張定煌，朱 嫡，李擁軍，蘇增強，李 杰，賀鴻志*

(1.中山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗所，廣東中山 528400；2.華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，廣東廣州 510000；3.清遠職業(yè)技術(shù)學院，廣東清遠 511500)

鎘(Cd)污染治理是當前國家的重大需求，國內(nèi)外研究表明微藻可能在Cd污染水體處理方面具有很大潛力。固氮藍藻是熱帶亞熱帶地區(qū)重要的微生物資源，自從1889年Franck發(fā)現(xiàn)了固氮藍藻，到20世紀末期已得出20多個屬的150多種藍藻具有固氮能力。我國記載了800多種藍藻，其中有固氮能力的就有70多種。且我國很早就有將固氮藻類中的葛仙米和發(fā)菜等作為食品和藥物使用的記載，已經(jīng)成了價格高昂的保健食品。研究表明稻田中接種固氮藍藻可顯著增產(chǎn)，如在湖北晚稻田中測得其固氮量為22.5～37.5 kg/hm。隨全球變暖和水體富營養(yǎng)化日益嚴重，固氮藍藻的農(nóng)業(yè)應用和生態(tài)價值將日益凸顯。同時，研究表明固氮藍藻在生物活性物質(zhì)發(fā)掘、新能源開發(fā)、功能食品研制和環(huán)境保護等方面均具有重要的應用前景。固氮藍藻蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成完全，含有豐富的維生素和微量元素，在生長繁殖過程中還可分泌出少量的氨基酸、激素等活性物質(zhì)促進作物生長。固氮藍藻還可以用于環(huán)境污染修復，并已有利用藻菌結(jié)合體清除石油污染的報道。一些固氮藍藻可以用于水體營養(yǎng)物質(zhì)和重金屬的去除。同時，固氮藍藻還具有修復水體農(nóng)藥和染料等污染的潛力。已有很多利用篩選到的固氮藍藻結(jié)合固定化技術(shù)進行了應用技術(shù)方面的探索。另外，在我國西北地區(qū)絲狀固氮藍藻已被用于荒漠和鹽堿化土壤治理中，并獲得了不錯的效果。

國內(nèi)已有對湖北、湖南、江西、北京、延邊、西北荒漠區(qū)等地的固氮藍藻資源的調(diào)查研究，并分離純化了不少固氮藻株，但關于廣東、廣西、海南等省份固氮藍藻的研究非常少?，F(xiàn)在中國科學院武漢水生生物研究所藻種庫保存的藻種主要來自湖北、湖南和江西等亞熱帶地區(qū)，可以預見屬熱帶、亞熱帶的海南、廣東、廣西部分地區(qū)必定有不少的固氮藍藻種質(zhì)資源待發(fā)掘，甚至可能會有某些特殊功能的種類存在。筆者從中山實驗田采集土樣、水樣，然后經(jīng)過紫外線法、抗生素法將其純化為單一藻株，鑒定出藻種為念珠藻，通過重金屬Cd對念珠藻的急性試驗，評估Cd對念珠藻的生態(tài)毒理效應，研究其對鎘的耐受能力和去除能力。

1 材料與方法

試驗所用固氮藍藻培養(yǎng)基為無氮BG11(BG11)。除培養(yǎng)基以外，所用的藥品還包括乙醇、(1+1)鹽酸溶液、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸氫二鈉、硼砂、氯化鉀、pH=4.01 標準緩沖溶液、pH=6.87 標準緩沖溶液、pH=9.18標準緩沖溶液、20 mg/L的鎘溶液。

100 mL錐形瓶、50 mL錐形瓶、分光光度計、TOC 分析儀、往復式振蕩器、磁力攪拌儀、光照培養(yǎng)箱、微孔濾膜、離心管、試管、燒杯、滴管、移液槍(20 μL、200 μL、1 000 μL、5 mL)、電子天平、4 ℃冰箱、-40 ℃冰箱、比色皿、各種規(guī)格培養(yǎng)皿、酒精燈、接種環(huán)、高壓滅菌鍋、帶相機和視頻攝像頭的Olympus倒置顯微鏡、低溫高速離心機、凍干機、超凈工作臺、抽濾裝置、純水機、酸度計。

藻的富集培養(yǎng)。將從中山實驗田采集回來的土樣、水樣取少量放入100 mL錐形瓶中，分別加入40 mL無氮BG11培養(yǎng)基放在恒溫培養(yǎng)箱中進行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(27±1)℃、光照(2 700±50)lx、光暗比16 h∶8 h。

藻株分離。培養(yǎng)20 d后，將富集培養(yǎng)的藻樣用移液器移取20～50 μL涂布于含BG11的瓊脂固體平板上。等長出肉眼可見的藻后，用接種環(huán)小心挑取，在新的固體培養(yǎng)基上Z字形劃線轉(zhuǎn)接，重復此操作直到純化出單一藻種為止。分離方法：在超凈工作臺內(nèi)，將接種環(huán)在酒精燈上灼燒，接種環(huán)除菌后蘸取少許待純化藻類，在無菌BG11固體培養(yǎng)基表面進行平行劃線、扇形劃線或Z字劃線的連續(xù)劃線，用無菌的Parafilm對培養(yǎng)皿進行封口，放在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，用以分離出單個菌落。待長出單個菌落后，在顯微鏡下觀察藻的形態(tài)、細胞結(jié)構(gòu)，看是否為單一藻株，若不是單一藻株，再采用相同的方法或者毛細管分離法、梯度稀釋法進行分離，直至找到單一藻株。

藻種純化。用抗生素、抗菌酮等處理，除菌、純化藻株，具體步驟為先分別在5個50 mL 錐形瓶中加入BG11培養(yǎng)液 20 mL，經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后，冷卻，在超凈工作臺接種2 mL藻株在50 mL錐形瓶中；同時配制氨芐青霉素、硫酸慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素4 種抗生素的混合濃縮液共10 mL，濃度均為 2 g/L，在超凈工作臺中用無菌的一次性過濾頭和針筒過濾混合液，裝在預先滅菌的玻璃錐形瓶中；然后分別取2 g/L的混合抗生素母液10、8、6、4、2 μL加至上述含BG11培養(yǎng)液20 mL的5個50 mL錐形瓶中，處理 3 d。3 d后離心機15 ℃、7 000 r/min離心7 min，棄去上清液，隨后沉淀用無菌水離心清洗3 次，劃平板，用封口膜封口，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。重復上述操作直至通過顯微鏡觀察不到明顯的菌生長。藻株的保存采用固體培養(yǎng)基斜面或平板保種(常溫或低溫)和液體培養(yǎng)基保種相結(jié)合的方法。

藻株的擴大培養(yǎng)。在1個 50 mL錐形瓶中加入BG11培養(yǎng)液20 mL，經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后，冷卻，在超凈工作臺中用接種環(huán)從分離純化后的固氮藍藻培養(yǎng)皿中刮取少量藻株接種到上述錐形瓶中，確保要刮取到藻，然后放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時搖瓶4～6 次。

采用分子生物學方法對藍藻進行鑒定，通過選擇有代表性的基因序列片段作為分類標準來區(qū)分不同生物、同種生物種內(nèi)株系之間的遺傳差異，此方法操作容易、結(jié)果可靠。

將篩選出來的優(yōu)良藻株用16S rDNA序列分析法進行鑒定，即用一對引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和 1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)進行PCR擴增，通過測序確定16S rDNA序列，再通過 Genebank 進行 Blast 比較分析確定藻株所屬的屬。在此基礎上，用兩對引物CX(5′-GGCGCAGGTAAGAAAGGGTTTCGTA-3′)、CW(5′-CGTAGCTTCCGGTGGTATCCAC GT-3′)對固氮藍藻基因進行擴增和測序。通過 Blast比較分析進行藻種鑒定。

取8個50 mL錐形瓶，每個瓶中裝20 mL的BG11培養(yǎng)基。向錐形瓶中加入不同體積Cd母液(20 mg/L)，使瓶中Cd最終濃度分別為0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600和0.800 mg/L。每個瓶中再加入2 mL培養(yǎng)到對數(shù)生長期的藻種液。培養(yǎng)4 d后在超凈工作臺取3 mL均勻藻液測OD值，并觀察藻細胞的變化。

取100 mL錐形瓶，每個瓶裝40 mL的BG11培養(yǎng)基。向錐形瓶中加入不同體積Cd母液(20 mg/L)，使Cd最終濃度分別為0.1和0.2 mg/L。每個瓶中再加入2 mL培養(yǎng)到對數(shù)生長期的藻種液。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24和48 h后取樣抽濾，然后用原子吸收法進行Cd濃度的測定。

取正常生長和0.2 mg/L Cd處理4 d后的藻液高速離心收集藻細胞，用凍干機進行凍干。干燥后的樣品用傅立葉變換紅外光譜儀(Thermo Scientific Nicolet IS50，美國)進行紅外光譜分析。

采用溴化鉀壓片法，取干藻樣1.5 mg與0.3 g干燥的KBr粉末一起研細，研磨充分后，將樣品壓成薄片后進行測定。

試驗結(jié)果用 Excel 軟件(2013 版)進行處理，再利用 SPSS 22.0 中的多因素方差分析(ANOVA)對測定項目的試驗結(jié)果進行方差分析，Duncan’s 檢驗(<0.05)比較各處理間差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

無氮 BG11 培養(yǎng)基預培養(yǎng)富集后，綜合采用多種分離方法，獲得固氮藍藻的單種培養(yǎng)，最后經(jīng)多種抗生素聯(lián)合處理得到無菌藻株。純化后藻絲形態(tài)見圖1，由圖1可知，在10×100倍鏡下，藻絲長，藻細胞飽滿，具異形胞，異形胞間生，從形態(tài)看屬于念珠藻目藻株(該試驗命名為藻D)。

圖1 分離得到的一株具有異形胞的念珠藻Fig.1 A strain of nostoc with heterocysts isolated

對藻細胞16S rDNA和基因序列進行分析，通過Genebank進行Blast比較分析確定藻株所屬的屬。Blast比對結(jié)果見表1。根據(jù)16S rDNA序列Blast結(jié)果，藻D屬于念珠藻屬。而基因序列Blast結(jié)果表明藻D與sp.NIES-2111親源關系最近，同源性達到97%。

表1 藻株的16S rDNA序列和rbcLX基因序列的Blast比對結(jié)果

對藻形態(tài)的影響。不同Cd濃度條件下生長的藻D的細胞形態(tài)如圖2所示。由圖2可知，在Cd濃度為0.200 mg/L時，藻絲開始斷裂，并出現(xiàn)扭曲，在Cd濃度為0.600 mg/L時，念珠藻細胞被破壞的更加嚴重，且顏色變淡。

圖2 不同Cd濃度下生長的藻D在顯微鏡下的微觀形態(tài)Fig.2 Microscopic morphology of algae D grown under different Cd concentrations

對藻生長的影響。培養(yǎng)4 d后藻的OD測定結(jié)果見表2。由表2可知，低濃度Cd(0.025 mg/L)顯著促進藻生長；0.050～0.100 mg/L沒有顯著毒害作用，超過0.200 mg/L時顯著抑制藻生長，說明Cd對藻具有低促高抑的作用。通過抑制率與Cd濃度作圖，按線性回歸曲線計算可得出Cd對藻D的半致死濃度(EC)為0.205 mg/L，毒性較高。

表2 藻對鎘耐受能力評估試驗結(jié)果

由表3可知，在24 h時藻D對Cd的吸附可能已經(jīng)達到平衡，此時Cd被藻D吸附的最多，隨著時間的增加，有的藻已經(jīng)死亡，然后又釋放出部分Cd，所以Cd濃度增加。Cd初始濃度0.200 mg/L處理時，藻D在24 h對Cd的去除率達到最大(33.79%)。

表3 藻對Cd的去除效果

由圖3可知，在0.200 mg/L鎘的脅迫下，藻D的C—H(2 960～2 850 cm)、C==O(1 690～1 650 cm)和—NH(3 500～3 300 cm)等基團吸收峰明顯比對照降低，推測鎘與藻細胞中的部分基團結(jié)合。

圖3 Cd對藻紅外光譜的影響Fig.3 Effect of Cd on the infrared spectrum of algae

3 結(jié)論與討論

已有研究表明，影響藻類吸附重金屬離子的因素有很多，主要包括微藻濃度的大小、微藻本身的細胞結(jié)構(gòu)、光照、溫度、pH、鹽度、重金屬濃度、試驗時間等。該試驗中主要研究了重金屬Cd的濃度為0.100和0.200 mg/L，試驗時間為24和48 h的條件下，該藻對Cd的吸附能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當試驗時間為24 h、Cd濃度為0.200 mg/L時，該念珠藻對Cd的去除能力最強，去除率達到33.79%。已有研究表明，斜生柵藻對Cd的吸收能力最高，單位吸收率可達76.9%。由此可見，該念珠藻對Cd的吸附能力相對較弱，今后應進一步分離純化篩選Cd去除能力更強的藻株。

微藻對重金屬的吸附是一個復雜的物化和生化過程，是多種機理共同協(xié)作的結(jié)果，主要包括絡合機理和離子交換機理。藻類富含生化和礦物組分，尤其是一些官能團，如—OH、—COOH、—SH、—POO和—NH等在吸附過程中發(fā)揮很大的作用。根據(jù)該試驗紅外光譜數(shù)據(jù)顯示，在0.200 mg/L鎘的脅迫下，念珠藻D的C—H、C==O和—NH等基團吸收峰明顯比對照降低，所以認為吸附過程還有其他官能團的參與，但是此次試驗無法確定是哪些官能團，有待進行更深入的研究?，F(xiàn)有研究表明，低濃度的Cd對藻的生長具有促進作用，高濃度的Cd具有抑制藻生長的作用。此次試驗結(jié)果顯示，低濃度Cd(0.025 mg/L)顯著促進藻生長；0.050～0.100 mg/L沒有顯著毒害作用；超過0.200 mg/L時顯著抑制藻生長，說明Cd對藻具有低促高抑的作用。

該研究用分子手段分析結(jié)果表明藻D與sp.NIES-2111親源關系最近。Cd毒性試驗結(jié)果Cd對藻D的EC值為0.205 mg/L，屬于高毒性。在0.200 mg/L的Cd的脅迫下，藻D的C—H、C==O和—NH發(fā)生改變，說明該藻對Cd的去除能力相對較弱，今后應進一步分離純化篩選對Cd去除能力更強的藻株。