夏秀麗，趙樹山，李 云，宋曉明，徐 珊，程麗敏，李 森，徐 超

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

食管癌是全球范圍內(nèi)較常見的惡性腫瘤之一，約占癌癥患者的3.2%，我國為食管癌高發(fā)地區(qū)[1-2]。食管癌在中醫(yī)屬于“噎膈”范疇，憂思暴怒、瘀血頑痰、氣機(jī)郁滯是其主要病機(jī)。黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫、味甘，具有補(bǔ)氣固表、托毒排膿等功效。黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)為中藥黃芪的主要有效成分，既往研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能夠通過提高免疫力改善宮頸癌和卵巢上皮性癌患者療效[3-4]；能夠通過調(diào)控信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transduction and activator of transcription factor 3，STAT3)、缺氧誘導(dǎo)因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)對口腔鱗癌、肝癌、胃癌均具有一定的抑制作用[5-7]。本研究旨在探討黃芪多糖對小鼠食管癌前病變的影響及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級健康雄性C57BL/6小鼠96只，5周齡、體重(20±2)g，購自河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(冀)2019-001]，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(24±1)℃、相對濕度50%～70%，自由進(jìn)食、飲水。本研究獲得我院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 注射用黃芪多糖(規(guī)格：100 mg/瓶)購自天津賽諾制藥有限公司(批號：20200419)；全反式維甲酸、4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)購自美國Sigma公司(批號：38H2079、SLBD6960)；CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞熒光素標(biāo)記單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號：BF0159、BF0174、BF0235、EC6872)；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購自日本Takara公司(批號：20A0127C、AI61180A)；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國Thermo公司(批號：K1622)；二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號：102517180413)；STAT3、HIF-1α、VEGF、β-actin抗體購自北京博奧森生物科技有限公司(批號：bs-55208R、bs-20399R、bs-1313R、bsm-33036M)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自美國Millipore公司(批號：WBKLS0500)。

1.3 主要儀器 RM2235型石蠟切片機(jī)(德國Leiea公司)；BX53型生物顯微鏡(日本Olympus公司)；FACS Cailobur型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；VELO18R型高速低溫離心機(jī)(英國Dynamica公司)；EMUC7型超薄切片機(jī)(德國Leica公司)；H-7500型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；FSH-2型高速勻漿機(jī)(江蘇金壇市佳美儀器有限公司)；DU640型蛋白核酸分析儀(美國Beckman公司)；ABI7500型RT-PCR儀(美國Thermo公司)；Power Pac型電泳儀(美國 Bio Rad公司)；VE-186型轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組、造模：適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法將144只實(shí)驗(yàn)用小鼠分為四組：正常組，模型組，黃芪多糖組和全反式維甲酸組，每組36只。除正常組外，其他組均參照紀(jì)曉花等[8]報(bào)道的方法，通過喂養(yǎng)4NQO溶液(100 μg/ml)15周誘導(dǎo)制備食管癌前病變小鼠模型。造模完成后，分別取正常組和模型組2只小鼠，頸椎脫臼處死后迅速剝?nèi)∈彻芙M織，行HE染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠食管上皮組織未見異常，模型組食管上皮組織呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂、細(xì)胞數(shù)量增多、出現(xiàn)異型細(xì)胞等病變，提示造模成功(圖1)。

圖1 正常組和模型組食管上皮組織病理學(xué)改變(HE染色，×400)

1.4.2 給藥：造模完成后，黃芪多糖組50 mg/kg，1次/d，灌胃給藥[相當(dāng)于人臨床劑量，換算公式：小鼠劑量(mg/kg)=12.27×人臨床劑量(mg)/體重(kg)，人體重以60 kg計(jì)算]；全反式維甲酸組7.5 mg/kg，每2 d 1次，灌胃給藥[8]；正常組和模型組灌胃給予0.9%氯化鈉溶液，1次/d,共10周。

1.4.3 HE染色法觀察食管上皮組織病理學(xué)改變：治療完成后，每組隨機(jī)取12只小鼠，頸椎脫臼處死后，立即剝?nèi)∈彻芙M織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，去除筋膜，縱向切開、平鋪、卷曲后置于4%多聚甲醛中固定72 h，經(jīng)石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片、展片處理后，行常規(guī)HE染色，封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察食管上皮組織病理學(xué)改變。參照胡艷華[9]報(bào)道的方法，由病理科醫(yī)生對食管癌上皮組織病變進(jìn)行判斷。①正常：基底膜完整，上皮層薄厚均勻、細(xì)胞排列整齊；②單純增生：基底膜完整，上皮層細(xì)胞排列整齊，但細(xì)胞數(shù)量增多、無異型細(xì)胞；③癌前病變：基底膜完整，上皮層組織結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞數(shù)量增多、出現(xiàn)異型細(xì)胞；④癌變：基底膜完整，上皮層全部結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞呈現(xiàn)多角形，胞核深染、位于細(xì)胞中央，可見病理性核分裂像。

1.4.4 透射電子顯微鏡觀察食管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變：治療完成后，每組隨機(jī)取12只小鼠，頸椎脫臼處死后，立即剝?nèi)∈彻芙M織，修飾成1 mm×1 mm×1 mm小塊后置于4%戊二醛溶液中固定2 h、四氧化鋨固定1.5 h，梯度丙酮溶液脫水、環(huán)氧樹脂包埋后行50 nm超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛依次染色30 min后，通過透射電子顯微鏡觀察食管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4.5 流氏細(xì)胞儀檢測血液中CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例：取各組剩余的12只小鼠，摘除眼球取血2 ml，4 ℃、3000 r/min離心10 min取沉淀，分別加入CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞熒光素標(biāo)記單克隆抗體，4 ℃孵育1 h，加入1 ml細(xì)胞洗液，4 ℃、300 g離心5 min取沉淀，加0.5 ml細(xì)胞洗液、將沉淀吹打均勻后，通過流式細(xì)胞儀測定血液中CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例。

1.4.6 RT-PCR法檢測食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)：頸椎脫臼處死后，立即剝?nèi)∈彻苌掀そM織，取100 mg食管上皮組織、提取并純化總RNA，通過核酸分析儀檢測RNA濃度后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)，4 ℃ 5 min終止反應(yīng)，然后通過凝膠分析儀成像。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。STAT3、HIF-1α、VEGF、β-actin的RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.4.7 Western blot法檢測食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)：取食管上皮組織100 mg，加入5倍量4 ℃裂解液研磨勻漿，4 ℃、12000 r/min離心30 min取上清液，通過BCA法測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)PDVF膜、5%牛血清白蛋白封閉2 h，STAT3(1∶500)、HIF-1α(1∶800)、VEGF(1∶500)、β-actin(1∶1000)抗體4 ℃孵育12 h，洗膜后IgG二抗(1∶2000)37 ℃孵育2 h，洗膜后ELC顯色，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參(β-actin)條帶灰度值的比值作為目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。本研究計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊的兩兩比較采用Dunnett T3法；計(jì)數(shù)資料比較以[例(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠食管上皮組織病理學(xué)改變比較 正常組小鼠食管上皮組織基底膜完整，上皮層薄厚均勻、細(xì)胞排列整齊；模型組小鼠食管上皮組織呈現(xiàn)黏膜充血、色澤灰暗，上皮層組織結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞數(shù)量增多、出現(xiàn)異型細(xì)胞，可見點(diǎn)狀或條狀白色斑塊不典型增生灶、原位癌病灶等病理學(xué)改變；與模型組比較，黃芪多糖組和全反式維甲酸組食管上皮組織病理學(xué)改變明顯改善，其中黃芪多糖組病變未超過上皮層下1/3處、未見原位癌病灶，效果優(yōu)于全反式維甲酸組。正常組小鼠食管上皮組織未見癌前病變或癌變；模型組食管上皮組織癌變率66.67%；與模型組比較，黃芪多糖組和全反式維甲酸組癌變率顯著降低(P<0.05)；與全反式維甲酸組比較，黃芪多糖組癌變率顯著降低(P<0.05)。見表2(圖2)。

圖2 各組小鼠食管上皮組織病理學(xué)改變(HE染色，×400)

表2 各組小鼠食管上皮組織病理學(xué)改變比較[例(%)]

2.2 各組小鼠食管上皮組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變比較 正常組小鼠食管上皮組織細(xì)胞排列整齊，胞核居中，核膜核仁清晰；模型組小鼠食管上皮組織基底細(xì)胞增生多層，細(xì)胞數(shù)量增多、排列紊亂、胞核大小不等、核分裂相增多等超微結(jié)構(gòu)改變；與模型組比較，黃芪多糖組和全反式維甲酸組食管上皮組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變明顯改善，其中黃芪多糖組效果優(yōu)于全反式維甲酸組(圖3)。

圖3 各組小鼠食管上皮組織細(xì)胞透射電子顯微鏡下超微結(jié)構(gòu)改變(×10000)

2.3 各組小鼠血液中CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例比較 與正常組比較，模型組小鼠血液中CD3+、CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例均降低，CD4+/CD8+比值降低，CD8+T細(xì)胞比例均升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芪多糖組和全反式維甲酸組CD3+、CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例均升高，CD4+/CD8+比值升高，CD8+T細(xì)胞比例降低(P<0.05)；與全反式維甲酸組比較，黃芪多糖組CD3+、CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例均升高，CD4+/CD8+比值升高，CD8+T細(xì)胞比例降低，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠血液中CD3+、CD4+、CD8+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例比較

2.4 各組小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)比較 見表4。與正常組比較，模型組小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芪多糖組和全反式維甲酸組STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)；與全反式維甲酸組比較，黃芪多糖組STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。

表4 各組小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)比較

2.5 各組小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，模型組小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芪多糖組和全反式維甲酸組STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)；與全反式維甲酸組比較，黃芪多糖組STAT3、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。見表5(圖4)。

表5 各組小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)比較

圖4 各組小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)

3 討 論

食管癌是我國最常見的上消化道惡性腫瘤，其中超過90%的患者病理分型屬于鱗狀細(xì)胞癌。食管癌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生及進(jìn)展是一個多階段的漸進(jìn)過程，主要經(jīng)歷單純增生、癌前病變、癌變等階段，其中癌前病變以異型細(xì)胞層不超過食管上皮層下1/3處、上皮層下1/3至2/3處、超過上皮層下2/3處分為輕、中、重度，癌變過程分為原位癌、浸潤性鱗狀細(xì)胞癌兩個階段。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，從食管輕度癌前病變發(fā)展為原位癌，需要約5～10年時間[10]。范煥芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)在癌前病變階段給予適當(dāng)藥物干預(yù)，能夠誘導(dǎo)食管上皮細(xì)胞向正常細(xì)胞分化，降低癌變率。

中藥黃芪具有補(bǔ)氣固表、托毒排膿、托瘡生肌等功效，常用于氣虛乏力、久瀉脫肛、子宮脫垂等癥的治療。黃芪多糖為黃芪的主要活性成分，對食管癌細(xì)胞生長具有抑制作用[12]、對食管癌細(xì)胞化療敏感性具有改善作用[13]，但黃芪多糖是否對食管癌前病變具有抑制作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。4NQO是一種水溶性喹啉衍生物致癌劑，其代謝產(chǎn)物4-羥氨基喹啉-1-氧化物與DNA形成加合物，使第7號染色體第12位密碼子發(fā)生嘌呤-腺苷轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致DNA突變而致癌[14]。4NQO飲水法誘導(dǎo)制備的食管癌小鼠模型為鱗狀細(xì)胞癌，較符合人類食管癌90%以上為鱗狀細(xì)胞癌的病理特點(diǎn)，并且該方法成模自然、操作簡單，是國內(nèi)外普遍認(rèn)可的食管癌動物模型制備方法[15]。全反式維甲酸是一種腫瘤細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)劑，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞向正常細(xì)胞分化的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，食管癌前病變模型小鼠食管上皮組織呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)異型細(xì)胞、不典型增生灶、原位癌病灶等病理學(xué)改變；食管上皮細(xì)胞可見胞核大小不等、核分裂相增多等超微結(jié)構(gòu)改變，與紀(jì)曉花等[8]報(bào)道一致。經(jīng)黃芪多糖治療能夠明顯改善食管癌前病變小鼠食管上皮組織病理學(xué)改變和上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變，癌變率顯著降低，黃芪多糖組效果優(yōu)于全反式維甲酸組，提示黃芪多糖對小鼠食管癌前病變進(jìn)展具有抑制作用。

免疫功能下降是食管癌發(fā)生發(fā)展的重要因素，因此提高食管癌患者機(jī)體免疫功能是改善其預(yù)后的有效途徑[17]。Chraa等[18]研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞在機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)過程中揮著重要的調(diào)節(jié)作用。CD3+是T細(xì)胞成熟的標(biāo)志，能夠反映T細(xì)胞總量；CD4+T細(xì)胞能夠輔助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體而殺傷腫瘤細(xì)胞；CD8+T細(xì)胞對細(xì)胞免疫具有負(fù)調(diào)控作用，表現(xiàn)為抑制免疫作用；CD4+/CD8+比值能夠反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芪多糖治療能夠明顯提高食管癌前病變小鼠血液中CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞比例并降低CD8+T細(xì)胞比例，提高CD4+/CD8+比值，并且黃芪多糖組對各指標(biāo)的調(diào)控作用優(yōu)于全反式維甲酸組，提示黃芪多糖對食管癌小鼠細(xì)胞免疫功能具有改善作用。

血管新生是食管癌發(fā)生發(fā)展的重要因素，為腫瘤組織生長供給養(yǎng)分、為癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供通道。研究表明，若沒有新生血管，實(shí)體瘤體積不會超過2 mm[20]。STAT3是哺乳動物細(xì)胞中普遍存在的一種核轉(zhuǎn)錄因子，對細(xì)胞增殖、分化、凋亡等具有重要的調(diào)控作用[21]。VEGF具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分裂等生物學(xué)活性，是促進(jìn)腫瘤組織血管生成最直接、最重要的細(xì)胞因子。STAT3能夠與VEGF啟動子特異位點(diǎn)結(jié)合而誘導(dǎo)VEGF轉(zhuǎn)錄表達(dá)。腫瘤細(xì)胞快速增殖導(dǎo)致局部乏氧、誘發(fā)HIF-1α表達(dá)，HIF-1α能夠誘導(dǎo)VEGF表達(dá)而增加腫瘤組織微血管密度；HIF-1α為STAT3的下游靶基因，因此，STAT3也能夠通過誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)而間接誘導(dǎo)VEGF轉(zhuǎn)錄表達(dá)[22]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芪多糖治療能夠明顯降低食管癌前病變小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)，黃芪多糖組效果優(yōu)于全反式維甲酸組，這可能是黃芪多糖抑制小鼠食管癌前病變進(jìn)展的重要機(jī)制。

綜上所述，黃芪多糖對小鼠食管癌前病變進(jìn)展具有抑制作用，其機(jī)制可能與提高細(xì)胞免疫功能及抑制STAT3、HIF-1α、VEGF轉(zhuǎn)錄表達(dá)有關(guān)。本研究為黃芪多糖用于食管癌前病變的治療提供了理論依據(jù)。