夏雨婷,萬永杰,姜志洋,陳琪,茆達干
(南京農業(yè)大學動物科技學院,江蘇 南京 210095)
我國南部地區(qū)夏季高溫高濕常引起動物熱應激,損害動物的健康福利,降低動物的免疫、生長和繁殖性能。熱應激能激活下丘腦-垂體-腎上腺軸,升高皮質酮分泌水平,誘導免疫抑制[1],降低抗氧化能力[2];導致羔羊采食量、肌肉生長和代謝效率降低,從而降低生產性能[3];引起睪丸代謝增加導致精索損傷[4],雄性動物的性欲、精子活力和精液質量降低[5],雌性動物發(fā)情周期紊亂、妊娠母畜和子代產生應激反應[6]。
如何減輕熱應激給畜牧生產中帶來的經(jīng)濟損失已引起人們的廣泛研究。如通過建造人工圍欄遮蔽物、噴水器以及圍欄灑水器等物理方法,降低夏季高溫給動物帶來熱應激損傷[7],但這些方法也存在引起動物不良反應的問題;通過添加植物源性物質如槲皮素[8]、當歸粉[9]和紅參[10]等,可以有效改善夏季高溫帶來的負面影響且滿足動物福利要求。硒是動物必需的微量元素,是抗氧化酶系統(tǒng)中不可或缺的輔助因子。高溫季節(jié)日糧添加有機硒能通過富含硒代半胱氨酸的硒蛋白發(fā)揮抗炎、抗氧化應激作用,保護動物的肝臟[11]、腎臟[12]和睪丸[13]等器官,繼而改善熱應激造成的生產、繁殖性能低下。有學者基于轉錄組學研究發(fā)現(xiàn),日糧添加有機硒后綿羊的血液基因表達發(fā)生變化,共檢測出1 186個差異基因[14]。熱應激對哺乳動物的精子產生不利影響,甚至可能導致子代不育[15]。然而,針對有機硒緩解熱應激對綿羊睪丸損傷的轉錄組學研究還未見報道。本試驗以4月齡雄性湖羊為研究對象,通過在夏季日糧添加酵母硒,研究其對湖羊血液指標和睪丸發(fā)育的影響,對睪丸組織進行轉錄組學分析,探討夏季日糧添加酵母硒影響湖羊睪丸發(fā)育相關基因表達變化規(guī)律,從分子水平為酵母硒應用于夏季湖羊生產中提供科學依據(jù)。
選取體況健康、體重相近的4月齡雄性湖羊為研究對象,在啟東瑞鵬牧業(yè)有限公司進行試驗。當?shù)?—8月份的日平均溫度為(36±3)℃,日平均濕度為(75±10)%,羊舍內每天的平均溫度為(34±2)℃,平均濕度為(75±10)%。酵母硒購于南京嘉吉飼料有限公司,硒含量為3 g·kg-1。
96只試驗羊(平均體重約25 kg)隨機分為對照組(Con,基礎日糧)和酵母硒組(Se,基礎日糧+酵母硒),每組3個重復,每個重復16只羊。試驗飼養(yǎng)周期為5周(其中預飼期1周),基礎日糧組成見表1。采用精粗分飼的方式,分別于每日07:00和17:00飼喂。酵母硒添加量按干物質采食量(dry matter intake,DMI)0.4 g·kg-1計算拌于精料內。試驗結束時于次日晨飼前進行稱重,每個重復選4只羊進行頸靜脈采血,制備血清和血漿,-20 ℃保存。每個重復選2只羊采集睪丸,稱重并測量大小,然后取部分組織用多聚甲醛固定,部分組織于-80 ℃保存。
血清葡萄糖(Glu)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(NEFA)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)濃度測定按照試劑盒(南京建成生物科技有限公司)說明書進行。血漿免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和M(IgM)濃度測定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法,根據(jù)試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)說明書操作。
血清和睪丸組織中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性測定按照試劑盒(南京建成生物科技有限公司)說明書進行。
按照《食品安全國家標準食品中硒的測定:GB 5009.93—2017》的操作方法,將保存在-80 ℃的睪丸樣品(約0.3 g)解凍后與硝酸(10 mL)混勻,使用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(賽默飛iCAP 7400,美國)測定湖羊睪丸組織中的硒濃度。每個樣品取3個平行樣,取實測數(shù)據(jù)的均值。睪丸組織形態(tài)學操作步驟參照Pang等[16]方法,將固定的睪丸組織進行石蠟包埋,制作連續(xù)切片(厚5 μm),蘇木精和伊紅(HE)染色,在光學顯微鏡下觀察,測量曲精細管外徑、內徑,計算生精上皮的厚度。
表1 湖羊基礎日糧組成及營養(yǎng)組成(以干物質為基礎)Table 1 Formula and nutritional composition of the basal diet in Hu sheep(based on dried matter) %
1.6.1 文庫構建及測序采用Trizol法提取湖羊睪丸組織總RNA,通過Agilent 2100 Bioanalyzer(RNA Nano 6000 Assay Kit,Agilent Technologies,USA)檢測RNA完整性。每只個體的總RNA單獨建庫,文庫檢測合格后,按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求,對不同文庫使用Illumina NovaSeq 6000平臺Iillumina,USA)測序。
1.6.2 數(shù)據(jù)質控與序列對比測序獲得的原始數(shù)據(jù)去除帶接頭、含N和低質量reads后,對clean data進行Q20、Q30和GC含量等計算及后續(xù)分析。從基因組網(wǎng)站(http://ftp.ensembl.org/pub/release-99/fasta/ovis_aries/)下載綿羊參考基因組和基因模型注釋文件(http://ftp.ensembl.org/pub/release-99/gtf/ovis_aries/)。使用HISAT2 v2.0.5構建參考基因組的索引,并將配對末端clean reads與參照基因組比對。
1.6.3 基因表達水平定量根據(jù)基因的長度計算每個基因的FPKM(每百萬堿基對測序的轉錄本序列片段的每千堿基片段的預期數(shù)量)并計算映射到該基因的讀數(shù)。
1.6.4 差異表達分析使用DESeq2軟件(1.20.0)進行2個比較組合基因之間的差異表達分析。使用Benjamini & Hochberg方法調整P值以控制錯誤發(fā)現(xiàn)率,差異表達分析使用edgeR(3.22.5)軟件包進行。將校正后的P值以及差異表達倍數(shù)(fold change)作為顯著差異表達的閾值。
1.6.5 差異基因的富集分析修正了基因長度偏差后,通過clusterProfiler 3.4.4軟件實現(xiàn)差異表達基因的GO富集分析和KEGG通路富集分析。
選取的差異基因根據(jù)序列特異性設計引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。睪丸組織總RNA提取、反轉錄和qPCR按Vazyme Biotechw 公司的試劑盒說明書和儀器說明進行操作。qPCR所用引物見表2。以β-actin為內參,采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。
表2 RT-qPCR所用引物Table 2 Primers used for real time quantitative PCR analysis
如表3所示:Se組游離脂肪酸的濃度顯著高于對照(Con)組(P<0.05);而2組間的葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白濃度無顯著差異(P>0.05)。Se組血清GSH-Px活性極顯著高于Con組(P<0.01),而SOD活性在2組間無顯著差異(P>0.05)。Se組血漿中IgA、IgG和IgM水平極顯著高于Con組(P<0.01)。
表3 酵母硒對湖羊血液生化、抗氧化和免疫指標的影響Table 3 Effect of selenium yeast on blood biochemical,antioxidant and immune indexes in Hu sheep
圖1 酵母硒對湖羊睪丸組織硒濃度(A)和抗氧化酶活性(B)的影響Fig.1 Effect of selenium yeast on selenium concentration(A)and antioxidant enzyme activity(B)in Hu sheep testis 不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different capital letters mean extremely significant differences(P<0.01),different lowercase letters mean significant difference(P<0.05).
如圖1所示:Se組睪丸組織硒濃度極顯著高于Con組(P<0.01),睪丸組織GSH-Px活性顯著高于Con組(P<0.05),但SOD在2組間無顯著差異(P>0.05)。由表4可知:Se組湖羊平均日增重顯著高于對照組(P<0.05),但2組睪丸大小、質量及睪丸系數(shù)無顯著差異(P>0.05)。Se組的生精上皮厚度極顯著大于Con組(P<0.01),曲精細管內徑有小于Con組的趨勢(P=0.073),而2組間外徑無顯著差異(P>0.05)。睪丸組織形態(tài)學(圖2)結果顯示:2組曲精細管內都有精子,Se組睪丸組織曲細精管內的空腔狀有所緩解,生精細胞增多,排列更加密集有序,且曲精細管間的間質細胞也明顯多于對照組。
表4 酵母硒對湖羊體重、睪丸及曲精細管的影響Table 4 Effect of yeast selenium on body weight,testicular parameters and seminiferous tubule in Hu sheep
圖2 酵母硒對湖羊睪丸組織形態(tài)學的影響Fig.2 Effect of selenium yeast on the morphology in Hu sheep testis
測序數(shù)據(jù)用測序錯誤率分布檢查和GC含量指標進行質控。結果表明測序比對結果良好,可用于進一步的差異表達基因分析。計算各樣本所有基因的表達值(FPKM)后,通過盒形圖展示不同樣本基因表達水平的分布情況(圖3-a)。本研究使用的差異閾值為padj≤0.05且|log2[Fold change]|≥1。通過篩選,2組之間鑒定到2 321個差異轉錄本。其中,與Con組比較,Se組表達上調的差異轉錄本有671個,表達下調的差異轉錄本有1 650個(圖3-b)。聚類分析后發(fā)現(xiàn),2組間出現(xiàn)分離,同組的不同生物學重復聚集在一起,表明組內的相關性良好(圖3-c)。
圖3 轉錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及差異基因分析Fig.3 Transcriptome sequencing data statistics and differential gene analysis a. 樣本基因表達量分布盒形圖;b. 差異基因火山圖;c. 差異表達基因聚類熱圖。a. Box plot of sample gene expression distribution;b. Volcano plot of differential genes;c. Heatmap plot of differential genes.
GO(gene ontology)是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫,可分為生物過程、細胞組成和分子功能3個部分。GO功能富集以padj<0.01作為顯著性富集的閾值,富集結果如圖4-a所示。其中生物過程中顯著性富集的功能類只有電子轉移鏈;細胞組成中基因功能富集極顯著前10位的主要有呼吸鏈復合體、呼吸鏈、線粒體膜部分等;分子功能中極顯著性富集的功能類有NADH脫氫酶(泛醌)活性和NADH脫氫酶(醌)活性。
從KEGG富集結果中,選取最顯著的20個KEGG通路繪制氣泡圖(圖4-b)。選取padj<0.01作為顯著性富集的閾值時,包括帕金森綜合征、朊病毒病、氧化磷酸化、亨廷頓舞蹈病、產熱等11條功能通路。
圖4 差異表達基因GO富集分析柱狀圖(a)和KEGG富集氣泡圖(b)Fig.4 Differentially expressed gene GO enrichment analysis histogram(a)and KEGG enrichment bubble chart(b)
為了驗證轉錄組測序結果的準確性,隨機挑選6個差異基因,3個基因上調,分別是BIRC3、SLC16A9和LBR;3個下調基因,分別是EMD、HSPB1和PFDN6。qPCR分析結果表明,6個基因在2組個體間表達變化規(guī)律與轉錄組測序結果基本一致(圖5),表明本試驗利用轉錄組測序獲得的結果是可信的。
圖5 差異表達基因的測序分析(a)與RT-qPCR驗證(b)Fig.5 Sequencing analysis of differentially expressed genes(a)and RT-qPCR verification(b) *表示與Con組差異顯著(P<0.05);**表示與Con組差異極顯著(P<0.01)。*means significant difference compared with the Con group(P<0.05);**means extremely significant differences compared with the Con group(P<0.01).
血清生化指標可以反映動物的代謝狀態(tài)。研究表明,夏季熱應激降低羔羊血清葡萄糖、膽固醇和甘油三酯含量[17]及綿羊血漿不飽和脂肪酸的濃度[18]。熱應激升高肉鴨低密度脂蛋白的濃度,降低高密度脂蛋白的濃度[19]。日糧添加硒可以緩解動物的熱應激。日糧添加1.2 mg·kg-1納米硒能降低熱應激下肉仔雞總膽固醇和低密度脂蛋白濃度,增加高密度脂蛋白濃度[20],但用5 mg·mL-1硒注射1 mL治療熱應激時,對綿羊血清葡萄糖濃度、膽固醇和不飽和脂肪酸無影響[21]。熱應激下綿羊日糧添加酵母硒且其硒濃度為0.8 mg·kg-1時,可增加葡萄糖濃度,但對不飽和脂肪酸無影響[22]。本研究中日糧添加0.4 mg·kg-1的酵母硒(硒濃度為1.2 mg·kg-1)提高了湖羊血清中不飽和脂肪酸的含量,對葡萄糖、膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白沒有影響,提示酵母硒可以促進湖羊脂肪的動員,且不同動物種類、溫度條件和硒的添加量與形式的處理效果不同。
熱應激能通過過量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生來降低抗氧化防御能力而加劇氧化應激[23]。SOD和GSH-Px是清除ROS的抗氧化參數(shù),通常用它們的活性來評估機體的抗氧化能力。本試驗中,湖羊血液和睪丸中GSH-Px活性的變化趨勢一致,添加酵母硒后GSH-Px活性升高,SOD無顯著變化,提示酵母硒可能通過增加湖羊體內的GSH-Px活性而非SOD活性來增強抗氧化狀態(tài)。研究表明,在受氧化應激的綿羊日糧中添加酵母硒會顯著增加血液GSH-Px的活性,而SOD活性無顯著變化[24],這與本研究結果一致。本試驗中Se組湖羊睪丸中硒的沉積增加,說明酵母硒對湖羊夏季高溫的保護作用能夠到達睪丸組織,也驗證了血液和睪丸中抗氧化酶活性變化一致的結果。IgA、IgG和IgM是血清免疫球蛋白中含量最多且最為重要的3類,其中IgM是個體發(fā)育過程中最早合成和分泌的免疫球蛋白,IgA與IgG主要通過早期免疫球蛋白(IgM和IgD)轉換,參與體液免疫應答。熱應激通過降低動物機體的IgA、IgG和IgM水平來抑制其免疫功能[25],而補充硒可顯著提高山羊血清IgA、IgG和IgM水平[26]。本試驗結果與之一致,酵母硒可改善湖羊因夏季高溫而降低的免疫反應,進而提高生產性能。
動物睪丸的質量、大小以及組織形態(tài)學反映睪丸發(fā)育的情況。大量研究表明熱應激會引起小鼠精子密度和質量損傷[9]以及生精過程受損,包括缺少初級精母細胞和成熟精子[27],而熱應激日糧添加硒可以緩解因環(huán)境溫度升高對兔精子質量和繁殖力的負面影響,且添加硒會使生精小管充滿精子細胞[13],增加大鼠精子數(shù)量和生精上皮厚度[28]。本研究中酵母硒組生精上皮厚度的增加與前人對大鼠的研究結果一致,提示日糧添加酵母硒可能通過促進睪丸生精上皮的發(fā)育來緩解夏季高溫對湖羊繁殖機能的負面影響。
本研究構建了夏季日糧添加Se組和Con組睪丸組織的轉錄組文庫8個,獲得了48.88 Gb的過濾數(shù)據(jù),分析發(fā)現(xiàn)2組差異表達基因2 321個,qPCR分析驗證了測序的準確性。Se組上調的671個基因中,差異顯著的前20個有注釋的基因包括谷氨酸脫羧酶樣蛋白1(GADL1)、下丘腦受體2(HCRTR2)、肌球蛋白輕鏈激酶3(MYLK3)、類固醇羥化酶(CYP7B1)等基因。類固醇羥化酶(CYP7B1)屬于細胞色素P450(CYP)家族,定位于內質網(wǎng)的跨膜蛋白上,主要功能是催化膽固醇骨架7位的羥化反應,能產生許多重要的甾類分子,調控生殖發(fā)育過程[29-30],CYP7B1形成的類固醇代謝物可能不僅對雌激素信號很重要,而且對雄激素也很重要[31]。下調的1 650個基因中,差異顯著的前20個有注釋的基因包括前折疊蛋白亞基6(PFDN6)、NADH脫氫酶亞基1(ND1)、細胞色素C氧化酶亞基3(COX3)、熱休克蛋白B1(HSPB1)等基因。HSPB1是熱休克蛋白家族的一員,主要作為ATP依賴的分子伴侶,具有抗凋亡和抗氧化應激的作用[32-33],當細胞暴露于熱休克時,其表達水平會上調[34]。本試驗中差異基因CYP7B1在處理組上調,說明酵母硒能夠緩解熱應激給機體睪丸帶來的損傷,改變類固醇合成相關基因的表達;差異基因HSPB1在Se組下調,提示夏季日糧添加酵母硒降低了機體的熱應激水平,可能保護睪丸的發(fā)育。除此之外,Se組抗氧化相關基因谷胱甘肽過氧化物酶3(GPX3)和谷胱甘肽過氧化物酶8(GPX8)也分別上調約1.9倍和1.6倍,這與血液、睪丸組織抗氧化結果一致。
差異顯著基因的GO功能富集篩選到氧化還原酶復合物、NADH脫氫酶復合物、NADH脫氫酶(泛醌)活性和NADH脫氫酶(醌)活性等與氧化應激有關的生物學過程、細胞組分和分子結構。其中主要包括NADH脫氫酶1α復合體亞基3(NDUFA3)、NADH脫氫酶1α復合體亞基8(NDUFA8)、NADH脫氫酶(輔酶Q)Fe-S蛋白5(NDUFS5)、NADH脫氫酶亞基3(ND3)等與生成ROS相關的基因[35-36],且這些基因表達均下調,說明夏季日糧添加酵母硒能降低機體氧化應激水平,減輕熱應激引起的睪丸損傷。在進一步的KEGG通路富集分析中,篩選出11個差異極顯著通路,其中產熱通路與本試驗相關,該通路富集了40個差異基因,表明夏季日糧添加酵母硒能夠影響湖羊睪丸產熱相關基因的表達。
綜上,夏季日糧添加酵母硒增加了湖羊血清NEFA濃度,提高了血清和睪丸組織中GSH-Px活性以及血漿免疫球蛋白的濃度,提示酵母硒可以促進湖羊的脂質代謝,改善其抗氧化能力和免疫功能。睪丸轉錄組測序分析篩選了夏季高溫下酵母硒影響湖羊睪丸發(fā)育的相關基因,為進一步闡明酵母硒緩解夏季高溫影響湖羊繁殖性能的分子機制奠定理論基礎。