曾強(qiáng),關(guān)欽澤,王思琪,李齊發(fā),杜星

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

細(xì)胞色素450家族(cytochrome P450 family,又稱CYP450 family)是由一類能發(fā)生自氧化的富含亞鐵血紅素蛋白組成的龐大家族,因該家族成員在450 nm激發(fā)波長照射下具有特定的吸收峰而得名[1]。其中,膽固醇側(cè)鏈裂解酶(cholesterol side-chain cleavage enzyme)作為其中一個重要的亞家族得到了廣泛關(guān)注[2]。經(jīng)鑒定該亞家族中存在多個成員,包括CYP11A1、CYP11B1、CYP17B1、CYP19A1以及CYP21A1等[3]。該亞家族成員廣泛參與調(diào)控哺乳動物體內(nèi)眾多關(guān)鍵的生理過程,包括能量代謝、免疫調(diào)節(jié)、應(yīng)激適應(yīng)、穩(wěn)態(tài)平衡、性別分化以及性腺形成與性器官成熟等[4]。其中,細(xì)胞色素P450側(cè)鏈膽固醇單加氧酶(CYP11A1)作為類固醇激素合成的第一步關(guān)鍵作用酶得到了廣泛關(guān)注[5]。細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)CYP11A1蛋白貫穿于線粒體內(nèi)膜上,其分子功能主要是催化膽固醇與孕烯醇酮(大多數(shù)類固醇激素前體)發(fā)生側(cè)鏈裂解反應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)孕烯醇酮及其下游類固醇激素的生物學(xué)合成[6]。組織表達(dá)譜分析也證實CYP11A1基因主要在哺乳動物的腎上腺、睪丸、卵巢以及子宮等類固醇激素分泌旺盛的組織高表達(dá)[7]。

21世紀(jì)初對雌性哺乳動物卵巢組織中CYP11A1基因的研究多見于卵泡膜細(xì)胞中[8-9]。隨著對卵巢組織中雌二醇合成過程的深刻解析,近年來的相關(guān)研究表明雌二醇的合成依賴“兩細(xì)胞學(xué)說”,即依賴卵泡膜細(xì)胞(thecal cell)與顆粒細(xì)胞(granulosa cell)。該學(xué)說證實CYP11A1基因在上述2種細(xì)胞中均高表達(dá),并且其編碼蛋白膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)可將膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮,這是雌二醇合成的第一步關(guān)鍵限速步驟,該過程同時發(fā)生在2種細(xì)胞中[10];另外,依賴最后一步關(guān)鍵限速酶(P450arom)可將雄激素轉(zhuǎn)化為雌二醇,但該過程僅發(fā)生在顆粒細(xì)胞中。因此,近年來在卵巢組織中研究雌二醇合成與分泌過程多見于顆粒細(xì)胞中[11-12]。由此,本研究選擇在顆粒細(xì)胞中對CYP11A1基因進(jìn)行相關(guān)試驗。

自發(fā)現(xiàn)至今,CYP11A1基因在生物學(xué)領(lǐng)域中的研究主要集中在雌性哺乳動物卵巢組織發(fā)育、功能發(fā)揮以及生殖疾病等方面[13-14]。對CYP11A1編碼基因的研究卻鮮有報道,同時其表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。目前對該基因的探究(表達(dá)調(diào)控與生物學(xué)功能方面)主要集中在人[15]與小鼠[16]上,而在豬等家畜動物中的研究較少,其關(guān)鍵的理化性質(zhì)與表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚未見報道。因此,本研究以豬CYP11A1基因為研究對象,通過基因克隆測序獲得其編碼區(qū)全長序列并對其序列特征進(jìn)行分析;鑒定豬CYP11A1基因的核心啟動子區(qū)并在豬卵巢顆粒細(xì)胞中分析轉(zhuǎn)錄因子NR2C1對豬CYP11A1基因轉(zhuǎn)錄活性與表達(dá)水平的影響,為進(jìn)一步探究CYP11A1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制以及類固醇激素合成通路的調(diào)控模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

隨機(jī)選取180日齡健康的杜長大三元雜交母豬(南京竹順生物有限公司),屠宰后采集雙側(cè)卵巢,立即置37 ℃生理鹽水中并于2 h內(nèi)帶回實驗室,用于豬卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)與卵巢組織總RNA的提取。

1.2 豬卵巢顆粒細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)

利用預(yù)熱的75%乙醇和生理鹽水將采集的新鮮豬卵巢反復(fù)輕柔沖洗數(shù)次,以徹底去除其表面的血漬及可能殘留的污染源。利用10 mL注射器抽取直徑3～5 mm健康卵泡的卵泡液,1 200 r·min-1離心5 min,吸棄上層渾濁卵泡液,再利用37 ℃磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸并輕柔吹打清洗細(xì)胞2次。將充分重懸的顆粒細(xì)胞以合適的密度接種在含有適量培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)板中,置于37 ℃濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分:DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、15%胎牛血清以及1%青/鏈霉素。靜置36 h待細(xì)胞牢固貼壁后,利用37 ℃PBS清洗細(xì)胞以去除非貼壁細(xì)胞與死亡細(xì)胞,用于后續(xù)試驗。

1.3 細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄(RT)

采用Trizol試劑提取體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細(xì)胞的總RNA,再利用氯仿-異丙醇法對顆粒細(xì)胞總RNA進(jìn)行純化,純化后的RNA于-80 ℃長期保存。利用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊公司)制備cDNA。具體過程如下:吸取500 ng細(xì)胞總RNA,加入2 μL 4×gDNA weeper MIX,混合均勻后42 ℃反應(yīng)2 min,用于去除殘留的DNA,隨后在上述反應(yīng)體系中加入2 μL 5×HiScript Ⅲ qRT Super Mix,混合均勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)。RT反應(yīng)條件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。最終利用DEPC水將獲得的cDNA樣品稀釋2～3倍后于-80 ℃保存。

1.4 引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增和測序

通過NCBI上GenBank數(shù)據(jù)庫獲得豬CYP11A1基因編碼區(qū)序列(NM_214427.1),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計4對相應(yīng)的擴(kuò)增引物。針對豬CYP11A1基因的5′調(diào)控區(qū)序列設(shè)計5對引物,用于構(gòu)建缺失表達(dá)載體。根據(jù)豬CYP11A1、NR2C1(XM_013998075.2)以及GAPDH(NM_001206359.1)基因編碼區(qū)序列分別設(shè)計定量引物并交上海生工生物工程股份有限公司合成。引物詳細(xì)信息見表1。

通過PCR擴(kuò)增獲得相應(yīng)的序列。20 μL PCR反應(yīng)體系:2×VazymeLAmp?Master Mix 10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,50～60 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min·kb-1(35個循環(huán));72 ℃ 5 min;4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物使用15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離檢測,利用凝膠成像系統(tǒng)(美國BIORAD公司)獲取高分辨率圖像。對清晰、單一的目的條帶切膠后,送南京擎科公司測序,再用DNAMAN v6.0和Chromas Pro軟件進(jìn)行分析。

表1 本試驗涉及的引物信息Table 1 Primer information involved in this experiment

1.5 載體構(gòu)建與熒光素酶活性試驗

為了構(gòu)建缺失表達(dá)載體,利用P5—P9引物擴(kuò)增的產(chǎn)物以及pGL3-Basic線性載體用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ與XhoⅠ進(jìn)行雙酶切,經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α中,隨后將單克隆菌落進(jìn)行平板劃線擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得相應(yīng)的陽性重組質(zhì)粒,并將其命名為pCYP11A1;豬NR2C1基因的真核生物表達(dá)載體pcDNA3.1-NR2C1來源于本課題組前期構(gòu)建。

熒光素酶活性試驗:在豬卵巢顆粒細(xì)胞中完成。轉(zhuǎn)染24 h后,收集細(xì)胞并用熒光素酶活性檢測試劑盒(美國Promega公司)檢測樣品中的螢火蟲熒光與海腎熒光活性。熒光相對活性為螢火蟲熒光與海腎熒光的比值。每組設(shè)立3個獨(dú)立重復(fù)樣本。

1.6 RT-qPCR檢測基因的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染24 h后,收集體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細(xì)胞,按上述方法提取細(xì)胞總RNA后,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板,用AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(南京諾唯贊公司)對NR2C1和CYP11A1基因mRNA水平進(jìn)行定量分析。所用引物序列見表1。以GAPDH作為內(nèi)參基因。每組設(shè)立3個重復(fù)樣本,采用2-ΔΔCT法計算相對表達(dá)量。

1.7 Western blot檢測蛋白的表達(dá)水平

體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,使用預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞,4 ℃、12 000 r·min-1離心3 min,收集上清液即為細(xì)胞總蛋白裂解物。采用BCA法測定每個蛋白質(zhì)樣品的濃度,然后稀釋成同一濃度后于-20 ℃保存。利用Western blot對CYP11A1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。具體操作參見文獻(xiàn)[17]。本試驗采用0.25%牛血清白蛋白(BSA)溶液稀釋抗體。試驗所用一抗如下:兔NR2C1抗體(1∶1 000,Abconal)、兔CYP11A1抗體(1∶1 000,Sangon Biotech)、鼠GAPDH抗體(1∶1 000,Sangon Biotech)。二抗有辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗兔lgG抗體(1∶1 000,Sangon Biotech)以及山羊抗小鼠lgG抗體(1∶1 000,Sangon Biotech)。

1.8 染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)檢測轉(zhuǎn)錄因子NR5A1與CYP11A1基因啟動子區(qū)的結(jié)合

ChIP試驗具體步驟參照文獻(xiàn)[18]。用1%甲醛溶液固定顆粒細(xì)胞10 min,加入甘氨酸終止交聯(lián)。用超聲波破碎儀將交聯(lián)染色質(zhì)切割成500 bp左右的片段,使用5 μg兔NR2C1抗體(Abconal)在豬卵巢顆粒細(xì)胞中分離CYP11A1-DNA復(fù)合物,用酚氯仿提取純化目的蛋白上的DNA,通過PCR分析獲取DNA片段富集情況。以辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗兔lgG抗體作為陰性對照,未進(jìn)行處理的染色質(zhì)作為總樣本對照。ChIP試驗所用引物信息見表1。

1.9 生物信息學(xué)分析

利用BioXM 2.6和DNAMAN v6.0軟件對豬CYP11A1基因編碼區(qū)核苷酸序列進(jìn)行分析。利用BDGP數(shù)據(jù)庫(https://fruitfly.org/seqtools/promoter.html)和Promoter 2.0 Prediction Server在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)對豬CYP11A1基因的潛在核心啟動子區(qū)進(jìn)行初步預(yù)測。利用EMBOSS Cpgplot與MethPrimer在線分析系統(tǒng)對豬CYP11A1基因5′調(diào)控區(qū)潛在的CpG島進(jìn)行預(yù)測。利用JASPAR在線數(shù)據(jù)庫(http://jaspar.genereg.net/)分析豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad v8.0軟件與IBM SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,然后利用雙尾t檢驗分析2組之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬CYP11A1基因編碼區(qū)序列擴(kuò)增

利用引物P1—P4對豬CYP11A1基因編碼區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1-A),擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結(jié)果表明:在相應(yīng)的退火溫度下均能得到單一、清晰、明亮且與設(shè)計目的長度一致的特異性擴(kuò)增條帶(圖1-B)。通過克隆測序證實,利用P1—P4引物對的特異性擴(kuò)增片段長度依次為492、519、463和480 bp,與預(yù)期目的片段長度一致。

圖1 豬CYP11A1基因編碼區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The PCR amplified product of the coding region of the pig CYP11A1 gene A.CYP11A1編碼區(qū)序列擴(kuò)增示意圖;B.P1—P4引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物(M:2 000 bp標(biāo)準(zhǔn)品)。A.Schematic diagram of amplification of CYP11A1 coding region sequence;B.P1-P4 amplification product(M:2 000 bp marker).

2.2 豬CYP11A1基因編碼區(qū)核苷酸序列特征分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆、測序以及序列拼接后,獲得豬CYP11A1基因編碼區(qū)全序列,序列長度為1 563 bp(圖2-A),與豬基因組序列信息比對后發(fā)現(xiàn)豬CYP11A1基因由9個外顯子與8個內(nèi)含子組成(圖2-B)。采用BioEdit 7.0軟件對豬CYP11A1基因核苷酸序列的堿基組成進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)豬CYP11A1基因核苷酸序列中A、T、C、G堿基數(shù)分別為378、348、435、402個,分析堿基含量發(fā)現(xiàn)嘌呤堿基(A+G)含量為49.9%,嘧啶含量(C+T)為50.1%,表明A+G含量與C+T含量基本相當(dāng)(圖2-C)。通過BLAST對比分析豬CYP11A1基因編碼區(qū)序列與人(NM_000781.3)、牛(NM_176644.2)、綿羊(NM_001093789.1)、馬(NM_001082521.1)、兔(XM_008253734.2)以及黑猩猩(NM_001280408.1)等哺乳動物的相似性分別為84.16%、87.84%、87.40%、84.77%、78.16%、83.78%;而與雞(NM_001001756.1)和斑馬魚(NM_152953.2)等非哺乳動物的相似性分別為58.85%和48.41%(圖2-D),表明CYP11A1基因在哺乳動物中具有較高的序列保守性。進(jìn)一步分析序列進(jìn)化保守性發(fā)現(xiàn)CYP11A1基因在豬、牛和綿羊等哺乳動物中具有較高程度的進(jìn)化保守性(圖2-E)。

2.3 豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)鑒定

為了鑒定豬CYP11A1基因的核心啟動子區(qū),根據(jù)豬CYP11A1基因5′調(diào)控區(qū)序列設(shè)計了5對特異性引物P5—P9,能在最適退火溫度下得到清晰、明亮且符合預(yù)期大小的電泳條帶(圖3-A)。將目的條帶進(jìn)行切膠回收、純化、克隆測序與序列拼接最終獲得豬CYP11A1基因 5′調(diào)控區(qū)序列,并成功構(gòu)建相應(yīng)的缺失表達(dá)熒光報告載體(圖3-B)。分別將各個重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細(xì)胞,熒光素酶活性試驗結(jié)果顯示pCYP11A1-140與pCYP11A1-430之間的熒光活性呈現(xiàn)顯著差異,即pCYP11A1-430的熒光活性極顯著高于pCYP11A1-140(P<0.01,圖3-C),表明豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)位于-398～-108 bp(轉(zhuǎn)錄起始位點作為+1)。

圖2 豬CYP11A1基因編碼區(qū)核苷酸序列特征分析Fig.2 Characteristic analysis of the nucleotide sequence of the coding region of pig CYP11A1 gene A.編碼區(qū)核苷酸序列;B.序列組成;C.序列堿基含量;D.序列同源性分析;E.進(jìn)化保守性分析。A.Coding region nucleotide sequence;B.Sequence composition of coding region;C.Sequence composition;D.Sequence homology analysis;E.Evolutionary conservation analysis.

圖3 豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)鑒定Fig.3 Identification of the core promoter region in pig CYP11A1 geneA.P5—P9引物產(chǎn)物(M:2 000 bp標(biāo)準(zhǔn)品);B.構(gòu)建載體的示意圖;C.熒光素酶活性試驗。A.P5-P9 amplification product(M:2 000 bp marker);B.Schematic diagram of vector construction;C.Luciferase activity test.

2.4 豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)序列特征分析

序列分析發(fā)現(xiàn)豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)由291個堿基組成(圖4-A),其中A堿基61個(21%)、T堿基89個(30.6%)、C堿基63個(21.6%)、G堿基78個(26.8%)。嘌呤堿基(A+G)含量為47.8%,嘧啶含量(C+T)為52.2%,表明A+G含量略低于C+T含量(圖4-B)。利用JASPAR在線數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)包含多個潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,例如核受體亞家族2C組成員1(nuclear receptor subfamily 2,group C,member 1,NR2C1)、SRY-盒轉(zhuǎn)錄因子10(SRY-box transcription factor 10,SOX10)、核因子Ⅸ(nuclear factor Ⅸ,NFIX)和E74樣ETS轉(zhuǎn)錄因子5(E74 like ETS transcription factor 5,ELF5)等(圖4-C)。通過在線軟件EMBOSS分析發(fā)現(xiàn),在豬CYP11A1基因啟動子區(qū)共鑒定15個潛在的甲基化位點(CG位點),其中4個位點定位于近端啟動子區(qū)(0～-400 bp)、8個位于中遠(yuǎn)端啟動子區(qū)(-800～-1 200 bp)、3個位于遠(yuǎn)端啟動子區(qū)(-1 200～-1 600 bp)(圖4-D);在線軟件MethPrimer分析發(fā)現(xiàn)在豬CYP11A1基因近端、中遠(yuǎn)端和遠(yuǎn)端啟動子區(qū)有3個潛在的高甲基化區(qū)域,跟甲基化位點(CG位點)的位置是對應(yīng)的(圖4-E),但并未預(yù)測到相應(yīng)的CpG島。提示豬CYP11A1基因的轉(zhuǎn)錄可能在一定程度上受DNA甲基化的影響。

圖4 豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)序列特征分析Fig.4 Sequence analysis of porcine CYP11A1 gene core promoter region 1)A.核心啟動子區(qū)堿基組成Base composition and ratio of core promoter region;B.核心啟動子區(qū)堿基數(shù)及組成Base number and composition of core promoter region;C.潛在轉(zhuǎn)錄因子生物信息學(xué)分析Bioinformatics analysis of potential transcription factors;D.利用EMBOSS Cpgplot分析CG位點Analysis of CG sites by EMBOSS Cpgplot;E.利用MethPrimer分析甲基化區(qū)域Analysis of methylated regions by MethPrimer。2)NR2C1:核受體亞家族2C組成員1 Nuclear receptor subfamily 2,group C,member 1;MAZ:MYC相關(guān)鋅指蛋白 MYC associated zinc finger protein;ELF5:E74樣ETS 轉(zhuǎn)錄因子5 E74 like ETS transcription factor 5;NR2F1:核受體亞家族2F組成員1 Nuclear receptor subfamily 2 group F member 1;ZNF263:鋅指蛋白263 Zinc finger protein 263;VDR:維生素D受體 Vitamin D receptor;ZBTB6:鋅指和BTB結(jié)構(gòu)域6 Zinc finger and BTB domain containing 6;NFATC2:活化T細(xì)胞的核因子2 Nuclear factor of activated T cells 2;ZBTB12:鋅指和BTB結(jié)構(gòu)域12 Zinc finger and BTB domain containing 12;NFIX:核因子IX Nuclear factor IX;SOX10:SRY-box轉(zhuǎn)錄因子10 SRY-box transcription factor 10;FOXC1:叉頭盒C1 Forkhead box C1;FOXL1:叉頭盒L1 Forkhead box C1.

2.5 轉(zhuǎn)錄因子NR2C1對豬卵泡顆粒細(xì)胞中CYP11A1基因轉(zhuǎn)錄的影響

根據(jù)圖4-C的分析結(jié)果可知,轉(zhuǎn)錄因子NR2C1與豬CYP11A1基因的核心啟動子區(qū)存在較強(qiáng)的互作結(jié)合能力(預(yù)測分值為11.039 00),因此選擇轉(zhuǎn)錄因子NR2C1進(jìn)行后續(xù)研究。首先將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NR2C1瞬時轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細(xì)胞,分別通過RT-qPCR和Western blot方法檢測NR2C1的mRNA與蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NR2C1能夠極顯著上調(diào)豬卵巢顆粒細(xì)胞中NR2C1基因mRNA(圖5-A,P<0.01)與蛋白表達(dá)水平(圖5-B,P<0.05),表明豬NR2C1基因真核生物表達(dá)載體構(gòu)建成功。根據(jù)JASPAR數(shù)據(jù)庫信息,CYP11A1核心啟動子區(qū)有1個潛在的轉(zhuǎn)錄因子NR2C1的結(jié)合位點。RT-qPCR和Western blot結(jié)果證實NR2C1過表達(dá)可極顯著促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞中CYP11A1基因mRNA(圖5-C,P<0.01)與蛋白表達(dá)水平(圖5-D,P<0.01)。另外,熒光素酶活性試驗證實,NR2C1過表達(dá)能夠極顯著促進(jìn)CYP11A1基因核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性(圖5-E,P<0.01)。通過ChIP試驗證實在豬卵巢顆粒細(xì)胞中,轉(zhuǎn)錄因子NR2C1能夠與CYP11A1基因核心啟動子區(qū)特異性結(jié)合(圖5-F)。上述結(jié)果表明在豬卵巢顆粒細(xì)胞中,轉(zhuǎn)錄因子NR2C1能夠通過上調(diào)CYP11A1基因核心啟動子區(qū)活性來促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。

圖5 轉(zhuǎn)錄因子NR2C1對豬卵巢顆粒細(xì)胞中CYP11A1基因和蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of transcription factor NR2C1 on gene and protein expression of CYP11A1 in porcine ovarian granulosa cells A.RT-qPCR檢測NR2C1 mRNA的表達(dá)水平;B.Western blot檢測NR2C1蛋白的表達(dá)水平;C.過表達(dá)NR2C1對CYP11A1 mRNA水平的影響;D.過表達(dá)NR2C1對CYP11A1蛋白水平的影響;E.過表達(dá)NR2C1對CYP11A1基因核心啟動子活性的影響;F.ChIP試驗鑒定NR2C1與CYP11A1核心啟動子的結(jié)合特性(M:2 000 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)品;Blank:空白對照;Input:陽性對照)。A.The mRNA levels of NR2C1 are measured by RT-qPCR;B.The protein levels of NR2C1 are detected by Western blot;C.The effect of NR2C1 overexpression on CYP11A1 mRNA expression level;D.The effect of NR2C1 overexpression on the protein expression level of CYP11A1;E.The effect of NR2C1 overexpression on the activity of CYP11A1 gene core promoter;F.ChIP assay was performed to analyze the enrichment of NR2C1 on the core promoter of CYP11A1(M indicates 2 000 bp DNA marker;Blank indicates blank control;Input indicates positive control).

3 討論

自20世紀(jì)80年代CYP11A1基因首次在人體組織中發(fā)現(xiàn)以來,CYP11A1基因與其編碼蛋白相繼在鼠[19]、牛[20]、綿羊[21]等多個哺乳動物中成功鑒定,然而目前關(guān)于豬CYP11A1基因及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究卻鮮有報道。本研究通過克隆擴(kuò)增與測序技術(shù)獲得了豬CYP11A1基因編碼區(qū)全序列,再通過對CYP11A1基因編碼區(qū)序列同源性比較發(fā)現(xiàn)其核苷酸序列與其他哺乳動物的一致性均高于84%,表明CYP11A1基因在哺乳動物進(jìn)化過程中具有高度保守性,這也從另一方面說明CYP11A1基因在哺乳動物中所發(fā)揮的相關(guān)生物學(xué)功能是穩(wěn)定和必不可少的。在蛋白質(zhì)構(gòu)成方面,CYP11A1蛋白與其他糖蛋白和具有潛伏肽的蛋白不同,其僅由1個相對分子質(zhì)量約為50×103的蛋白質(zhì)肽鏈構(gòu)成。有研究表明CYP11A1蛋白在正常狀態(tài)下并不存在相關(guān)蛋白修飾,這對其功能的完整性和敏感性至關(guān)重要[22]。研究表明MTS突變可導(dǎo)致CYP11A1發(fā)生折疊錯誤并引起定位改變,進(jìn)而在絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase pim-1,PIM1)的作用下降解[23];另外,F-G loop作為CYP11A1蛋白特異性功能結(jié)構(gòu)域在識別、結(jié)合及催化線粒體內(nèi)類固醇的過程中起到至關(guān)重要的作用[24]。研究證實CYP11A1蛋白存在的一系列功能結(jié)構(gòu)域與其亞細(xì)胞定位、空間結(jié)構(gòu)以及功能完整性相關(guān)。因此,我們的后續(xù)研究將會著重探討豬CYP11A1蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)YP11A1蛋白功能的影響以及對母豬繁殖性狀調(diào)控的分子機(jī)制。

近年來,研究發(fā)現(xiàn)CYP11A1作為類固醇激素的第一步合成酶,其表達(dá)與活性的異?？蓪?dǎo)致多種疾病的發(fā)生,主要包括幼兒與老人腎功能不全、雌性繁殖障礙、免疫障礙以及癌癥等[25-26]。然而,目前僅在人和小鼠中對CYP11A1基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探究,而對豬等大型家畜CYP11A1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制少有報道[27]。因此,本研究首先通過構(gòu)建缺失表達(dá)載體與熒光素酶活性試驗鑒定了豬CYP11A1基因核心啟動子位于近端調(diào)控區(qū),而這與前人對人和小鼠等哺乳動物的研究一致,證實哺乳動物CYP11A1基因的核心啟動子位于近端500 bp范圍內(nèi)[28]。另外,轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達(dá)的重要環(huán)節(jié),轉(zhuǎn)錄啟動是眾多順式作用元件與反式作用因子相互作用的結(jié)果[29]。前人研究證實人與小鼠CYP11A1近端核心啟動子區(qū)主要受到剪接因子1(splicing factor 1,SF-1)[30]、特異性蛋白1(specificity protein 1,SP1)[31]以及神經(jīng)纖維蛋白1(neurofibromin 1,NF-1)[32]等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,而本研究利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),除了上述幾個已確定的轉(zhuǎn)錄因子外,豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)還包含其他多種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合元件,例如核受體亞家族2C組成員1(nuclear receptor subfamily 2,group C,member 1,NR2C1)、SRY-box轉(zhuǎn)錄因子10(SRY-box transcription factor 10,SOX10)、核因子Ⅸ(nuclear factor Ⅸ,NFIX)和E74樣ETS轉(zhuǎn)錄因子5(E74 like ETS transcription factor 5,ELF5)等,以上結(jié)果提示這些轉(zhuǎn)錄因子可能在豬CYP11A1基因轉(zhuǎn)錄啟動過程中發(fā)揮重要作用。本研究證實NR2C1過表達(dá)可顯著促進(jìn)CYP11A1基因核心啟動子區(qū)活性,同時顯著上調(diào)體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細(xì)胞中CYP11A1基因的轉(zhuǎn)錄水平,為解析豬CYP11A1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制以及拓展類固醇合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了一定的參考。另外,DNA甲基化與組蛋白修飾是哺乳動物基因表達(dá)過程中最為常見的表觀遺傳修飾,它們可以誘導(dǎo)基因在生物體正常生理或病理狀態(tài)下的表達(dá)與沉默[33]。DNA甲基化與組蛋白修飾相關(guān),這些表觀遺傳修飾的相互作用對于通過改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象調(diào)控基因組功能至關(guān)重要[34]。本研究通過生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)豬CYP11A1基因啟動子區(qū)存在15個潛在的甲基化位點(CG位點),其中有4個位于近端核心啟動子區(qū),而這與前人的研究結(jié)果基本一致[35]。但與其他哺乳動物研究不同的是,我們在豬CYP11A1基因的中端與遠(yuǎn)端啟動子上分別發(fā)現(xiàn)了多個潛在的甲基化位點,推測豬CYP11A1基因轉(zhuǎn)錄可能在一定程度上受到DNA甲基化的影響,但更深層次的機(jī)制仍需要進(jìn)一步探究。