蔡 鳳

上海市楊浦區(qū)控江醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200093

A組輪狀病毒(RV)是造成小兒腹瀉的主要病原體之一，主要通過感染小腸上皮細(xì)胞，引起細(xì)胞損傷，造成腹瀉[1]。相關(guān)資料顯示，A組RV感染者多為6～24個(gè)月嬰幼兒，其發(fā)生率逐年升高，感染發(fā)生后常伴有低熱、嘔吐及水狀腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可引起大量酮體產(chǎn)生，致使患兒出現(xiàn)不同程度的脫水酸中毒現(xiàn)象，增加病毒性心肌炎發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，威脅患兒生命健康[2-3]。故加強(qiáng)對(duì)A組RV感染的監(jiān)測及防控較為重要。但目前，臨床關(guān)于腹瀉嬰幼兒A組RV感染的研究集中在其臨床特點(diǎn)及治療等方面，而關(guān)于腹瀉嬰幼兒A組RV感染的狀況及分子流行病學(xué)特點(diǎn)研究報(bào)道較少且結(jié)論不一[4-5]?；诖耍狙芯渴占?32例腹瀉嬰幼兒的臨床資料，分析A組RV感染特點(diǎn)及基因分型，以期為腹瀉嬰幼兒A組RV的監(jiān)測、臨床防控提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2020年9月至2021年10月的432例腹瀉患兒的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國兒童急性感染性腹瀉病臨床實(shí)踐指南》[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡0～5歲嬰幼兒；(3)大便性狀呈水樣或蛋花湯樣且無血便及膿血便；(4)腹瀉病程<2周。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重心、肝、腎等功能障礙；(2)血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定；(3)有先天性呼吸道畸形、先天性心臟病等先天畸形；(4)食物過敏史、上消化道疾病家族史、寄生蟲感染等。納入患兒中，男241例，女191例；年齡為0～6個(gè)月、>6～12個(gè)月、>12～24個(gè)月、>24～36個(gè)月、>36個(gè)月者分別為52、89、92、84、115例；大便性狀為蛋花湯樣156例，黏液稀便128例，水樣便148例。

1.2方法

1.2.1乳膠法 采用乳膠法檢測腹瀉患兒A組RV感染情況，A組RV試劑盒購自杭州艾博生物醫(yī)藥有限公司，操作均嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。取約50 mg糞便標(biāo)本，加入緩沖液中充分搖勻，取80 μL樣本上清液滴入加樣處，室溫下放置，10～20 min內(nèi)判讀結(jié)果。

1.2.2反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) (1)核酸提取：采用NP-968C全自動(dòng)核酸提取儀(西安天隆科技有限公司)提取RNA，提取后置于-70 ℃下保存?zhèn)錅y。(2)G/P基因測序：采用一步法對(duì)A組RV VP7基因及VP4基因進(jìn)行擴(kuò)增(試劑盒購自上海博湖生物科技有限公司)。VP7上游引物：5′-ATGTATGGTATTGAATATACCAC-3′；下游引物：5′-AACTTGCCACCATTTTTTCC-3′。VP4上游引物：5′-TATGCTCCAGTNAATTGG-3′；下游引物：5′-ATTGCATTTCTTTCCATAATG-3′。擴(kuò)增步驟：50 ℃ 25 min，95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共5個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行測定，測定結(jié)果根據(jù)美國國立生物計(jì)數(shù)信息中心(NCBI)序列比對(duì)檢索工具進(jìn)行對(duì)比，確定基因分型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Logistic回歸分析腹瀉患兒A組RV陽性的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1腹瀉患兒A組RV感染情況及分布分析 432例腹瀉患兒經(jīng)檢測顯示，A組RV陽性者108例(25.00%)，不同性別的腹瀉患兒A組RV陽性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而不同年齡、患病月份及大便性狀的腹瀉患兒A組RV陽性檢出率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中年齡為>6～12個(gè)月、>12～24個(gè)月的腹瀉患兒，患病月份為10-12月、1-3月的腹瀉患兒及大便性狀為蛋花湯樣的患兒A組RV陽性檢出率均較高。見表1。

表1 腹瀉患兒A組RV感染情況及分布分析[n(%)]

2.2腹瀉患兒A組RV感染多因素分析 以A組RV陽性為因變量(賦值：陽性=0，陰性=1)，以年齡0～6個(gè)月(是=0，非=1)、年齡>6～12個(gè)月(是=0，非=1)、年齡>12～24個(gè)月(是=0，非=1)、年齡>24～36個(gè)月(是=0，非=1)、年齡>36個(gè)月(是=0，非=1)、患病月份1-3月(是=0，非=1)、患病月份4-6月(是=0，非=1)、患病月份7-9月(是=0，非=1)、患病月份10-12月(是=0，非=1)、大便性狀蛋花湯樣(是=0，非=1)、大便性狀黏液稀便(是=0，非=1)、大便性狀水樣便(是=0，非=1)為自變量，納入Logistic回歸分析。多因素Logistic回歸分析顯示，患病月份1-3月、大便性狀蛋花湯樣為腹瀉患兒A組RV陽性的危險(xiǎn)因素(OR=2.341、4.745，P<0.05)，而年齡為>24～36個(gè)月、年齡為>36個(gè)月、患病月份4-6月、患病月份7-9月為腹瀉患兒A組RV陽性的保護(hù)因素(OR=0.154、0.096、0.405、0.432，P<0.05)。見表2。

表2 腹瀉患兒A組RV感染多因素分析

2.2A組RV感染腹瀉患兒G/P基因分型結(jié)果 108份A組RV陽性標(biāo)本，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，檢出G型基因情況如下：G3型56株(51.85%)、G1型32株(29.63%)、G2及G9型均2株(1.85%)、G型混合感染8株(7.41%)、未確定型8株(7.41%)；檢出P型基因情況如下：P[8]型89株(82.41%)、P[4]型8株(7.41%)、P[8]P[4]混合型3株(2.78%)、未確定型8株(7.41%)。另G、P組合型檢出最多的為G3P[8]型49株(45.37%)，其次為G1P[8]型30株(27.78%)。見表3。

表3 A組RV感染腹瀉患兒G/P基因分型結(jié)果[n(%)]

續(xù)表3 A組RV感染腹瀉患兒G/P基因分型結(jié)果[n(%)]

3 討 論

A組RV感染多見于5～24個(gè)月嬰幼兒，發(fā)生后常伴有低熱、嘔吐、腹瀉等癥狀出現(xiàn)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成致命性胃腸炎、脫水及電解質(zhì)平衡失調(diào)，對(duì)嬰幼兒的生命健康造成嚴(yán)重威脅[7-9]。目前，臨床關(guān)于A組RV感染導(dǎo)致腹瀉的致病機(jī)制尚無明確定論。有研究者指出，A組RV對(duì)細(xì)胞表面受體具有識(shí)別作用，其不僅可感染小腸上皮細(xì)胞，而且可合成病毒蛋白，降低上皮細(xì)胞對(duì)水分及鹽的吸收，從而造成嬰幼兒機(jī)體內(nèi)碳水化合物吸收障礙，引發(fā)滲透性腹瀉[10-11]。國外研究顯示，5歲以下住院腹瀉患兒A組RV陽性檢出率高達(dá)25%～47%[11]，而國內(nèi)數(shù)據(jù)顯示，腹瀉患兒中A組RV陽性檢出率約為26%[12-13]。本研究中，432例腹瀉患兒共檢出A組RV陽性者108例，陽性檢出率為25.00%。該結(jié)果與國內(nèi)報(bào)道的數(shù)據(jù)相近，但與國外報(bào)道的具有一定差異，提示急性腹瀉患兒A組RV陽性檢出率可能受地區(qū)、生活方式、收集季節(jié)等的影響。

A組RV為引起兒童腹瀉的常見病原體，其感染可發(fā)于各個(gè)年齡段，但主要以5歲以下嬰幼兒為主。有研究報(bào)道，與男性相比，女性感染A組RV的風(fēng)險(xiǎn)更高，但亦有研究者指出不同性別腹瀉嬰幼兒A組RV感染的風(fēng)險(xiǎn)無明顯差異[14]。本研究中，不同性別腹瀉患兒A組RV陽性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與上述研究結(jié)果具有一致性。而本研究中，不同年齡腹瀉患兒A組RV陽性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中以年齡為>6～12個(gè)月、>12～24個(gè)月腹瀉患兒A組RV陽性檢出率較高，且年齡為>24～36個(gè)月、>36個(gè)月為腹瀉患兒A組RV陽性的保護(hù)因素，該結(jié)果與佘文等[15]研究結(jié)果具有一致性。其原因可能與腹瀉患兒免疫功能有關(guān)，年齡>6～24個(gè)月患兒自體免疫尚未完全成熟，對(duì)于各種病原體感染的特異性IgM抗體產(chǎn)生尚不足，免疫功能差；且該年齡段嬰幼兒在進(jìn)行人工喂養(yǎng)時(shí)，腸道局部分泌型IgA減少，因此感染病原體風(fēng)險(xiǎn)更高。本研究結(jié)果顯示，年齡0～6個(gè)月、>24～36個(gè)月及>36個(gè)月的嬰幼兒A組RV陽性檢出率較低。其原因可能為年齡<6個(gè)月嬰兒多為母乳喂養(yǎng)，乳汁中含有大量的分泌型IgA，其可保護(hù)腸道黏膜，使嬰兒獲得被動(dòng)免疫；而年齡>24個(gè)月的嬰幼兒自主免疫功能逐漸成熟，抵抗病原體風(fēng)險(xiǎn)能力增強(qiáng)。以上結(jié)果均提示提高嬰幼兒的免疫力對(duì)A組RV感染的預(yù)防具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，在1-3月和10-12月(冬、春季節(jié))A組RV陽性檢出率較高，而在4-6月和7-9月(夏、秋季節(jié))較低，且患病月份1-3月為腹瀉患兒A組RV陽性的危險(xiǎn)因素，患病月份4-6月、7-9月為腹瀉患兒A組RV陽性的保護(hù)因素。該結(jié)果與國內(nèi)一些研究者的結(jié)果相符[16-17]。目前臨床關(guān)于A組RV感染致腹瀉的季節(jié)性發(fā)病的原因尚未完全明確，可能與地區(qū)間的溫度及濕度等有關(guān)，但臨床可針對(duì)性地在高發(fā)季節(jié)做好A組RV的預(yù)防宣傳及疫苗接種工作，以減少A組RV感染的發(fā)生。此外，本研究中大便性狀為蛋花湯樣的腹瀉患兒其A組RV陽性檢出率較高，其原因可能與致病腸毒素有關(guān)。

VP4及VP7均為病毒的外衣殼蛋白，其均可產(chǎn)生誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答特異性中和抗體。目前有研究指出，A組RV根據(jù)VP7核酸可分為27種G基因分型，而以VP4差異性可分為35種P基因分型，且P基因及G基因二者間可自由組合，形成A組RV復(fù)雜、多變的分子流行特征[18]。既往研究指出，A組RV中G基因以G1型為主，其次為G3、G2、G4型及G9型，而P基因以P[8]型及P[4]型為主[19]。本研究中，108份A組RV陽性標(biāo)本，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，檢出的G基因以G3及G1型為主，共占81.48%；而P基因以P[8]型(82.41%)和P[4]型(7.41%)為主。另有臨床研究指出，A組RV最常見的基因組合類型依次為G3P[8]型、G1P[8]型、G2P[4]型、G4P[8]型等，且占比達(dá)全部A組RV的90%以上[20]。而本研究中，G、P組合型以G3P[8]型最高，為45.37%，其次為G1P[8]型，占27.78%。該結(jié)果與劉愛玲等[21]報(bào)道的結(jié)果相符。但本研究中G、P型基因未確定型基因均為7.41%，提示A組RV的基因分型較為復(fù)雜。

綜上所述，腹瀉嬰幼兒中A組RV為常見病原體之一，其中年齡為>6～12個(gè)月、>12～24個(gè)月的腹瀉患兒，患病月份為10-12月、1-3月的腹瀉患兒及大便性狀為蛋花湯樣的患兒A組RV陽性檢出率均較高，且基因分型以G3P[8]及G1P[8]型為主，臨床可根據(jù)A組RV感染的發(fā)病特征、時(shí)間等，針對(duì)性地進(jìn)行預(yù)防及治療。