余才貴 曹 省 周 佳 姜 辛 姜 楠 周 青 陳金玲

武漢大學(xué)人民醫(yī)院超聲影像科 湖北 武漢 430060

早期識(shí)別易損斑塊、預(yù)防血栓形成并及時(shí)溶栓將對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化患者預(yù)后產(chǎn)生積極影響［1］。新興的光聲/超聲雙模態(tài)成像技術(shù)具有高穿透性、高分辨率和高對(duì)比度等優(yōu)點(diǎn)，能有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)單一影像學(xué)檢查的不足［2］，其聯(lián)合多模態(tài)多功能靶向納米分子探針還可對(duì)病變部位進(jìn)行靶向分子成像并發(fā)揮靶向治療作用［3，4］，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)易損斑塊的精準(zhǔn)評(píng)估及有效治療。研究表明，活化血小板膜上的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GlycoproteinⅡb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa）受體可作為動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的成像靶點(diǎn)和預(yù)防血栓形成及溶栓的重要治療靶點(diǎn)［1，5］，故其特異性配體攜精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列環(huán)肽（Arg-Gly-Asp cyclic peptide，cRGD）可用于修飾探針表面以幫助探針在易損斑塊部位的靶向聚集并發(fā)揮成像和治療作用。本研究旨在制備一種載cRGD肽的相變型光聲/超聲雙模態(tài)納米分子探針，聯(lián)合低強(qiáng)度聚焦超聲（low-intensity focused ultrasound，LIFU）輻照，體外評(píng)價(jià)其相變性能、光聲/超聲成像效果、靶向性及生物安全性，為實(shí)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的精確識(shí)別及血栓的精準(zhǔn)防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 聲振儀（美國(guó)Fisher Scientific公司）、高速分散均質(zhì)機(jī)（T 25 digital ULTRA-TURRAX，德國(guó)IKA公司）、磁力攪拌器（浙江群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、旋渦震蕩儀、低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、正置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、激光共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、激光粒徑儀（英國(guó)Malvern公司）、Zeta電位儀（英國(guó)Malvern公司）、透射式電子顯微鏡（JEM-2100，日本電子公司）、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（英國(guó)Carl Zeiss公司）、流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫爾特公司）、Vevo LAZR光聲成像儀（加拿大Visual Sonics公司）、多探頭低聚焦超聲輻照儀（重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所研制）、彩色多普勒超聲診斷儀（荷蘭皇家飛利浦公司）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)PerkinElmer公司）、組織切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）。

1.1.2 主要試劑 羧基端聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA-COOH，乳酸與羥基乙酸聚合比例50∶50，分子質(zhì)量12 000 kU，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司）、金納米棒（gold nanorods，GNR；香港Nanoseedz公司）、二氯甲烷（中國(guó)阿拉丁公司）、全氟戊烷（perfluoropentane，PFP；北京百靈威科技有限公司）、聚乙烯醇（PVA，中國(guó)阿拉丁公司），MES緩沖液（中國(guó)阿拉丁公司）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，中國(guó)阿拉丁公司）、cRGD多肽（上海申頂生物科技有限公司）、DiI紅色熒光染料（上海源葉生物科技有限公司）、超純水、磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）、4%多聚甲醛、CCK 8試劑（日本同仁）。

1.2 方法

1.2.1 制備包裹金納米棒（GNR）和全氟戊烷（PFP）的納米分子探針（GNR-PFP）首先，采用雙乳法制備納米分子探針GNR-PFP。取25 mg PLGA-COOH，加入2 mL二氯甲烷直至充分溶解備用，取300μL GNR溶液（濃度0.1 mg/mL）并加入200μL PFP，聲振2 min（參數(shù)設(shè)置：pulse 5/5；amp 100%；120 W），得到灰色初乳液；將初乳液倒入PLGA溶液中，繼續(xù)聲振2 min（參數(shù)設(shè)置：pulse 5/5；amp 100%；120 W），得到灰白色復(fù)乳液；將復(fù)乳液中倒入5 mL 4%PVA中，高速分散均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2 min，再加入5 mL 2%異丙醇，磁力攪拌器攪拌4 h，以使二氯甲烷充分揮發(fā)，全程冰浴下進(jìn)行，獲得懸濁液用冷凍離心機(jī)以1 500 r/min冷凍離心，取上清液，再以12 000 r/min離心上清液，取沉淀，用超純水重懸洗滌，重復(fù)離心步驟3次，獲得沉淀即載GNR及PFP的納米探針（GNR-PFP）并冷藏保存。制備帶熒光的納米探針即在PLGA溶于二氯甲烷的同時(shí)加入DiI紅色熒光染料。

1.2.2 制備cRGD-GNR-PFP 采用碳二亞胺法制備cRGD-GNR-PFP。用0.1 mmol/L的MES溶液（p H=5.7）重懸已制備好的GNR-PFP，按照PLGA-COOH∶EDC∶NHS=1∶2∶1的摩爾比先后加入耦聯(lián)活化劑EDC及NHS，低溫孵育3 h，再離心、漂洗3次去除未反應(yīng)的EDC和NHS以獲得活化的GNR-PFP。將活化的GNR-PFP重懸于0.1 mmol/L的MES溶液中（p H=8.0），并按照PLGACOOH∶cRGD=1∶1的摩爾比加入cRGD多肽，低溫避光繼續(xù)孵育12 h，即獲得cRGD多肽修飾的靶向納米探針cRGD-GNR-PFP。為進(jìn)一步驗(yàn)證cRGD多肽是否連接成功，采用帶綠色熒光標(biāo)記的FITC-cRGD肽，于共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀下觀察結(jié)合情況。

1.2.3 cRGD-GNR-PFP納米分子探針的表征采用正置熒光顯微鏡連續(xù)1周每天觀察其形態(tài)大小及分布特征，掃描電鏡觀察其形態(tài)大小，采用透射電鏡觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，采用Malvern激光粒徑儀、電位儀檢測(cè)納米探針粒徑大小及電位。

1.2.4 體外觀察LIFU輻照所致相變

1.2.4.1 倒置顯微鏡下觀察相變情況 取GNRPFP 100μL分別滴于載玻片上，將載玻片放置在涂有耦合劑的低強(qiáng)度聚焦超聲探頭上，超聲頻率調(diào)至為2 000 k Hz，輸出聲強(qiáng)調(diào)至3.0 W/cm2，調(diào)制頻率調(diào)至3 000 Hz，占空比調(diào)至50%，輻照1、2及4 min后在顯微鏡下觀察納米探針的形態(tài)。

1.2.4.2 LIFU輻照所致相變超聲成像 先制備3%瓊脂糖凝膠模型，取3 g瓊脂糖粉末加入100 mL超純水，將其放置于微波爐內(nèi)加熱，攪拌均勻后導(dǎo)入模具盒中并在凝膠內(nèi)插入1.5 mL EP管，將其固定，直至凝膠冷卻凝固后將EP管拔除即獲得帶孔的凝膠模型。取1 mL納米探針置于凝膠孔內(nèi)，使用LIFU輻照，采集納米探針被輻照1、2及4 min后灰階及造影模式下的超聲圖像。

1.2.5 體外光聲成像 取適量GNR-PFP輸注至采血針管內(nèi)，注意避免氣泡產(chǎn)生，并對(duì)其進(jìn)行全波長(zhǎng)（680～970 nm）激發(fā)處理，獲取納米探針的光聲信號(hào)強(qiáng)度-波長(zhǎng)曲線，尋求最佳激發(fā)波長(zhǎng)，并在此波長(zhǎng)下對(duì)0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL不同濃度納米探針進(jìn)行光聲信號(hào)采集。

1.2.6 RGD肽與GNR-PFP連接情況檢測(cè) 于共聚焦顯微鏡下觀察GNR-PFP（DiI紅色熒光標(biāo)記）與cRGD肽（FITC綠色熒光標(biāo)記）連接情況，并取300μL已連接好的cRGD-GNR-PFP及GNR-PFP進(jìn)行流式細(xì)胞儀FITC熒光檢測(cè)以量化其結(jié)合率。

1.2.7 納米探針體外靶向性檢測(cè) 制備離體新鮮動(dòng)脈血栓，用負(fù)壓采血管收集10 mL新西蘭兔股動(dòng)脈血液，并置于37℃恒溫箱中孵育，待其形成血塊后將其切成大小均為1 cm×0.5 cm×0.5 cm的長(zhǎng)條形小塊備用，將DiI染色的cRGD-GNR-PFP溶解于PBS中，加入制備好的小血塊，37℃恒溫箱繼續(xù)孵育30 min，PBS反復(fù)沖洗血塊后用濾紙吸干，用4%多聚甲醛固定，再用OCT包埋，-20℃下進(jìn)行冰凍切片，在正置熒光顯微鏡熒光通道下觀察納米探針是否成功靶向血栓。

1.2.8 納米探針的細(xì)胞毒性檢驗(yàn) 將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）以1×104/孔接種于96孔板中孵育24 h，用濃度0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL的cRGD-GNR-PFP培養(yǎng)基替換原始培養(yǎng)基，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)立5個(gè)復(fù)孔為空白組，放入培養(yǎng)箱共孵育12 h或24 h后拿出，用PBS洗滌細(xì)胞3次，再加入10μL的CCK 8溶液，繼續(xù)孵育一段時(shí)間后用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量溶液的吸光度（A），并 根 據(jù) 細(xì) 胞 存 活 率（%）=（A納米探針-A對(duì)照）/（A納米探針-A空白）×100%計(jì)算各孔中細(xì)胞的存活率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 c RGD-GNR-PFP一般性質(zhì)所制得cRGDGNR-PFP溶液呈灰白色懸濁液（圖1A），光鏡下成圓球形，形態(tài)規(guī)則，大小分布均勻（圖1B），連續(xù)觀察1周，其形態(tài)大小穩(wěn)定，無明顯改變；掃描電鏡下可見納米探針成球型，形態(tài)規(guī)則，分布均勻（圖1C）；透射電鏡可觀察到納米探針成功包載GNR（圖1D）；激光粒徑儀檢測(cè)平均粒徑（225.87±1.56）nm（圖1E），Zeta電位值為（-9.59±0.22）mV（圖1F）。

圖1 cRGD-GNR-PFP一般性質(zhì)

2.2 LIFU輻照所致相變及超聲成像經(jīng)LIFU輻照后，倒置顯微鏡下可見納米探針粒徑明顯增大，可從納米級(jí)變成微米級(jí)，提示納米探針包載的液態(tài)氟碳發(fā)生了液氣相變，且隨著輻照時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)生相變的納米探針數(shù)量不斷增加，體積也逐漸增大，且持續(xù)輻照后納米探針可發(fā)生爆破（圖2A）。經(jīng)LIFU輻照1、2、4 min后，超聲灰階（圖2B）及造影（圖2C）模式顯示其回聲強(qiáng)度隨著輻照時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增強(qiáng)。

圖2 納米探針相變及超聲成像

2.3 體外光聲成像效果體外光聲成像顯示cRGD-GNR-PFP最佳激發(fā)波長(zhǎng)在780 nm附近（圖3A），其可產(chǎn)生紅色的光聲信號(hào)，并且隨著濃度的遞增，光聲信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（圖3B）。

圖3 納米探針光聲成像

2.4 cRGD肽與GNR-PFP連接情況激光共聚焦顯微鏡下顯示DiI標(biāo)記的GNR-PFP呈紅色，F(xiàn)ITC標(biāo)記的cRGD呈綠色熒光，兩者同時(shí)在納米微泡相同部位顯示，且可以很好地融合，并呈現(xiàn)橙黃色熒光（圖4A），說明cRGD肽與GNR-PFP成功連接。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示cRGD肽與GNR-PFP連接率達(dá)92.79%（圖4B）。

圖4 納米探針GNR-PFP連接cRGD多肽情況

2.5 納米探針體外靶向性冰切結(jié)果顯示，與cRGD-GNR-PFP（DiI標(biāo)記）共同孵育的動(dòng)脈血栓在反復(fù)沖洗后仍然可產(chǎn)生DiI紅色熒光信號(hào)（圖5），提示cRGD-GNR-PFP可以較好地靶向動(dòng)脈血栓。

圖5 正置熒光顯微鏡下納米探針靶向新鮮動(dòng)脈血栓（×10）

2.6 納米探針體外細(xì)胞毒性檢測(cè)將HUVECs分別 與 濃 度 為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL的cRGD-GNR-PFP孵育12 h和24 h后細(xì)胞存活率均＞90%，相同納米探針濃度下，孵育12 h與孵育24 h之間細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且孵育相同時(shí)間下，不同納米探針濃度孵育條件下，細(xì)胞存活率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

圖6 不同濃度納米探針及孵育時(shí)間對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）細(xì)胞存活率的影響

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊破裂、侵蝕繼發(fā)血栓形成是引發(fā)心肌梗死、缺血性卒中等心腦血管意外事件的最重要的發(fā)病機(jī)制之一［6］。然而動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展較為隱匿，其結(jié)局事件的發(fā)生往往沒有足夠顯著的先兆表現(xiàn)，且目前已有的成像技術(shù)由于各自的局限性尚無法可靠地評(píng)估斑塊的易損性［7］。因此，亟待開發(fā)一種靈敏、精確的易損斑塊檢測(cè)手段以有效避免惡性心血管事件的發(fā)生。

光聲成像是近年來逐漸興起的一種基于光聲效應(yīng)的新型生物醫(yī)學(xué)成像模式，其利用組織的光吸收差異實(shí)現(xiàn)功能成像，且具有較好的對(duì)比度［8］。隨著光聲成像的發(fā)展，光聲/超聲雙模態(tài)成像隨之開展，相較于單一成像方式，這種多模態(tài)成像可提供更加直觀、豐富的組織結(jié)構(gòu)與功能信息，并且所獲圖像的可靠性、穩(wěn)定性及容錯(cuò)能力大大提高，達(dá)到1+1＞2的效果［2］。多模態(tài)成像納米分子探針作為多模態(tài)成像技術(shù)的有力補(bǔ)充工具，近年來成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其不僅可以用于增強(qiáng)多模態(tài)成像，還可以用于疾病的無創(chuàng)治療，展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用前景［7，9］。

PLGA是目前應(yīng)用最廣泛的納米分子探針載體，PLGA具有良好的生物降解性和生物相容性，在體內(nèi)水解成的乳酸和乙醇酸均為天然人體代謝產(chǎn)物，已被美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)用于組織工程、醫(yī)用材料、藥物遞送載體等領(lǐng)域，同時(shí)，PLGA易成膜、成球及易被表面修飾，并且可以負(fù)載其他對(duì)比劑以增強(qiáng)多模態(tài)靶向成像［10］。此外，PLGA通過包載相變材料可構(gòu)建相變型納米粒，其聯(lián)合低強(qiáng)度聚焦超聲（LIFU）產(chǎn)生的空化效應(yīng)可作為一種新型溶栓手段，目前已被證明安全有效可控，可實(shí)現(xiàn)局部再通［11］。以此為思路，本研究開展以PLGA為載體制備新型光聲/超聲雙模態(tài)相變型納米分子探針以期實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的精準(zhǔn)識(shí)別及對(duì)血栓的進(jìn)一步有效防治。

本研究利用雙乳法將GNR及PFP包載于PLGA中，所制得的納米探針呈圓球型，大小均勻，分散性好，具有較好的穩(wěn)定性，平均粒徑在225 nm左右，既往研究表明200～300 nm粒徑范圍的納米探針最適合對(duì)血池中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)行分子成像，此粒徑大小可以減少納米探針被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲，從而在動(dòng)脈內(nèi)能夠停留較長(zhǎng)的時(shí)間以達(dá)到更好的診療效果［1］。本研究所制備的相變型納米探針在LIFU輻照后粒徑可由納米級(jí)變成微米級(jí)，且隨著輻照時(shí)間的延長(zhǎng)粒徑增大越明顯，這表明液態(tài)氟碳PFP被有效包載，且在LIFU輻照下發(fā)生了液氣相變，從而使GNR-PFP粒徑變大。液態(tài)氟碳是一類含氟脂肪族化合物，其種類繁多，包括PFP、全氟己烷（PFH）、全氟辛溴（PFOB）等，超聲、激光、加熱及細(xì)針注射條件下均可使其發(fā)生液氣相變，故而被廣泛用于相變型納米探針的制備［12］。既往研究表明液態(tài)氟碳被包裹成納米級(jí)顆粒后，其周圍的Laplace壓力明顯增加，氣化閾值隨之升高［4］。本研究選用沸點(diǎn)相對(duì)較低（29℃）的PFP作為納米探針內(nèi)核，納米級(jí)別下PFP相變閾值升高，故人體溫度下納米探針也能保持穩(wěn)定，且相對(duì)于包裹較高沸點(diǎn)的液態(tài)氟碳，PFP相變型納米探針聲致相變的閾值更低，進(jìn)而LIFU輻照下更易引發(fā)空化效應(yīng)，這為后續(xù)溶栓提供了保障。體外超聲成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明相變型納米探針可明顯增強(qiáng)超聲顯影，且隨著相變程度的增加顯影越發(fā)增強(qiáng)，這與相變微泡引起聲阻抗增加有關(guān)。

為達(dá)到納米探針增強(qiáng)光聲成像的效果，本研究中引入了GNR作為探針的光聲成像內(nèi)核。GNR在近紅外區(qū)具有較強(qiáng)的吸收峰及較高的光聲轉(zhuǎn)化效率，是一種優(yōu)良的光聲對(duì)比劑［13］。研究結(jié)果顯示包載GNR的納米探針能夠產(chǎn)生光聲信號(hào)，其最大吸收峰在780 nm附近，與所用的GNR吸收峰相吻合，這表明制備納米探針的其他材料并未明顯改變GNR的光學(xué)吸收特性，且隨著濃度的增加，光聲信號(hào)不斷增強(qiáng)，說明所制備的新型納米探針可以很好地用于光聲成像。本研究將GNR包載于納米探針內(nèi)以實(shí)現(xiàn)光聲/超聲雙模態(tài)顯像，該新型納米探針的成功制備有望實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)行更全面的雙模態(tài)影像學(xué)分析并提供精準(zhǔn)的信息。

在納米探針開發(fā)過程中選擇合適的分子靶點(diǎn)十分必要，可幫助實(shí)現(xiàn)從分子水平評(píng)估斑塊性質(zhì)并實(shí)現(xiàn)靶向治療。既往研究表明，血小板活化貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展及血栓形成過程，活化血小板表面上的GPⅡb/Ⅲa受體不僅與斑塊的易損性顯著相關(guān)，也是血小板聚集和血栓形成的必經(jīng)通道［1，5］。cRGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列的環(huán)肽，可作為配體與活化血小板上的GPⅡb/Ⅲa受體特異性結(jié)合［14］。故本研究采用GPⅡb/Ⅲa受體的特異性配體cRGD肽對(duì)非靶向納米探針進(jìn)行表面修飾，以求所制備的cRGD納米分子探針可以對(duì)易損斑塊進(jìn)行靶向成像，又可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制纖維蛋白原和GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合，從而阻斷血小板聚集及預(yù)防血栓形成，而對(duì)于已形成的血栓又可進(jìn)行靶向溶栓。共聚焦顯微鏡下可以看出cRGD多肽已被成功連接到納米探針上，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果提示連接率高達(dá)90%以上，較高的連接率保證了后續(xù)納米分子探針能夠一定程度上抵抗動(dòng)脈血流的剪切力從而有效靶向易損斑塊。體外靶向?qū)嶒?yàn)也表明所制備的新型靶向納米分子探針對(duì)新鮮動(dòng)脈血栓具有靶向功能。此外，本研究對(duì)新型納米分子探針進(jìn)行了細(xì)胞毒性檢測(cè)，在一定濃度范圍內(nèi)，無論孵育12 h還是24 h及不同納米探針濃度之間細(xì)胞存活率均在90%以上，表明所制備新型納米分子探針具有良好的生物安全性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功制備了一種載cRGD肽相變型納米分子探針，其具備良好的超聲和光聲成像能力，并能在超聲輻照下發(fā)生相變?nèi)芩?，為今后易損斑塊的準(zhǔn)確診斷及血栓的防治奠定了良好基礎(chǔ)。然而本研究尚存在局限性，盡管本研究為體外實(shí)驗(yàn)部分，但是對(duì)于所制備的新型納米分子探針的性能還未探索完全，如尚未探索光聲輻照下納米分子探針的相變效果、相變與光聲信號(hào)之間關(guān)系及新型納米分子探針體外的溶栓效能，需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步完善。