王瑾玉，王燕平，熊 楓，王廣軍，賈術(shù)永，宋曉晶，王淑友，谷淑雅，張維波

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029；2.中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所,北京 100700)

中醫(yī)經(jīng)絡(luò)的科學(xué)內(nèi)涵是針灸基礎(chǔ)研究的重大科學(xué)問題?，F(xiàn)代經(jīng)絡(luò)研究在20世紀中葉正式起步，多學(xué)科介入經(jīng)絡(luò)研究，發(fā)現(xiàn)了一批經(jīng)絡(luò)現(xiàn)象[1]。張維波[2-3]在總結(jié)這些經(jīng)絡(luò)現(xiàn)象及解析中醫(yī)古典文獻經(jīng)絡(luò)氣血概念的基礎(chǔ)上提出了經(jīng)絡(luò)的間質(zhì)通道學(xué)說，認為經(jīng)絡(luò)是存在于間質(zhì)中、具有低流阻特性的組織液通道，隨后使用生物力學(xué)方法證明了經(jīng)脈線的低流阻特性，又通過一系列實驗發(fā)現(xiàn)了循經(jīng)低流阻通道(Low hydraulic resistance channel along meridians，LHRCM)[4]。循經(jīng)低電阻特性是用低頻高壓窄脈沖電流在人體上發(fā)現(xiàn)的一種低阻經(jīng)絡(luò)現(xiàn)象[5]。穆祥等[6]用同樣的方法在小型豬上發(fā)現(xiàn)了循經(jīng)低電阻線(Low impedance line along meridian,LILM)。Zhang等[4]發(fā)現(xiàn)小型豬的LILM與以往實驗中測量到的LHRCM基本重合，二者在體表的平均距離差異為1.4 mm，用LILM可近似確定LHRCM的位置。2018年，美國一團隊使用熒光素鈉(Sodium fluorescein,SF)在體觀察到液態(tài)組織液的分布[7]。為使經(jīng)絡(luò)可視化，并直接觀察到經(jīng)絡(luò)中組織液的運動，研究人員建立了熒光照相法，使用SF示蹤經(jīng)絡(luò)中的組織液,對大鼠的任脈LHRCM進行了活體顯示[8]。因為大鼠肢體窄小，很難觀測到 SF的循經(jīng)遷移情況，所以選取了體積稍大四肢短粗的小型豬作為實驗動物模型，并對其在肢體上的循經(jīng)遷移規(guī)律進行了觀測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小型豬四肢12條LILM注射SF后，可以觀察到7條以注射點為中心的線狀遷移軌跡，這7條遷移軌跡與其對應(yīng)的7條LILM的總吻合度達81.4%；在LILM旁開的非低電阻區(qū)域注射SF后未出現(xiàn)線狀遷移，而是以注射點為中心向四周擴散。對SF沿LILM遷移軌跡的橫斷面進行觀察后發(fā)現(xiàn)，SF沿皮膚和肌肉的間隙遷移，其橫斷面呈V字或Y字形，存在于間質(zhì)中，是一種間質(zhì)通道[9]。上述一系列實驗證明，機體內(nèi)存在著與中醫(yī)經(jīng)絡(luò)密切相關(guān)的循經(jīng)間質(zhì)通道。

《靈樞·九針十二原》有“欲以微針通其經(jīng)脈，調(diào)其血氣”的描述。本研究基于經(jīng)絡(luò)的間質(zhì)通道學(xué)說，使用熒光照相法觀察了電針對SF在小型豬前肢外側(cè)中央LILM遷移的影響，并對電針調(diào)氣的可能機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 在北京市琉璃河科興試驗動物實驗基地，選擇4頭巴馬豬(2頭雄性，2頭雌性)進行實驗。實驗用的動物使用許可編號為SCXK (京)2017-0003。每天供應(yīng)高濃度飼料(希望飼料有限責(zé)任公司)，8:00喂料150 g，20:00喂料100 g，不限水，單籠式喂養(yǎng)。在(20±2) ℃的環(huán)境下，50%～10%的相對濕度下，在實驗室內(nèi)培養(yǎng)7 d后進行實驗。該實驗由中國中醫(yī)科學(xué)院倫理委員會批準后進行。

1.2 主要儀器和試劑 R620IE通用型動物麻醉機(深圳瑞沃德)、R409 PLUS大動物呼吸機(深圳瑞沃德)、WQ6F30經(jīng)絡(luò)定位儀(北京市海淀區(qū)東華電子儀器廠)、LH202H 4導(dǎo)韓氏穴位恒流神經(jīng)刺激儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司)、0.40 mm×25 mm 一次性使用針灸針(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)、5D Mark2相機(日本Canon)、MC UV 77 mm窄帶濾色鏡(日本kenko)、600EX Ⅱ-RT閃光燈(日本Canon)、Filmer 600SLED燈(上海Starison)、濾色紙、T-2000型電子天平[精度0.5 g，美國雙杰兄弟(集團)]、異氟烷(進口)、 3%戊巴比妥鈉(進口)、鹽酸賽拉嗪注射液(獸藥字070012926)、20%熒光素鈉注射液(國藥準字H45011477)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組:本研究在四只小型豬的左右共八條前肢上進行實驗，采用同體比較，在不同日次分別進行實驗。電針組8例，即在每只小型豬的左右前肢各進行1次電針干預(yù)，共8次實驗；對照組8例，即在每只小型豬的左右前肢同樣位置進行不刺激的對照實驗，共8次實驗。同一只小型豬同一側(cè)前肢的兩次實驗間隔在3 d以上。

1.3.2 麻醉與備皮:用電推剪除毛發(fā)，露出前肢外側(cè)的皮膚，有臟污處用75%的酒精棉球擦拭干凈后晾干，隨后采用3%的戊巴比妥鈉溶液(0.5 ml/kg)和鹽酸塞拉嗪注射液(0.1 ml/kg) 分別對小型豬兩側(cè)臀部肌肉進行注射麻醉。

1.3.3 循經(jīng)低電阻線的測定:將經(jīng)絡(luò)定位儀參數(shù)調(diào)整為脈沖60～80 Hz，電流范圍50 μA，對低電阻點(Low impedance point,LIP)進行位置測量。測定時，將經(jīng)絡(luò)定位儀的基準電極置于小型豬的耳廓背側(cè)面，用一根探頭與四肢縱向軸線呈垂直方向，進行均勻掃描，每隔約1 cm進行一次掃描，掃描過程中對微安表進行觀察，如若微安計指針陡然轉(zhuǎn)向右側(cè)且超過8 μA，則該點即為LIP，用彩色畫筆做記號，往復(fù)進行，將所探測到的LIP連接起來即為 LILM。在小型豬前肢的外側(cè)分別探測到3條LILM。本實驗選擇外側(cè)中央的1條LILM進行電針影響SF遷移的觀察。

1.3.4 示蹤劑的注射:根據(jù)既往研究結(jié)果[9]，確定使用20%、0.4 ml、深度3～4 mm的注射參數(shù)，體表SF的遷移顯示最清晰。在麻醉狀態(tài)下，電針組與對照組皆統(tǒng)一選取在左右前肢外側(cè)中央的LILM腕部上4.5 cm的一點作為注射點，用1 ml注射器垂直于皮膚表面刺入，深度3～4 mm，然后緩慢推注20%的SF溶液0.4 ml。

1.3.5 成像環(huán)境:工作環(huán)境溫度為(25±1) ℃，相對濕度為30%～60%，室內(nèi)外通風(fēng)隔絕。在SF注射和拍攝過程時處于暗室狀態(tài)，無陽光和燈光照射。

1.3.6 小型豬電針組與對照組的操作:小型豬在麻醉狀態(tài)下注射SF溶液后，電針組選擇原SF注射點作為進針點，將中研太和牌0.40×25 mm針灸針與皮膚呈60°角斜刺入皮膚15 mm，使針體與皮下肌肉組織充分接觸。隨后接入LH202H韓氏恒流電針儀，一側(cè)電極連接針體，另一側(cè)電極規(guī)定在小型豬耳廓外緣。采用100 Hz正負脈沖模式、脈寬0.2 ms、電流在6～9 mA之間適當(dāng)調(diào)節(jié)，持續(xù)30 min，以肉眼可見肌肉出現(xiàn)持續(xù)地節(jié)律性收縮為度。對照組僅注射SF溶液，不做任何干預(yù)。

1.3.7 熒光照相法:將小豬置于實驗臺上，采用側(cè)臥位。在Canon5D2數(shù)字照相機安裝窄帶濾色鏡，距離小型豬0.5～1 m的范圍內(nèi)，人工調(diào)整焦距和曝光。該系統(tǒng)以一臺主閃光燈、一臺副閃光燈為激發(fā)光源，其主、副閃光燈各安裝一張藍濾紙，主副閃光燈之間通過無線傳送保證曝光時間的同步。把主閃光燈放置在數(shù)碼相機側(cè)，位于小型豬腹側(cè)稍高一點，在小豬背側(cè)一邊，把副閃光燈放在更低的位置。LED燈配有藍濾紙，靠近小型豬放置，用以拍攝調(diào)焦(圖1)。

圖1 熒光照相裝置示意圖

1.4 觀察指標 分別在注射后即刻、針刺結(jié)束時、針刺結(jié)束后30 min對小型豬前肢SF注射部位一帶進行熒光照相，觀察SF體表遷移的動態(tài)軌跡。使用直尺測量SF注射60 min(電針后30 min)后SF體表遷移軌跡沿小型豬前肢縱軸的長度和沿橫軸的寬度，然后計算兩者的比例，即長寬比。遷移方向以一側(cè)方向的遷移長度比另一側(cè)大1/3以上為有方向性遷移的標準，即以注射點為中心，沿縱軸向上的向心長度比沿縱軸向下的離心長度大1/3以上稱為向心遷移，反之稱為離心遷移，若向心遷移長度與離心遷移長度的差異小于1/3，則稱為雙向(等長)遷移。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件。計量資料以均數(shù)±標準差表示，并進行正態(tài)性分析及方差齊性檢驗，兩者均符合者采用配對樣本t檢驗；若數(shù)據(jù)僅符合一項或均不符合時，采用Kruskal Wallis H檢驗；以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 電針組與對照組注射SF后遷移軌跡比較 電針組及對照組在小型豬前肢外側(cè)中部LILM的腕部以上約4.5 cm處注射SF溶液后，均呈現(xiàn)以注射點為中心，沿低電阻線方向出現(xiàn)線狀遷移軌跡，其遷移情況見表1(圖2)。

注：A、B為對照組注射SF 60 min后的遷移長度和寬度測量，C、D為電針組注射SF 60 min后的遷移長度和寬度測量，綠色×所示為注射點

表1 小型豬電針組與對照組注射SF 60 min后遷移軌跡比較(cm)

與對照組比較，電針組SF遷移軌跡的長度與寬度均明顯增加(P<0.01)。測量小型豬前肢的平均長度(從腕橫紋到腋橫紋)約為(13.50±0.69) cm，電針組平均遷移長度占前肢長度的百分比為33.3%±66.3%，對照組平均遷移長度占前肢長度的百分比為18.6%±36.5%。電針組的長度百分比相對于對照組增加了近1倍。

2.2 電針組與對照組注射SF后遷移方向比較 在小型豬前肢外側(cè)中部LILM的腕部以上約4.5 cm處注射SF溶液后，電針組及對照組SF遷移軌跡的方向情況如表2所示。

表2 電針組與對照組注射SF 60 min后遷移方向比較(cm)

結(jié)果顯示，注射60 min后，電針組以離心遷移為主，也有雙向遷移；對照組以離心遷移為主，除雙向遷移外，還有向心遷移。

3 討 論

SF作為一種易溶于水且無特異性親和性的“水指示劑”[10]，可與間質(zhì)中的液態(tài)組織液結(jié)合，其波長515 nm的黃綠色熒光可被熒光照相法[7-9]有效捕捉到。本研究以SF為示蹤劑，通過熒光照相，可顯示組織液在體表的分布和運動情況。SF在組織液中的運動包括濃度擴散和組織液對流輸運，服從Fick擴散定律,如果存在組織液的向經(jīng)脈流動和循經(jīng)流動[4]，則SF在縱向(向心或離心)和橫向的遷移長度會顯著不同，并出現(xiàn)向心和離心兩個方向上遷移長度的不對稱。

研究發(fā)現(xiàn)，電針組和對照組均出現(xiàn)了SF沿LILM的體表遷移軌跡，但也有垂直于LILM沿肢體橫軸方向的遷移，兩組遷移的距離在縱向與橫向上皆明顯不對稱，表現(xiàn)為縱向循經(jīng)的方向上有明顯優(yōu)勢的遷移，長寬比接近2.5，具有一定的線狀遷移特征，說明經(jīng)脈通道存在一定的橫向約束性，此結(jié)果與本團隊之前的研究結(jié)果一致[9]。進一步比較發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，電針組的遷移軌跡在長度和寬度方面均有顯著增加，說明電針可以促進組織液的流動，使SF的遷移距離更長。

研究中觀察到電針組和對照組的SF遷移軌跡方向以離心遷移為主，也有雙向遷移，對照組還出現(xiàn)向心遷移。這種不同方向的遷移可能與經(jīng)氣的運行方向有關(guān)。經(jīng)脈是運行氣血的通道，《內(nèi)經(jīng)》中經(jīng)脈的循行方向有不同的模式，主要的三種模式是上下交替的循環(huán)流注，自下而上循行和自上而下循行[11]?！鹅`樞·營氣》記述的“氣從太陰出注手陽明，上行注足陽明，下行至跗上，注大指間，與太陰合，下行至跗上，注大指間，與太陰合……合足厥陰，上行至肝，從肝上注肺”就屬于上下交替的循環(huán)流注，《靈樞·逆順肥瘦》對這種循行模式總結(jié)為“手之三陰，從臟走手，手之三陽，從手走頭，足之三陽，從頭走足，足之三陰，從足走腹” ?！鹅`樞·衛(wèi)氣》中經(jīng)氣的運行為自下而上(向心)，而《靈樞·衛(wèi)氣行》所載衛(wèi)氣的循行都是從頭面行于手足的離心方面。本研究觀察到組織液遷移的不同方向，支持了《內(nèi)經(jīng)》中經(jīng)氣運行不同方向的記載。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)影響組織液流動的因素有血管脈動、運動與肢體的主動和被動收縮等[12-14]。本研究通過電針引發(fā)的肌肉節(jié)律性收縮與肢體的主動被動收縮類似。電針可以提高肌肉組織的興奮性，引起肌肉收縮[15]，肌肉的節(jié)律性收縮可擠壓組織間隙并形成波動變化的組織液壓，根據(jù)組織液流動的達西定律，此波動壓力可推動組織液流動，形成更長更寬的SF軌跡，類似心臟節(jié)律性收縮推動血液流動的過程。《靈樞·經(jīng)脈》云：“經(jīng)脈者，伏行分肉之間”， 狹義的分肉可理解為“肉分之間，谿谷之會，以行榮衛(wèi)，以會大氣”(《素問·氣穴論》)的肌肉間隙，其兩側(cè)的肌肉形成了經(jīng)脈通道的外壁，經(jīng)絡(luò)通道周圍的肌肉狀態(tài)可能影響通道的通暢性,進而影響“氣-組織液”的運行[2]。賈術(shù)永等[16]在此基礎(chǔ)上使用恒流電針儀刺激小型豬四肢循經(jīng)低流阻通道上的低流阻點附近的肌肉,發(fā)現(xiàn)當(dāng)電流達到7 mA以上時,肌肉可出現(xiàn)強直收縮，同時流阻也顯著增加，說明肌肉狀態(tài)可影響肌肉間隙的大小和阻力，進而影響組織液的流動。為防止小型豬四肢肌肉對電刺激耐受，本實驗控制恒流電流在6～9 mA之間適當(dāng)調(diào)節(jié),以從皮膚表面可觀察到肌肉節(jié)律性收縮為度，并保持肌肉一直處于節(jié)律性收縮而非強直或不收縮的兩種狀態(tài)，通過肌肉節(jié)律性收縮，組織液的運行動力得以加強。古人描述針刺“得氣”時施術(shù)者手下會有“如魚吞餌之勢”，即手下沉緊感。肌肉內(nèi)的牽拉感受器-肌梭被認為是針刺得氣的解剖基礎(chǔ)之一，而肌梭激發(fā)的標志正是施術(shù)者有針下沉緊感或“吸針感”。當(dāng)混有運動神經(jīng)的纖維穿入肌肉或稱為“運動點”被刺中時，可以發(fā)生肉眼可見的整條肌纖維的抽搐[17]，這與本實驗通過控制電針參數(shù)從而觀察到的實驗現(xiàn)象相似。陸鳳燕等[18]發(fā)現(xiàn)，針刺穴區(qū)不同組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)得氣針感過程中的積分肌電值(iEMG)顯著高于針刺前，證明針刺效應(yīng)與肌肉的活動高度相關(guān)。此外，鄧麗芬等[19]使用電針觀察受試者足三里，得氣后可得到較強的電針肌縮反應(yīng)，也說明電針引起肌肉反應(yīng)的強弱可以作為判斷是否得氣或得氣程度的客觀參考指征之一。

肌肉屬中醫(yī)經(jīng)筋的范疇。近年來針對經(jīng)筋本質(zhì)的探析可分為神經(jīng)學(xué)說、肌肉學(xué)說、神經(jīng)肌肉學(xué)說、肌筋膜以及一套相對完整的循行系統(tǒng)，其中尤以筋肉學(xué)說、神經(jīng)肌肉學(xué)說最為盛行[20-21]。薛立功等[22]認為，“經(jīng)筋”是一種以經(jīng)脈為總綱，由骨骼肌、韌帶等組成的系統(tǒng)，也是一種對機體筋肉及其周圍組織生理表現(xiàn)和病理癥候的高度概述?！皦颜咧畾庋?，其肌肉滑，氣道通，營衛(wèi)之行不失其常，故晝精而夜瞑。老者之氣血衰，其肌肉枯，氣道澀，五臟之氣相搏，其營氣衰少而衛(wèi)氣內(nèi)伐，故晝不精，夜不瞑”(《靈樞·營衛(wèi)生會》)。說明經(jīng)脈是“著藏”在“經(jīng)筋”之中的，經(jīng)筋經(jīng)脈相伴而行，相須為用，經(jīng)脈中的津液氣血可濡養(yǎng)經(jīng)筋，使其束骨、利關(guān)節(jié)的功能正常，為經(jīng)脈通道中氣血的運行提供了動力。而當(dāng)經(jīng)筋病變，失其正常舒縮功能，則經(jīng)脈通道就變得滯澀，影響氣血的正常運行。本實驗用電針刺激屬于經(jīng)筋的循經(jīng)肌肉，引起其節(jié)律性收縮，促進了經(jīng)脈中的組織液流動，加強經(jīng)脈“行血氣，營陰陽”的功能，佐證了經(jīng)脈與經(jīng)筋的密切關(guān)系。李端午等[23]通過針刺受試者一側(cè)太沖穴，觀察到針刺可促進經(jīng)脈內(nèi)的核素運行，與用熒光素鈉示蹤的動物實驗結(jié)果相吻合。

本研究是在麻醉狀態(tài)下的小型豬上進行的，與清醒狀態(tài)下人的針刺情況仍有一定差異。進一步的研究可找尋一種在小型豬清醒狀態(tài)下進行針刺施術(shù)操作和示蹤觀察的實驗方法，使動物的狀態(tài)與人類針灸時更接近。當(dāng)然，最終證明針刺對經(jīng)氣的調(diào)節(jié)作用還需直接在人體上進行試驗，也可考慮從組織形態(tài)學(xué)角度對電針影響組織液流動的范圍進行更準確的測定，是針刺研究未來的方向。

本研究首次使用可視化方法研究針刺的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)電針引起肌肉興奮可增強熒光素鈉線狀遷移，為經(jīng)脈的間質(zhì)通道學(xué)說和低流阻通道中的組織液與經(jīng)氣密切相關(guān)的觀點[24]提供了進一步的影像學(xué)證據(jù)，也為針灸可通過經(jīng)筋調(diào)節(jié)經(jīng)脈氣血的途徑提供了科學(xué)依據(jù)。