肖梅仙，趙金波，王 波，匡 黎 (.十堰市國藥東風(fēng)總醫(yī)院腫瘤科，湖北 十堰 4400;.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 6000;.十堰市鄖陽區(qū)人民醫(yī)院普外一科，湖北 十堰 44500)

食管癌是世界上最致命的惡性腫瘤之一[1]，然而，與其他常見的腫瘤類型相比，近年來在食管癌治療學(xué)方面的進(jìn)展有限[2]。因此，迫切需要闡明食管癌的分子機(jī)制，以推動(dòng)治療策略的進(jìn)一步發(fā)展，尤其是為分子靶向治療和免疫治療的進(jìn)展提供理論支持。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤、基因遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)等改變?cè)谡{(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和治療中都起著關(guān)鍵作用[3]。有研究表明，腫瘤免疫逃逸與包括食管癌在內(nèi)的各種癌癥患者的臨床預(yù)后較差有關(guān)[4]。因此，分析腫瘤特征與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系有重要的臨床意義。DNA低甲基化在基因組不穩(wěn)定性中起著關(guān)鍵作用，而基因組不穩(wěn)定性反過來又會(huì)導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[5]。鑒于長散布核元件-1(long-interspersed nucleotide element-1，LINE-1)構(gòu)成人類基因組的很大一部分(約17%)[6]，其甲基化程度被認(rèn)為是全基因組DNA甲基化的替代分子標(biāo)志物。LINE-1低甲基化可導(dǎo)致食管癌進(jìn)展或預(yù)后不佳，但其具體機(jī)制仍有待闡明。因此，我們推測LINE-1低甲基化可能與食管癌患者不良預(yù)后有關(guān)，本研究通過分析食管癌組織中LINE-1低甲基化水平與低免疫狀態(tài)的關(guān)系，以闡述LINE-1甲基化作為評(píng)估食管癌患者預(yù)后分子標(biāo)志物的潛力。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

十堰市國藥東風(fēng)總醫(yī)院腫瘤科在2015～2020年共收集了107例經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的腫瘤組織樣本，并進(jìn)行存檔、福爾馬林固定及石蠟包埋，在獲取樣本前患者均未接受放射治療、化學(xué)治療、生物治療、免疫治療等抗腫瘤治療。ESCC患者的臨床病理參數(shù)從病歷和病理報(bào)告中獲得，其中男66例，女41例，中位年齡51.0歲。所有腫瘤分期均按美國聯(lián)合癌癥委員會(huì)/聯(lián)合癌癥中心(American Joint Cancer Committee/Union International Center Cancer，AJCC/UICC)分類指南[8]確定。ESCC標(biāo)本分級(jí)和組織病理學(xué)分型按照世界衛(wèi)生組織的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。本研究獲得了十堰市國藥東風(fēng)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)(2015022)，并嚴(yán)格按照《赫爾辛基宣言》的道德原則進(jìn)行。在將臨床資料用作研究前，已取得患者或家屬的知情同意。

1.2 亞硫酸氫鹽焦磷酸測序法檢測ESCC組織中LINE-1甲基化水平

從石蠟包埋組織蠟塊中取100 mg腫瘤組織，放入含有1 mL二甲苯的微量離心管中洗滌，再用乙醇溶液洗滌2次。用QIAamp DNA Mini試劑盒(德國Qiagen)提取組織基因組DNA(genomic DNA，gDNA)。利用EpiTect Bisulfite試劑盒(德國Qiagen)對(duì)600 ng gDNA樣本進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，反應(yīng)體積為40 μL。將樣品管置于熱循環(huán)儀(德國Eppendorf)中，95 ℃ 5 min，60 ℃ 25 min，95 ℃ 5 min，60 ℃ 85 min，95 ℃ 5 min，60 ℃ 175 min，20 ℃過夜，將修飾后的DNA樣品于-20 ℃保存。使用焦磷酸測序法對(duì)LINE-1基因進(jìn)行甲基化分析，反應(yīng)體積為40 μL(20 ng gDNA，1 μL PCR預(yù)混合液，1 μL引物)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并用溴化乙錠染色法進(jìn)行可視化。取18 μL PCR產(chǎn)物，用鏈霉親和素磁珠(瑞典Amersham)制備單鏈DNA模板。采用Pyro Gold試劑盒(德國Qiagen)和PyroMark ID DNA分析系統(tǒng)進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果在4個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化水平平均值計(jì)算甲基化率(圖1、表1)。進(jìn)一步分析ESCC組織中LINE-1甲基化水平與患者臨床病理特征的關(guān)系。

圖1 亞硫酸氫鹽修飾DNA中LINE-1基因的4個(gè)CpG位點(diǎn)

表1 LINE-1基因引物序列

1.3 HE染色法檢測組織學(xué)淋巴細(xì)胞反應(yīng)

取石蠟包埋組織蠟塊，連續(xù)切片后進(jìn)行HE染色，記錄組織學(xué)淋巴細(xì)胞反應(yīng)模式(缺失、低反應(yīng)、中反應(yīng)、高反應(yīng))，包括克羅恩樣淋巴反應(yīng)、瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)、間質(zhì)淋巴細(xì)胞反應(yīng)、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)反應(yīng)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色法分析腫瘤細(xì)胞分子標(biāo)志物

取切片脫蠟復(fù)水后，滴加pH 6.0抗原修復(fù)液(檸檬酸鈉)121 ℃高壓15 min進(jìn)行抗原修復(fù)。分別滴加分化簇274(differentiation cluster，CD274)初級(jí)抗體(1∶200稀釋)、吲哚胺-2,3-雙加氧酶1(indoleamine-2,3-dioxygenase 1，IDO1)抗體(1∶50稀釋)、CD8(1∶100稀釋)、FOXP3抗體(1∶200稀釋)4 ℃孵育過夜；洗去未結(jié)合抗體后，在室溫條件下滴加抗Envison+/HRP結(jié)合的二級(jí)抗體靜置30 min，蘇木素反染。使用BZX700數(shù)字顯微鏡和Keyence細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件，在腫瘤侵襲邊緣計(jì)數(shù)CD8+T細(xì)胞或FOXP3+T細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織中LINE-1甲基化水平

ESCC組織中LINE-1基因4個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化率分別為(61.76±18.70)%、(49.68±12.07)%、(67.22±14.63)%、(78.40±10.77)%，平均甲基化率為(64.27±9.72)%，中位值為63.51%(43.81%～85.10%)。

2.2 ESCC組織中LINE-1甲基化水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

ESCC組織中LINE-1甲基化水平與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)：年齡≥50歲的患者ESCC組織中LINE-1基因甲基化率低于年齡<50歲的患者；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或TNM分期Ⅲ期的患者ESCC組織中LINE-1基因甲基化率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ESCC組織中LINE-1甲基化水平與患者性別、吸煙史、飲酒史、合并基礎(chǔ)疾病、腫瘤位置、腫瘤直徑、分化程度無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 ESCC組織中LINE-1甲基化水平與患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.3 ESCC組織免疫狀態(tài)

免疫組化結(jié)果顯示，46例患者CD274表達(dá)陽性，41例IDO1表達(dá)陽性，CD8+T細(xì)胞浸潤密度為218(45～576)個(gè)/視野，F(xiàn)OXP3+T細(xì)胞浸潤密度為344(161～1025)個(gè)/視野(圖2)。

a：腫瘤組織CD274陰性表達(dá)；b：腫瘤組織CD274陽性表達(dá)；c：腫瘤組織IDO1陰性表達(dá)；d：腫瘤組織IDO1陽性表達(dá)；e：CD8+T細(xì)胞浸潤；f：FOXP3+T細(xì)胞浸潤圖2 腫瘤細(xì)胞分子標(biāo)志物和T細(xì)胞的免疫組織化學(xué)結(jié)果(×100)

2.4 ESCC組織中LINE-1甲基化水平與宿主免疫狀態(tài)的關(guān)系

ESCC組織中LINE-1甲基化水平與瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)：缺失/低瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)的腫瘤組織中LINE-1基因甲基化率低于中、高瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)的腫瘤組織(P<0.05)；但ESCC組織中LINE-1甲基化水平與CD274表達(dá)、IDO1表達(dá)、CD8+T細(xì)胞密度、FOXP3+T細(xì)胞密度、克羅恩樣淋巴樣反應(yīng)、間質(zhì)淋巴細(xì)胞反應(yīng)、TILs反應(yīng)無關(guān)(P>0.05)，見表3。

表3 ESCC組織中LINE-1甲基化水平與宿主免疫狀態(tài)的關(guān)系[例(%)]

2.5 多因素Logistic回歸分析ESCC組織中LINE-1甲基化水平與瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)系

根據(jù)ESCC組織LINE-1甲基化水平，將其由低到高分為Q1(<57.41%)、Q2(57.41%～63.51%)、Q3(>63.51%～71.83%)、Q4(>71.83%)。以是否發(fā)生瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)(賦值：缺失/低反應(yīng)=0，中反應(yīng)/高反應(yīng)=1)作為因變量，經(jīng)單因素和多因素Logistic回歸模型分析，結(jié)果顯示，ESCC組織中LINE-1低甲基化水平是缺失/低瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(Ptrend<0.001)，見表4。

表4 單因素和多因素Logistic回歸分析ESCC組織中LINE-1甲基化水平與瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)系

模型1：未校正其他臨床因素；模型2：校正了性別(男vs.女)、年齡、吸煙史(無vs.有)、飲酒史(無vs.有)、合并基礎(chǔ)疾病(無vs.有)、腫瘤位置(上段vs.中段vs.下段)、腫瘤直徑(<2 cmvs.≥2 cm)、分化程度(高、中分化vs.低、未分化)；模型3：在模型2的基礎(chǔ)上進(jìn)一步校正了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無vs.有)和TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期vs.Ⅲ期)

3 討論

我國是食管癌的高發(fā)地區(qū)之一，90%以上的食管癌患者為ESCC[9]。最近，多種免疫檢查點(diǎn)抑制劑，如細(xì)胞程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)單抗等，已用于治療一線化療失敗的晚期ESCC患者[10]。然而，與化療相比，免疫檢查點(diǎn)抑制劑在提高患者總生存率方面并不理想，這可能與患者免疫狀態(tài)有關(guān)。食管癌是基因突變率最高的惡性腫瘤類型之一，具有遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變，這些改變可影響腫瘤微環(huán)境。鑒于腫瘤部位免疫細(xì)胞的浸潤強(qiáng)度很可能是由腫瘤細(xì)胞復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)和腫瘤微環(huán)境中宿主的免疫狀態(tài)決定的，利用跨學(xué)科綜合分析對(duì)腫瘤分子特征和免疫狀態(tài)之間的關(guān)系進(jìn)行更深入的了解，將有助于開發(fā)新的免疫調(diào)節(jié)治療策略。本研究結(jié)果顯示，ESCC組織中LINE-1低甲基化水平與瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)缺失或不足有關(guān)，這可能是影響ESCC抗腫瘤免疫狀態(tài)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表觀遺傳學(xué)主要依賴于DNA甲基化和翻譯后組蛋白修飾來調(diào)節(jié)基因功能。DNA啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)等表觀遺傳學(xué)的改變被認(rèn)為是癌癥早期常見事件，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[11]。LINE-1是進(jìn)化上一個(gè)保守的超基因家族，在全基因組中占17%，LINE-1在其2個(gè)開放閱讀框ORF1p和ORF2p上起反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的作用，并可引起體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座、轉(zhuǎn)錄組效應(yīng)和DNA損傷[12]。目前已發(fā)現(xiàn)多種癌癥類型存在LINE-1基因表觀遺傳學(xué)改變，其低甲基化水平與肝癌[13]、胃癌[14]、結(jié)腸癌[15]等發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)以及預(yù)后不良有關(guān)。LNE-1甲基化是全局DNA甲基化水平的有效指標(biāo)[16]。本研究通過亞硫酸氫鹽焦磷酸測序法對(duì)石蠟包埋的ESCC組織標(biāo)本進(jìn)行LINE-1甲基化檢測，結(jié)果顯示ESCC組織中LINE-1甲基化水平與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)：年齡≥50歲、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期的患者ESCC組織中LINE-1基因甲基化率普遍較低，說明除了作為全局DNA甲基化的有效分子標(biāo)志物之外，LINE-1甲基化狀態(tài)本身可能也具有一定的生物學(xué)效應(yīng)，因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(如LINE-1元件)可以提供替代啟動(dòng)子，并促進(jìn)非編碼RNA的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄功能[17]。由LINE-1低甲基化激活的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可能在整個(gè)基因組中轉(zhuǎn)座，導(dǎo)致基因中斷和染色體不穩(wěn)定。除此以外，LINE-1也被廣泛用作老化和年齡相關(guān)疾病中全局DNA甲基化的替代分子標(biāo)志物，如與年齡相關(guān)的黃斑變性[18]，這也解釋了本研究中年齡≥50歲的患者ESCC組織中LINE-1基因甲基化率較年輕患者降低。

越來越多的證據(jù)表明，腫瘤組織中的免疫細(xì)胞水平與癌癥患者的臨床療效存在顯著相關(guān)性。例如Baba等[19]證實(shí)，腫瘤浸潤邊緣的淋巴細(xì)胞密度可以預(yù)測食管癌對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的反應(yīng)。Haruki等[20]通過對(duì)1 465例結(jié)直腸癌患者的克羅恩樣淋巴反應(yīng)、瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)、間質(zhì)淋巴細(xì)胞反應(yīng)、TILs反應(yīng)與患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行前瞻性研究，結(jié)果顯示，與缺失/低瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)患者相比，中、高瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)分別為0.55(95%CI：0.42～0.71)和0.20(95%CI：0.12～0.35)，證實(shí)組織學(xué)淋巴細(xì)胞反應(yīng)是一種獨(dú)立的大腸癌預(yù)后分子標(biāo)志物。然而食管癌的發(fā)生涉及多種致癌過程，受到不同遺傳因素、表觀遺傳學(xué)改變、飲食、微生物群及宿主免疫等的綜合影響。既往有研究證實(shí)，LINE-1低甲基化與染色體不穩(wěn)定性以及CDK6、TP53等基因的大量突變有關(guān)[21-22]。CDK6基因擴(kuò)增不僅可以促進(jìn)細(xì)胞生長，還可以通過抑制細(xì)胞內(nèi)雙鏈RNA水平來抑制腫瘤抗原的遞呈效應(yīng)。此外，TP53基因突變作為實(shí)體腫瘤中代表免疫亞型的候選基因之一，早已引起了人們的廣泛關(guān)注。鑒于這些腫瘤相關(guān)基因改變對(duì)宿主免疫的潛在修飾，可以合理地推斷，腫瘤細(xì)胞的全局DNA低甲基化可通過這些改變影響宿主的免疫狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，ESCC組織中LINE-1甲基化水平與瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)，缺失/低瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)的腫瘤組織中LINE-1基因甲基化率低于中、高瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)的腫瘤組織，這也證實(shí)了上述推斷的可靠性。

綜上，ESCC組織中LINE-1甲基化水平與患者臨床病理、分子特征有關(guān)，在控制多種潛在的混雜因素后，LINE-1低甲基化水平是ESCC組織缺失/低瘤周淋巴細(xì)胞反應(yīng)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這為進(jìn)一步研究LINE-1低甲基化和宿主免疫在食管癌發(fā)生發(fā)展中的潛在相互作用提供了證據(jù)。