肖真真， 朱燕娟，2，3， 劉譯鴻， 常雪松， 陳亞棟， 余婭婭， 何怡瀚， 張海波，2，3，4

1.廣東省中醫(yī)院(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院），廣東 廣州 510120；2.廣東省中醫(yī)證候臨床研究重點實驗室，廣東 廣州 510120；3.粵港澳中醫(yī)藥與免疫疾病研究聯(lián)合實驗室，廣東 廣州 510120；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院省部共建中醫(yī)濕證國家重點實驗室，廣東 廣州 510120

肺癌發(fā)病率和死亡率位居于全球惡性腫瘤的首位，其中非小細胞肺腺癌(non-small cell lung cancer ，NSCLC）約占85%，嚴重威脅著人類的生命和健康[1-2]。隨著分子靶向藥物與免疫哨卡抑制劑的問世，西醫(yī)“精準(zhǔn)腫瘤醫(yī)學(xué)”的理念逐漸深入人心，中醫(yī)一向以辨證論治為基本原則，“同病異治”亦是體現(xiàn)了個人的精準(zhǔn)化治療，這與西醫(yī)精準(zhǔn)治療肺癌的理念相符。明確中醫(yī)辨證分型客觀物質(zhì)基礎(chǔ)，對于中醫(yī)藥指導(dǎo)臨床有著重要意義。腫瘤免疫微環(huán)境(tumor immune microenviroment，TIME）是腫瘤微環(huán)境重要組成部分，始終存在著抗腫瘤免疫細胞與免疫抑制性細胞的相互制衡，影響著腫瘤免疫治療療效[3]。近年來在抗腫瘤領(lǐng)域中，中醫(yī)藥在改善機體免疫功能、重塑TIME 方面一直有著獨特的優(yōu)勢[4]。目前已有文獻[5-6]證實肺癌中醫(yī)證型與臨床特征中TNM 分期、病理分型、血清炎癥因子水平等有一定的相關(guān)性，因此從腫瘤免疫微環(huán)境著手闡明中醫(yī)辨證分型與客觀物質(zhì)基礎(chǔ)，有著一定的創(chuàng)新性，為傳統(tǒng)中醫(yī)理論現(xiàn)代化提供可靠的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。因此，本研究檢測非小細胞肺癌初治患者的腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的表達情況，初步探索中醫(yī)辨證分型的臨床意義及與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集既往未接受過抗腫瘤治療的ⅢB 期及以上非小細胞肺癌患者69 例，臨床資料均齊全。本研究已經(jīng)過廣東省中醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(BE2019-004）。

1.2 中醫(yī)辨證分型

以中醫(yī)八綱辨證中的寒熱辨證統(tǒng)領(lǐng)，結(jié)合肺癌常見的氣虛證、痰濕證、陰虛證、熱毒證及血瘀證五個證型進行中醫(yī)辨證分型，診斷具體標(biāo)準(zhǔn)詳見中華中醫(yī)藥學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)《惡性腫瘤中醫(yī)診療指南》[7]。診斷方法采用兩人及兩人以上的三人判斷的方法，確認辨證分型：即由2位中醫(yī)臨床醫(yī)生根據(jù)分型標(biāo)準(zhǔn)分別對患者進行中醫(yī)辨證分型，若二者觀點不同，則與第三位臨床醫(yī)生(副主任中醫(yī)師及以上）共同討論后決定患者的中醫(yī)證型。

1.3 主要試劑和儀器

內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑(S2003，DAKO）、CD3 抗體(ZM-0417）、CD4 抗體(ZA-0519）、CD8抗體(ZA-0508）、CD68 抗體(ZM-0060）、CD163抗體(ZM-0428）、PD-1 抗體(ZM-0381）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；FOXP3 抗體(ab20034）、LAG3抗體(ab40466）購自英國Abcam 公司；PD-L1抗體(13684s）、TIM3 抗體(45208s）購自美國CST公司；兔抗/鼠抗HRP試劑盒(2414515），OpalTM7-color IHC Kit(NEL797B001KT）、 TSA Coumarin system(NEL703001KT）均購自美國PerkinElmer；抗熒光淬滅風(fēng)封片劑(I0052，北京諾博萊德科技有限公司）；PerkinElmer Vectra(Vectra 3.0.5，美國PerkinElmer）。

1.4 多重免疫熒光染色法檢測腫瘤免疫微環(huán)境指標(biāo)

將患者的肺癌組織石蠟標(biāo)本采用多重免疫熒光染色法檢測腫瘤免疫微環(huán)境中10 個指標(biāo)(CD3、CD4、CD8、CD68、CD163、FOXP3、LAG3、TIM3、PD-1、PD-L1）的蛋白表達情況，該檢測由北京臻和公司完成，檢測方法跟前期文獻[8]一致。將石蠟切片進行、脫蠟、水化、抗原修復(fù)后加入內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑室溫孵育10min，漂洗后加入封閉液室溫孵育30 min，漂洗3 次后，加入對應(yīng)一抗、二抗孵育，漂洗后用多重免疫組化試劑盒進行熒光標(biāo)記。DAPI染料復(fù)染5 min，加入抗熒光淬滅封片劑進行封片，運用PerkinElmer Vectra 進行拍照，采用inform Advanced Image Analysis 軟件進行數(shù)據(jù)分析，區(qū)分間質(zhì)區(qū)域與腫瘤區(qū)域，劃分1+、2+、3+三種陽性程度，采用組織化學(xué)評分(H 值）進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料服從正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s）表示，不服從正態(tài)分布則用中位數(shù)及下、上四分位數(shù)即M(P25～P75）描述，采用卡方檢驗及非參數(shù)檢驗方法進行分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

研究對象共69例，其中男39例，女30例；年齡41～83歲，平均(64.68 ± 8.78）歲；吸煙32 例，不吸煙37 例；周圍型肺癌50 例；中央型肺癌19 例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54 例，沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15 例；EGFR 野生型34 例，EGFR 突 變 型35 例，其中ex19del 突變14 例，L858R突變21例。

2.2 肺癌患者中醫(yī)證型分布規(guī)律

本研究有61 例患者記錄了中醫(yī)寒熱證型，其中中醫(yī)寒證34 例(55.74%）、熱證27 例(44.26%）。56 例患者記錄了中醫(yī)氣虛證、痰濕證、陰虛證、熱毒證及血瘀證證型。其中69.64%患者伴有氣虛證，67.86%患者伴有痰濕證，30.36%患者伴有熱毒證，26.79%患者伴有陰虛證，8.93%患者伴有血瘀證。其中，14 例患者僅表現(xiàn)為單一證型(25%），28 例患者(50%）伴有兩種復(fù)合證型，12 例患者伴有3 種復(fù)合證型(21.43%），2 例患者伴有4 種復(fù)合證型(3.57%），見圖1。

圖1 中醫(yī)證型分布規(guī)律Figure 1 Distribution of TCM syndrome types

2.3 中醫(yī)辨證分型與肺癌患者臨床特征的關(guān)系

收集患者的年齡、性別、吸煙史、EGFR 基因情況、淋巴結(jié)分期、TNM 分期等一般資料，結(jié)果見表1所示。中醫(yī)寒熱證型與肺癌患者的臨床特征無明顯差異，也無明顯相關(guān)性。中醫(yī)痰濕證中，男性(83.3%）比例明顯高于女性(50%），EGFR L858R 突變的患者(43.8%）明顯少于非突變患者(77.5%）。中醫(yī)氣虛證、陰虛證、熱毒證及血瘀證暫未發(fā)現(xiàn)與肺癌臨床特征有明顯的相關(guān)性。

表1 中醫(yī)辨證分型與臨床特征的關(guān)系Table 1 Relationship between TCM syndrome differentiation and clinical features

2.4 腫瘤免疫微環(huán)境與肺癌患者臨床特征的關(guān)系

收集患者的性別、吸煙史、EGFR 基因情況、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移及TNM 分期的一般資料，分析其與整個區(qū)域(W）、腫瘤區(qū)域(T）、間質(zhì)區(qū)域(S）三個區(qū)域中腫瘤免疫標(biāo)志物CD3、CD4、CD8、CD68、CD163、FOXP3、LAG3、TIM3、PD-1、PD-L1 蛋白表達水平的關(guān)系，數(shù)據(jù)見圖2。從圖中可以看出，男性患者中PD-L1 表達比例最高，其次是CD8、CD68、PD-1，均顯著高于女性(P＜0.05）。吸煙患者中PD-L1 表達比例最高，其次是PD-1、LAG3、CD163，與不吸煙患者相比，免疫標(biāo)志物蛋白水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。無EGFR 突變的肺癌患者中PD-L1也呈現(xiàn)出高表達的趨勢，其次是CD68、PD-1(P＜0.05）。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，TIM3 表達比例最高(P＜0.05）。相較于非Ⅳ期患者， Ⅳ期肺癌患者中CD8、CD68、PD-1、LAG3表達水平較高(P＜0.05）。

圖2 腫瘤免疫微環(huán)境免疫標(biāo)志物與肺癌患者臨床特征的關(guān)系Figure 2 The relationship between immune markers of tumor immune microenvironment and clinical characteristics of lung cancer patients

2.5 中醫(yī)辨證分型與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系

61 例中醫(yī)寒熱證型中，整個區(qū)域、間質(zhì)區(qū)域及腫瘤區(qū)域中腫瘤免疫微環(huán)境指標(biāo)檢測如圖3A-E所示。進一步分析腫瘤區(qū)域結(jié)果提示，相較于寒證患者，熱證患者中發(fā)揮主要的抗腫瘤作用的CD4+T 細胞(P= 0.045）及CD8+T 細胞(P= 0.024）表達水平更高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。在59 例中醫(yī)氣虛證、痰濕證、陰虛證、熱毒證及血瘀證證型中，未發(fā)現(xiàn)與免疫標(biāo)志物有明顯的差異，采用Spearman 相關(guān)進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，整個區(qū)域中PD-L1 的表達與痰濕證呈負相關(guān)(R= -0.269，P=0.047），且整個區(qū)域和腫瘤區(qū)域中痰濕證患者的PD-L1 陽性表達比例最高(圖3F）。腫瘤區(qū)域中CD8 的表達與陰虛證呈負相關(guān)(R=-0.326，P=0.014）。

圖3 肺癌患者中腫瘤免疫微環(huán)境免疫標(biāo)志物表達分布情況Figure 3 Expression distribution of immune markers in the tumor immune microenvironment in patients with lung cancer

3 討論

肺癌屬于中醫(yī)學(xué)的“咳嗽”“肺積”“肺巖”等范疇?！峨s病源流犀燭》認為“邪積胸中，阻塞氣道，氣不宣通，為痰，為食，為血，皆得與正相搏，邪既勝，正不得而制之，遂結(jié)成行而有塊?！狈伟┎C復(fù)雜多變，國醫(yī)大師周岱翰認為臟腑虛虧是腫瘤發(fā)病的先決條件，肺癌的辨證與“痰”“瘀”“虛”“毒”密切相關(guān)[9-10]。肺癌初期正氣尚足時以邪實為主，因?qū)嵵绿?，發(fā)展至中晚期時，正氣虧虛，耗氣傷陰，夾雜痰濕、血瘀、熱毒之實邪，總屬本虛標(biāo)實。目前肺癌的中醫(yī)辨證分型及辨證標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一，各醫(yī)家學(xué)者根據(jù)自身臨床經(jīng)驗進行辨證[11-13]，主要是由于肺癌常見證型以組合證型居多。自9 種(正常質(zhì)、氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、痰濕質(zhì)、濕熱質(zhì)、瘀血質(zhì)、氣郁質(zhì)和特稟質(zhì)）中醫(yī)體質(zhì)類型理論的提出，得到了廣泛認同和應(yīng)用[14]。因此，本研究一方面從八綱辨證中寒、熱統(tǒng)領(lǐng)證候分型，一方面又從肺癌患者證型中細分為常見的五個證型(氣虛證、痰濕證、陰虛證、熱毒證及血瘀證），來探討中醫(yī)辨證分型與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系。目前有研究采用診斷量表，相對量化標(biāo)準(zhǔn)，在一定程度上實現(xiàn)中醫(yī)辨證分型的客觀化，但將傳統(tǒng)中醫(yī)理論現(xiàn)代化，還需深入探索其與臨床特征、檢測指標(biāo)等客觀指標(biāo)之間的關(guān)系，明確中醫(yī)辨證分型的客觀物質(zhì)基礎(chǔ)，才能促進肺癌中醫(yī)辨證論治的規(guī)范化與標(biāo)準(zhǔn)化。

隨著腫瘤免疫治療學(xué)領(lǐng)域的深入研究，腫瘤免疫微環(huán)境已成為肺癌治療關(guān)注的焦點，以PD-1及其配體PD-L1 抑制劑為代表的免疫哨卡抑制劑的卓越療效讓人們對腫瘤免疫微環(huán)境這一靶點研究更為深入[15-16]。免疫治療體現(xiàn)的個體化“精準(zhǔn)醫(yī)療”理念與中醫(yī)的辨證論治觀念相符合，且中醫(yī)藥在提高機體免疫功能上有著不容小覷的優(yōu)勢，以腫瘤免疫微環(huán)境的角度探索中醫(yī)辨證分型與免疫標(biāo)志物的關(guān)系，明確中醫(yī)辨證分型免疫相關(guān)的客觀物質(zhì)基礎(chǔ)，有著重要意義。

近年來，在腫瘤免疫治療中，“冷”“熱”腫瘤的新觀點越來越受重視。這兩類腫瘤根據(jù)腫瘤浸潤免疫細胞的數(shù)量的多少進行區(qū)分，“熱”腫瘤浸潤更多的免疫抗腫瘤細胞，且對免疫療法更為敏感。在分析寒證與熱證患者腫瘤區(qū)域的腫瘤免疫微環(huán)境中，本研究發(fā)現(xiàn)熱證患者的CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞比例均顯著高于寒證，表明熱證患者的腫瘤周圍浸潤更多的淋巴細胞，提示中醫(yī)熱證更偏向于西醫(yī)的“熱”腫瘤。進一步分析發(fā)現(xiàn)，相較于寒證患者，中醫(yī)熱證患者腫瘤細胞上PD-L1 的陽性表達水平及周圍浸潤免疫細胞上PD-1 的陽性表達水平稍微有提高的趨勢，表明中醫(yī)熱證體現(xiàn)的“熱”腫瘤伴有PD-L1/PD-1 的陽性表達，這與研究[17]中提出的第二類PD-L1陽性表達且存在腫瘤浸潤淋巴細胞的腫瘤相近，而這類腫瘤對抗PD-1/PD-L1 免疫療法具有更好的響應(yīng)率。這些發(fā)現(xiàn)提示免疫療法對熱證患者的療效更為明顯，而對于免疫治療欠佳的患者，考慮從中醫(yī)寒熱轉(zhuǎn)化的角度指導(dǎo)臨床用藥，可能是提高免疫療法應(yīng)答率的一條新的治療思路。本研究進一步分析臨床特征與中醫(yī)辨證分型、腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，痰濕證患者中男性比例明顯高于女性，非L858R 敏感突變患者居多，腫瘤區(qū)域中PD-L1 陽性表達比例最高，免疫抑制性受體TIM3的比例相對較高，但PD-1 表達較低，表明浸潤的T 細胞中處于激活狀態(tài)的數(shù)量較少，提示中醫(yī)痰濕證患者腫瘤微環(huán)境中免疫抑制性細胞較多，可能處于免疫抑制狀態(tài)，對免疫療法的應(yīng)答率較差。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)熱證患者腫瘤組織中的CD4+T 細胞和CD8+T 細胞表達比例均顯著高于寒證患者，免疫抗腫瘤細胞較為活躍，且PD-L1/PD-1 受體的陽性表達水平較高，表明中醫(yī)寒證向熱證轉(zhuǎn)化可能提高患者對抗PD-1/PD-L1 免疫療法的響應(yīng)率。痰濕證中免疫抑制性受體PD-L1、TIM3 表達比例較高，提示痰濕證患者可能對免疫療法的應(yīng)答率較低。但由于本研究樣本量較少，還需要大樣本數(shù)據(jù)進行驗證以提供高質(zhì)量的理論依據(jù)。