServer 在線程序?qū)ωimRNA 及5 個SNP 位點突變后的mRNA 二級結(jié)構(gòu)的最小自由能（MFE）與質(zhì)心二級結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果如圖6 所示。各SNP 位點造成其mRNA 二級結(jié)構(gòu)自由能產(chǎn)生不同程度的改變，且g.123907 A>G、g.124050 G>A 和g.124222 A>G 突變明顯改變了其mRNA 的二級結(jié)構(gòu)，它們的質(zhì)心二級結(jié)構(gòu)自由能高于野生型。

圖6 豬EEPD1 基因各SNP 突變后mRNA 二級結(jié)構(gòu)圖對比

3 討 論

EEPD1 蛋白是核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、磷酸酶家族成員，主要在人類DNA 損傷期間修復(fù)受壓復(fù)制叉中發(fā)揮作用，與癌癥發(fā)生相關(guān)。有關(guān)基因參與脂類代謝及脂質(zhì)調(diào)控的研究報道較少。路曉梅發(fā)現(xiàn)基因參與調(diào)控人和鼠血脂代謝，及肝臟脂肪酸的合成及脂質(zhì)沉積。有關(guān)雞脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析發(fā)現(xiàn)，禁食會顯著影響脂肪形成相關(guān)通路中的基因表達，且雞基因?qū)χ舅岷铣删哂胸撜{(diào)控作用，但具體機制尚不明確。Li 等發(fā)現(xiàn)公牛閹割后會導(dǎo)致等7 個基因顯著差異表達，并影響牛腰最長肌肌內(nèi)脂肪含量，表明?；蚺c肌內(nèi)脂肪沉積緊密相關(guān)。而有關(guān)豬基因的研究尚未見報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)豬基因在高、低IMF背肌組織中顯著差異表達，結(jié)合其他物種功能研究報道，推測基因是影響豬肉質(zhì)性狀的候選基因。因此，進一步篩選了該基因的遺傳變異，共發(fā)現(xiàn)了位于基因第8 外顯子的5 個SNP 位點，即g.123857 C>G、g.123907 A>G、g.124024 A>G、g.124050 G>A和g.124222 A>G。通過與豬肌IMF 性狀進行關(guān)聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)這5 個SNP 位點均顯著影響IMF 性狀，證實基因是影響豬IMF 性狀的一個功能基因。

為了分析這5 個SNP 位點的關(guān)系，開展了單倍型分析。結(jié)果表明，g.123907 A>G、g.124024 A>G 和g.124050 G>A 緊密連鎖，處于同一連鎖不平衡模塊中，且其組成的單倍型基因型也與IMF 性狀顯著相關(guān)。所檢測硒都黑豬群體中存在7 種組合基因型，GGGGAA 基因型個體IMF 最高，極顯著高于AAAAGG 基因型個體IMF。因此，在育種中應(yīng)予以優(yōu)先保留攜帶GGGGAA基因型的個體，以提高群體的肉質(zhì)性能水平。

為了進一步分析這5 個SNP 的功能，分析了這5個突變位點對EEPD1 蛋白氨基酸編碼的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)g.123907 A>G 位點導(dǎo)致EEPD1 蛋白第554 個氨基酸由絲氨酸到甘氨酸（Ser>Gly）的改變。然而通過對EEPD1 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸突變對蛋白-螺旋、-轉(zhuǎn)角、-折疊等二級結(jié)構(gòu)均沒有較大影響，因此推測該位點并不是通過影響蛋白結(jié)構(gòu)而發(fā)揮功能作用。翻譯是基因表達的關(guān)鍵過程之一，其效率對于生命活動十分重要。mRNA 作為翻譯體系的重要組成部分，在編碼蛋白質(zhì)的同時，對翻譯速率起一定程度的調(diào)控作用，mRNA 二級結(jié)構(gòu)就是調(diào)控翻譯速率的一種方式?；诖耍M一步分析了這5 個SNP 位點對mRNA 二級結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各SNP 位點均造成其mRNA 二級結(jié)構(gòu)自由能產(chǎn)生不同程度的改變。g.123907 A>G、g.124050 G>A 和g.124222 A>G 突 變導(dǎo)致其mRNA 的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，g.123857C>G和g.124024 A>G 突變位點雖然其mRNA 二級結(jié)構(gòu)變化不明顯，但是最小自由能降低，穩(wěn)定性有所提高。mRNA 的二級結(jié)構(gòu)在各種生命過程中發(fā)揮著重要作用，調(diào)節(jié)翻譯速率并直接影響mRNA 自身的穩(wěn)定性等。較多研究表明，mRNA 二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性通過影響翻譯起始階段核糖體與mRNA 的結(jié)合以及核糖體在mRNA 上的移動速率，進而對翻譯蛋白質(zhì)的效率有很大影響。同時，mRNA 二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也與蛋白質(zhì)表達量顯著相關(guān)，且對基因功能也具有調(diào)控作用。因此，推測本研究發(fā)現(xiàn)的5 個SNP 位點主要是通過影響EEPD1 蛋白的翻譯效率進而影響其生物學(xué)功能，但是其具體調(diào)控機制還有待進一步驗證。另外，本研究鑒定的5 個影響IMF 性狀的分子標記今后還需在多個品種豬群中進行驗證，并利用細胞模型進一步明確其主效功能位點。

4 結(jié) 論

本研究在硒都黑豬群體中鑒定獲得了位于豬基因第8 外顯子上的5 個顯著影響豬IMF 性狀的SNP 位點，為豬IMF 性狀的選育提供了新的分子育種標記。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這5 個SNP 位點導(dǎo)致其mRNA 二級結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性發(fā)生變化，推測它們主要通過影響EEPD1 蛋白翻譯效率進而影響IMF 性狀。今后將進一步擴大群體驗證其遺傳效應(yīng)，并在細胞水平明晰其調(diào)控IMF 性狀的具體分子機制。