陳文麗 鄭 芳 干學(xué)東

1湖北省浠水縣人民醫(yī)院心內(nèi)科 湖北 黃岡 438200；2武漢大學(xué)中南醫(yī)院心內(nèi)科 湖北 武漢 430071

膿毒癥是由細(xì)菌感染、手術(shù)、創(chuàng)傷等引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致器官衰竭或死亡［1，2］。研究表明，腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細(xì)胞介素（IL）-1β等炎癥因子通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞的過度激活、分化以及刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8等其他炎癥因子，從而對心肌產(chǎn)生負(fù)性作用，導(dǎo)致膿毒癥心肌損傷［3］。據(jù)報道，心肌損傷與膿毒癥患者的高死亡率密切相關(guān)［4］。因此，闡明膿毒癥誘導(dǎo)心肌損傷的發(fā)病機(jī)制對其今后的防治具有重要意義。

長鏈非編碼RNA（long non coding RNA,lncRNA）是一類長度大于200個核苷酸、不被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA，盡管缺乏蛋白質(zhì)編碼功能，lncRNA依然可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而參與多種疾病的進(jìn)展［5，6］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，多種類型lncRNA廣泛參與了心肌損傷的進(jìn)展。

小核仁RNA宿主基因20(small nucleolar RNA host gene 20，SNHG20)是位于17q25.2的lncRNA，長度為2 183 bp。前人的研究已證實(shí)，SNHG20參與了多種病理過程。在本研究中，我們構(gòu)建了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的膿毒癥心肌損傷模型，發(fā)現(xiàn)SNHG20在LPS的誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)，同時LPS還以劑量和時間依賴性的方式抑制了miR-140-5p的表達(dá)。通過敲低SNHG20在LPS誘導(dǎo)的心肌損傷的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)顯著減弱。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p是SNHG20和Toll樣受體4（TLR4）的靶點(diǎn)。由此我們推測，在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥心肌損傷模型中，SNHG20可以通過抑制miR-140-5p調(diào)控TLR4/核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。這將從分子層面為膿毒癥介導(dǎo)的心肌損傷的臨床治療提供一些新的參考思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染H 9C2心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞中心（中國上海）。細(xì)胞用含10%胎牛血清（fetalbovineserum，F(xiàn)BS；Thermo Fisher Scientific，MA，USA）和1%青霉素/鏈霉素（Invitrogen，CA，USA）的RPMI1640（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）培養(yǎng)液、置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞的對數(shù)生長期采用0.25%胰 蛋 白 酶（Thermo Fisher Hy Clone，Utah，USA）進(jìn)行消化傳代。

靶向SNHG20的過表達(dá)質(zhì)粒（SNHG20），低表達(dá)質(zhì)粒（Si-SNHG20）及其相應(yīng)的陰性對照（vector和Si-NC），miR-140-5p模擬物（miR-140-5p mimic），miR-140-5p抑制劑（anti-miR-140-5p）和陰性對照miR-NC由廣州復(fù)能基因有限公司設(shè)計并合成。處于對數(shù)生長期的H 9C2細(xì)胞接種在24孔培養(yǎng)板中（5×105/孔）中。待細(xì)胞生長穩(wěn)定，采用Lipofectamine 2000（Invitrogen，中國上海）將上述表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中。

1.2 CCK 8法取對數(shù)生長期的H 9C2細(xì)胞，使用胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度至2×103/mL后，接種于96孔板，每孔100μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)3個復(fù)孔。然后采用CCK 8試劑盒（Beyotime Biotechnology，中國上海）檢測細(xì)胞活性［以450 nm波長下的光密度（OD）值表示］。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡H 9C2細(xì)胞在不同因素處理完畢后，用胰酶消化液消化細(xì)胞，通過離心（1 500 r/min，3 min）收集細(xì)胞。所得細(xì)胞按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海澤葉生物試劑公司，中國，貨號：ZY 140626）說明書步驟操作。

1.4 q RT-PCR用TRIzol試劑從H 9C2細(xì)胞中提取總RNA。根據(jù)制造商的說明書，RNA用PrimeScript?RT Reagent kit（Invitrogen，Shanghai，China）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR采用Bio-Rad CFX96定量PCR系統(tǒng)和SYBR，按廠家規(guī)程進(jìn)行。β-actin用于檢測的SNHG20、TLR4、IL-6、IL-1β、TNF-α的內(nèi)參，U6為檢測miR-140-5p的內(nèi)參。采用2（-ΔΔCt）方法進(jìn)行統(tǒng)計。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列見表1。

表1 各基因的引物序列

1.5 Western Blot收集H 9C2細(xì)胞，并用冷PBS清洗3次，加入100～200μL RIPA裂解液（Beyotime Biotechnology，中國上海），在冰水中超聲裂解細(xì)胞，采用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。各組取等量蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore，Bedford，MA，USA）上。膜在4℃封閉1 h，加入一抗（濃度為1∶1 000）Anti-p-NF-κB p65 antibody（ab28849），Anti-NF-κB p65 antibody（ab7549），Anti-Caspase3 antibody（ab13847），Anti-Bcl2 antibody（ab182858），Anti-TLR4 antibody（ab13556），Anti-β-actin antibody（ab6276），4℃過夜。再用TBST洗膜2次后，在室溫下，與熒光素標(biāo)記的二抗羊抗兔（ab205718，1∶2 500）室溫孵育1 h，以上抗體均來自Abcam，Cambridge，UK）洗膜3次后即用ECL顯色劑（Millipore，Bedford，MA，USA）曝光。

1.6 雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)野生型SNHG20、TLR4及突變型SNHG20、TLR4的目的片段被構(gòu)建 并 整 合 入pGL3 vector（Promega，Madison，WI，USA）以構(gòu)建pGL 3-SNHG20-wild type（SNHG20-WT）、pGL 3-TLR4-wild type（TLR4-WT）以 及pGL 3-SNHG20-mutant（SNHG20-MUT）、pGL 3-TLR4-mutant（TLR4-MUT）reporter vector。將SNHG20-WT、TLR4-WT或SNHG20-MUT、TLR4-MUT與miR-140-5p或陰性對照物共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，按照制造商的說明測定熒光素酶活性。所有實(shí)驗(yàn)一式三份，重復(fù)3次。

1.7 RNA免疫共沉淀（immune-precipitation，RIP）按照制造商的規(guī)程，使用Magna RIP RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒進(jìn)行RIP分析（Millipore，Bedford，MA，USA）。收集處于80%匯合階段的心肌細(xì)胞，并使用RIP裂解緩沖液裂解。然后，使用抗Ago2抗體（Abcam，Shanghai，China）進(jìn)行Ago2免疫沉淀，并將免疫球蛋白G（IgG）抗體用作陰性對照。最后，分離出免疫沉淀的RNA，并通過qRTPCR分析結(jié)合部分中的miR-140-5p、SNHG20、TLR4的豐度。

1.8 數(shù)據(jù)分析本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行分析；計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，如果組間均數(shù)有差異，采用Newman-Keuls方法進(jìn)行組間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂多糖促進(jìn)了SNHG20的表達(dá)并抑制了miR-140-5p的表達(dá)為了研究LPS處理對SNHG20和miR-140-5p表達(dá)的影響，我們使用不同濃度（0、25、50、100、150μg/mL）的LPS處理H 9C2心肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞暴露于100μg/mL的LPS中不同時間（6、12、24、48 h）。采 用qRT-PCR實(shí) 驗(yàn) 檢 測SNHG20和miR-140-5p表達(dá)，結(jié)果顯示，LPS以劑量和時間依賴性地方式促進(jìn)了SNHG20的表達(dá)（P＜0.05，圖1A、1B）。相反，LPS以劑量和時間依賴性的方式抑制了miR-140-5p的表達(dá)（P＜0.05，圖1C、1D）。這表明，SNHG20和miR-140-5p可能和LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞進(jìn)展有關(guān)。

圖1 LPS對SNHG20和miR-140-5p表達(dá)的影響

2.2 敲低SNHG20減弱了LPS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷為了分析SNHG20在LPS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的潛在功能，我們采用si-RNA下調(diào)心肌細(xì)胞中SNHG20的水平（P＜0.05，圖2A）。在H 9C2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染SNHG20敲低質(zhì)粒以及它的陰性對照并采用LPS（100μg/mL）作用于H 9C2細(xì)胞24 h。CCK8的結(jié)果顯示LPS的處理顯著抑制了細(xì)胞活力，而這種效應(yīng)被SNHG20敲除減弱（P＜0.05，圖2B）。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，暴露于LPS的心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加，而這種變化被SNHG20敲除顯著削弱（P＜0.05，圖2C）。Western Blot的結(jié)果也顯示，LPS顯著促進(jìn)了促凋亡蛋白Caspase3的表達(dá)并抑制了抑凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)。而與LPS+Si-NC組比較，敲低SNHG20后結(jié)果則相反（P＜0.05，圖2D）。進(jìn)一步通過qRT-PCR檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，發(fā)現(xiàn)LPS顯著促進(jìn)了上述因子的表達(dá)，而這種效應(yīng)被SNHG20敲除顯著削弱（P＜0.05，圖2E）。由此可見，LPS誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞損傷，而敲低SNHG20則減弱了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

圖2 敲低SNHG20減弱了LPS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

2.3 SNHG20靶向miR-140-5p通過Starbase數(shù)據(jù)庫（http：//starbase.sysu.edu.cn/）我們發(fā)現(xiàn)miR-140-5p與SNHG20的結(jié)合位點(diǎn)如圖3A所示。為進(jìn)一步明確miR-140-5p與SNHG20之間的關(guān)系，我們實(shí)施了雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)和RIP法。結(jié)果顯示，miR-140-5p mimic顯著抑制了轉(zhuǎn)染SNHG20-WT載體的細(xì)胞的熒光素酶活性，而對轉(zhuǎn)染SNHG20-MT載體的細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著影響（P＜0.05，圖3B）。此外，RIP結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimic的細(xì)胞中可以富集到更多的SNHG20（P＜0.05，圖3C）。這表明，miR-140-5p是SNHG20的靶點(diǎn)。我們進(jìn)一步在轉(zhuǎn)染SNHG20過表達(dá)質(zhì)?；騍NHG20敲低質(zhì)粒的H 9C2心肌細(xì)胞中檢測miR-140-5p的表達(dá)以分析SNHG20對miR-140-5p表達(dá)的影響。如圖3D所示，SNHG20敲低顯著增加了miR-140-5p的表達(dá)，而過表達(dá)SNHG20則降低了miR-140-5p的表達(dá)。有趣的是，我們還發(fā)現(xiàn)miR-140-5p負(fù)調(diào)節(jié)SNHG20的表達(dá)（P＜0.05，圖3E）。這表明，SNHG20直接與H 9C2心肌細(xì)胞中的miR-140-5p相互作用并下調(diào)其表達(dá)。

圖3 SNHG20靶向抑制了miR-140-5p的表達(dá)

2.4 miR-140-5p下調(diào)了TLR4-NF-κB通路為了研究LPS處理對TLR4表達(dá)的影響，我們在LPS誘導(dǎo)的H 9C2心肌細(xì)胞中檢測了TLR4的相對基因水平，結(jié)果表明，LPS以劑量和時間依賴性地方式促進(jìn)了TLR4的表達(dá)（P＜0.05，圖4A、4B）。Western Blot的結(jié)果也顯示，在LPS誘導(dǎo)的H 9C2心肌細(xì)胞中TLR4-NF-κB的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05，圖4C）。通過Starbase數(shù)據(jù)庫（http：//starbase.sysu.edu.cn/）我們發(fā)現(xiàn)miR-140-5p與TLR4的結(jié)合位點(diǎn)如圖4D所示。為進(jìn)一步明確miR-140-5p與TLR4之間的關(guān)系，我們實(shí)施了雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)和RIP法。結(jié)果顯示，miR-140-5p mimic顯著抑制了轉(zhuǎn)染TLR4-WT載體的細(xì)胞的熒光素酶活性，而對轉(zhuǎn)染TLR4-MT載體的細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著影響（P＜0.05，圖4E）。此外，RIP結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimic的細(xì)胞中可以富集到更多的TLR4（P＜0.05，圖4F）。這表明，miR-140-5p是TLR4的靶點(diǎn)。接著，為了研究miR-140-5p對TLR4表達(dá)的影響，我們進(jìn)一步在轉(zhuǎn)染miR-140-5p模擬物或miR-140-5p抑制劑的H 9C2心肌細(xì)胞中檢測TLR4的表達(dá)（圖4G）。如圖4H和4I所示，miR-140-5p敲低顯著增加了TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)，同時NF-κB的磷酸化水平顯著增加。而轉(zhuǎn)染miR-140-5p模擬物結(jié)果則完全相反。因此，miR-140-5p通過靶向TLR4的3'UTR下調(diào)了TLR4-NF-κB的表達(dá)。

圖4 miR-140-5p下調(diào)了TLR4-NF-κB通路

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SNHG20在膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷中顯著上調(diào)；SNHG20還通過miR-140-5p/TLR4/NF-κB軸調(diào)控膿毒癥介導(dǎo)的心肌損傷。

膿毒癥介導(dǎo)的心肌損傷進(jìn)展迅速，常常伴隨全身多器官功能障礙。其中，炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞損傷是其核心因素之一［7，8］。TLR4是Toll樣受體家族的重要成員，其在病原體識別和天然免疫活化中發(fā)揮重要功能。一般來說，TLR4識別位于感染源中的病原體相關(guān)分子模式，隨后產(chǎn)生細(xì)胞因子并發(fā)揮有效的免疫調(diào)節(jié)［9］。而來源于革蘭陰性細(xì)菌體內(nèi)的脂多糖，已經(jīng)被證實(shí)可以通過激活TLR4在機(jī)體中發(fā)揮顯著的促炎效應(yīng)［10］。此外，在膿毒癥介導(dǎo)的TLR4通路激活后，通過MyD88依賴和非依賴的途徑誘導(dǎo)炎癥活化，最終產(chǎn)生大量的炎癥因子［11，12］。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可以通過調(diào)控膿毒癥介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)減弱器官損傷。例如，研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA LINC00472在膿毒癥介導(dǎo)的急性肝損傷中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)LINC00472可通過調(diào)節(jié)miR-373-3p/TRIM 8軸改善膿毒癥誘導(dǎo)的AHI［13］。此外，lncRNA NEAT 1通過調(diào)節(jié)miR-144-3p/NF-κB信號通路調(diào)控膿毒癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，為膿毒癥治療的研究提供新的理論基礎(chǔ)［14］。之前的研究顯示，lncRNA SNHG20在神經(jīng)膠質(zhì)瘤［15］、乳腺癌［16］等癌癥的進(jìn)展中有重要作用，然而關(guān)于其在炎癥相關(guān)性疾病中的研究還未涉及。鑒于諸多LncRNA在炎癥損傷中的重要價值，lncRNA SNHG20又是LncRNA大家族的重要一員，因此我們大膽猜測SNHG20也參與了炎癥疾病進(jìn)展。令人驚喜地是，在本研究中，我們通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，SNHG20在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中顯著上調(diào)。體外研究也表明，敲低SNHG20顯著減弱了心肌細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)了細(xì)胞活力。由此可見，敲低SNHG20可以通過抑制炎癥反應(yīng)、改善心肌損傷。

miR-140-5p是miRNA中的一員，具有多種細(xì)胞生物學(xué)功能。Su等［17］在2020年的報道中指出，miR-140-5p通過阻斷TLR4/NF-κB通路保護(hù)HK-2細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的腎臟損傷。除此之外，miR-140-5p和miR-146a的協(xié)同功能通過靶向TLR4/NF-κB信號傳導(dǎo)，對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生具有很強(qiáng)的保護(hù)作用［18］。在急性肺損傷中，miR-140-5p通過TLR4/My D88/NF-κB信號通路抑制了其炎癥反應(yīng)［19］。這些研究表明，miR-140-5p通過TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮了顯著的抗炎能力。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-140-5p是SNHG20和TLR4的靶向miRNA。在功能上，miR-140-5p在LPS誘導(dǎo)的心肌損傷中顯著下調(diào)并受到SNHG20的抑制，敲低miR-140-5p一方面顯著促進(jìn)了TLR4/NF-κB通路的活化和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，另一方面還可以增強(qiáng)由SNHG20低表達(dá)引起的心肌損傷和炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)敲低miR-140-5p可以通過TLR4/NF-κB通路促進(jìn)炎癥反應(yīng)介導(dǎo)心肌細(xì)胞的損傷。

總之，在膿毒癥介導(dǎo)的心肌損傷中，上調(diào)的SNHG20可以作為競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）吸附miR-140-5p，進(jìn)而導(dǎo)致TLR4/NF-κB通路的活化，后者則通過產(chǎn)生大量的促炎癥細(xì)胞因子加重心肌損傷。本研究揭示了膿毒癥心肌損傷的發(fā)病機(jī)制，為膿毒癥心肌損傷的治療帶來了新的參考依據(jù)。