劉路平,劉高峰,蔣程,侯喜林

(南京農業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室/農業(yè)農村部華東地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室/園藝作物種質創(chuàng)新與利用教育部工程研究中心/南京蘇曼等離子工程研究院,江蘇 南京 210095)

不結球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis),起源于中國,屬于十字花科(Cruciferae)蕓薹屬蕓薹種的亞種之一[1]。不結球白菜因其適應性強、生長周期短、營養(yǎng)價值高且豐富、栽培方法簡單和易于加工等特點,受到人們的青睞,特別適合長江流域地區(qū)種植[2]。不結球白菜喜冷涼氣候,而我國南方地區(qū)夏季高溫多雨,對其栽培造成一定的影響,例如限制生長速度、口感變苦變澀、病毒病嚴重、苗期的死亡率升高、纖維含量提高、葉片變黃腐爛等[3-4]。因此,為滿足不結球白菜周年供應的需求,需要進行不結球白菜的耐高溫性研究,選育優(yōu)良耐高溫品種。

溫度是影響植物生長發(fā)育和形態(tài)建成過程中的最主要生態(tài)因子,在很大程度上影響植物的生長發(fā)育及其他代謝活動[5]。高溫和低溫脅迫均會影響植物的生長發(fā)育與形態(tài)建成及其他正常代謝活動。近年來,全球氣溫變動幅度普遍增大,夏秋季節(jié)溫度日益增高,對不結球白菜的生長發(fā)育造成了不利影響[6]。研究表明,溫度短時間升高10～15 ℃會導致不結球白菜停止生長發(fā)育[7-9]。1996年,Souer等[10]從矮牽牛中克隆獲得世界上首個NAC(NAM/ATAF/CUC)基因。之后,相繼在擬南芥[11]、小麥[12]、水稻[13]、大麥[14]、馬鈴薯[15]、油菜[16]、南瓜[17]以及甘蔗[18]等物種中發(fā)現(xiàn)NAC基因。研究表明,NAC基因功能具有多樣性,參與調控植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成、信號轉導以及響應各種生物、非生物脅迫,而有關不結球白菜NAC基因的相關研究鮮見報道。因此,本研究通過同源克隆獲得不結球白菜BcNAC036基因的cDNA全長片段;通過同源重組構建過表達載體pCAMBIA1302-BcNAC036-GFP;通過農桿菌介導法將過表達載體導入煙草葉片,通過激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白BcNAC036的亞細胞定位;通過RT-qPCR技術檢測不結球白菜熱敏感品種‘矮腳黃’和耐高溫品種‘蘇州青’以及擬南芥過表達植株中BcNAC036基因的表達量,旨在探索BcNAC036基因在耐高溫處理中的響應機制,從而對不結球白菜的栽培和管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

不結球白菜耐高溫品種‘蘇州青’、熱敏感品種‘矮腳黃’以及哥倫比亞擬南芥野生型品種由南京農業(yè)大學園藝學院白菜課題組提供。室溫環(huán)境中,將無菌水清洗后的種子,放入培養(yǎng)皿中催芽24～48 h;將發(fā)芽種子移栽至穴盤中,置于人工氣候室(光/暗時間為16 h/8 h、晝/夜溫度為24 ℃/16 ℃、濕度為75%)中培養(yǎng),待第2片真葉完全展開時取葉片,液氮速凍,于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 葉片總RNA的提取和cDNA的合成取0.2 g‘蘇州青’葉片(4葉期)充分研磨后,根據(jù)植物RNA抽提試劑盒(TaKaRa)中的說明書提取樣品總RNA,參照Goldenstar TtMm RT6 cDNA synthesis Mix(gDNA)試劑盒(南京擎科生物科技有限公司)中的說明書將抽提的總RNA反轉錄成cDNA。

1.2.2 不結球白菜BcNAC036基因全長的克隆在不結球白菜數(shù)據(jù)庫(http://nhccbase.njau.edu.cn/website/)中BLAST擬南芥NAC036的同源基因BcNAC036(CabbageG_a_f_g042163)序列,并通過SnapaGene軟件設計該基因PCR擴增所需的特異性引物BcNAC036-F/R(表1)。以‘蘇州青’RNA反轉錄獲得的cDNA為模板進行PCR擴增,擴增體系(50 μL):模板cDNA 1 μL,上、下游引物各2 μL,I-5TM High-Fidelity Master Mix(2×)25 μL,ddH2O 20 μL。反應程序:98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 15 s,共30個循環(huán);72 ℃ 5 min;4 ℃ 保存。用瓊脂糖凝膠(12 g·L-1)檢測PCR產物,比對Marker判斷條帶大小正確后切下,并按照膠回收試劑盒(南京擎科生物科技有限公司)的說明書進行回收純化。將純化之后得到的產物連接到平末端的pClone007 Blunt載體(南京擎科生物科技有限公司)上,隨后轉大腸桿菌感受態(tài)DH5α,挑選單個陽性菌落PCR檢測之后送南京擎科生物科技有限公司測序,測序正確的記為BcNAC036-pClone007。

表1 本文所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

1.2.3 序列分析在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST并下載與不結球白菜BcNAC036同源性高的其他物種的NAC036基因及氨基酸序列;采用DNAMAN 9.0軟件[19]分析NCBI上所下載的序列;采用MEGA X軟件[20]進行系統(tǒng)進化樹分析。NAC036蛋白的理化性質分析通過Online工具中ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)進行。

1.2.4BcNAC036基因片段的PCR擴增以pClone007 Blunt作為入門載體,并設計特異性引物BcNAC036-F1/R1,使用I-5TM High-Fidelity Master Mix(南京擎科生物科技有限公司)進行PCR擴增,模板為BcNAC036-pClone007質粒,反應體系及程序同1.2.2節(jié)。PCR產物純化回收方法同1.2.2節(jié)。

1.2.5 構建亞細胞定位表達載體表達載體pCAMBIA1302用限制性內切酶(SacⅠ、SalⅠ)進行雙酶切(37 ℃,30 min),同源重組法構建過表達載體總體系(10 μL):pCAMBIA1302 3.5 μL,基因片段膠回收產物 0.5 μL,SoSoo Mix(2×)5 μL,ddH2O 1 μL。反應程序:50 ℃ 15 min。反應產物轉大腸桿菌感受態(tài)DH5α,并涂布于含卡那霉素(50 mg·L-1)的固體LB培養(yǎng)基上,37 ℃倒置培養(yǎng)12～14 h,菌落(單克隆)PCR檢測,鑒定陽性克隆并送至南京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.6 BcNAC036的亞細胞定位將同源重組法構建的表達載體pCAMBIA1302-BcNAC036-GFP導入GV3101農桿菌感受態(tài)(液氮轉化法),涂布方法同1.2.5節(jié),28 ℃倒置培養(yǎng)2 d,菌落檢測方法見1.2.5節(jié)。將菌檢正確的菌液置于含卡那霉素(50 mg·L-1)的液體LB培養(yǎng)基中:28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)20 h,之后在含有相同濃度抗生素的培養(yǎng)基中進行菌液擴大培養(yǎng)。當D600值約為1.0時,4 000 r·min-1離心5 min,用注射緩沖液[MgCl210 mmol·L-1、MES(pH5.7)10 mmol·L-1、乙酰丁香酮150 μmol·L-1]重懸管底菌斑,并調節(jié)D600值約為0.8,靜置 5 h,用1 mL針管注射器在本氏煙草葉片的背面緩慢注入菌液,以H2B-RFP作為對照(顯示細胞核位置)。將注入菌液后的煙草重新放回人工氣候室(光/暗時間為16 h/8 h,晝/夜溫度為 22 ℃/18 ℃)恢復培養(yǎng)72 h,通過激(熒)光共聚焦顯微鏡來觀察和分析蛋白BcNAC036的亞細胞定位。

1.2.7 不結球白菜幼苗的高溫處理將種子室溫催芽1～2 d,移植于小花盆(移栽時芽朝上)并置于人工氣候室(光/暗時間為16 h/8 h,晝/夜溫度為22 ℃/17 ℃,環(huán)境濕度為 60%)中培養(yǎng)。待植株生長至25 d,約第6片葉完全展開時,對其進行高溫(43 ℃)處理,光照、濕度均按正常設置,并于處理0、2、5 h時取葉片樣品。每個樣品3個生物學重復。

1.2.8BcNAC036基因導入擬南芥植株將含有pCAMBIA1302-BcNAC036-GFP農桿菌接種于含抗生素利福平(50 μg·mL-1)和卡那霉素(50 μg·mL-1)的雙抗LB液體培養(yǎng)基,28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)16 h,5 000 r·min-1離心20 min后棄上清液,并用滲透緩沖液(25 g蔗糖、1/2MS、100 μL siluetl-77、170 μL NaOH)懸浮沉淀菌液。侵染盛花期擬南芥80 s,侵染2次后等待收種。將消毒處理后的種子播種于含抗生素(潮霉素10 μg·mL-1+特美汀16 μg·mL-1)的MS固體培養(yǎng)基中,放置在人工氣候室,15 d后觀察篩選出的植株并移植于穴盤中,15 d后取樣,按照植物基因組DNA提取試劑盒(南京擎科生物科技有限公司)說明書提取樣品的DNA,作為PCR檢測的模板篩選陽性植株,收取成熟種子記為T1代種子,同理將T1代種子繼續(xù)篩種,所收取種子即為T2代,同樣方法篩選出T3代種子。

1.2.9BcNAC036轉基因擬南芥植株耐熱性分析將T3代種子播種于MS固體培養(yǎng)基上,以野生哥倫比亞型擬南芥為對照,于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d,然后進行43 ℃、6 h高溫處理,最后置于人工氣候室恢復3 d后拍照并計算其存活率。

1.2.10BcNAC036基因的RT-qPCR分析按照RNA Simple Total RNA Kit(Tiangen)中的說明步驟提取葉片中的總RNA,參照Goldenstar TtMm RT6 cDNA synthesis Mix(gDNA)試劑盒說明書進行操作并將提取的總RNA反轉錄合成 cDNA(反轉錄時按照1∶1的濃度添加樣品)。使用NCBI在線工具設計熒光定量特異性引物(表1)。試驗反應液按照SYBRPremixExTaq試劑盒(TaKaRa)中的說明書添加。RT-qPCR程序分為2個步驟:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán);熔解曲線65 ℃ 10 s,61個循環(huán)?；虻南鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCT法分析與計算[21],所有數(shù)據(jù)通過SPSSAU在線軟件工具和WPS中Excel 2003文件程序分析顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不結球白菜BcNAC036基因的克隆及序列分析

以不結球白菜‘蘇州青’的cDNA為模板,設計擴增特異性引物BcNAC036-F/R,擴增出的條帶大小約為840 bp(圖1)。經過序列分析,BcNAC036基因的開放閱讀框(ORF)為840 bp,編碼的氨基酸數(shù)為279(圖2)。測序結果顯示,PCR擴增的產物片段大小與BcNAC036基因完全相同。

圖1 不結球白菜BcNAC036基因的克隆Fig.1 Cloning of the BcNAC036 gene in non-heading Chinese cabbageM. DL2000 marker;1～9. BcNAC036擴增產物 BcNAC036 amplification product.

圖2 BcNAC036基因的核苷酸序列及所編碼的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of BcNAC036 gene and its encoded amino acid sequence*表示終止密碼子。*represents stop codon.

2.2 BcNAC036的氨基酸理化性質

ProtParam在線軟件分析結果顯示:BcNAC036基因所編碼蛋白的化學分子式為C1437H2250N392O420S13,該蛋白包含279個氨基酸,相對分子質量為32 154.83,理論等電點為8.96,包含正電殘基(Asp+Glu)和負電殘基(Arg+Lys)數(shù)量分別為是34和39,基本斷定其為酸性蛋白;不穩(wěn)定系數(shù)為46.18,表明該蛋白穩(wěn)定性較低;脂肪系數(shù)和平均相對親水系數(shù)分別為70.90和-0.668,表明其親水性較高。

2.3 BcNAC036系統(tǒng)進化分析

BLASTp檢索[22]結果顯示,BcNAC036與同屬的一些物種例如蕪菁(B.rapa)、甘藍型油菜(B.napus)和甘藍(B.oleraceavar.oleracea)的同源性分別為100%、98%和97%。因此判斷出BcNAC036和BraNAC036在結構、序列和功能上呈現(xiàn)出一定程度的相似性。從BLAST結果中下載10個與BcNAC036同源性不低于80%且同屬于十字花科物種如蘿卜(Raphanussativas)、小花南芥(Arabisalpina)、擬南芥(Arabidopsisthalinan)、芥菜(Capsellarubella)等的氨基酸序列,用氨基酸序列比對軟件DNAMAN 9.0對下載的11個序列進行比對分析,結果(圖3)表明,不結球白菜BcNAC036保守性較高。用進化樹構建軟件MEGA X對下載的11個序列進行系統(tǒng)進化分析,結果(圖4)表明NAC036進化符合植物分類學地位,BcNAC036蛋白與同為蕓薹屬的蕪菁BraNAC036蛋白同源關系最近。

圖3 不結球白菜和其他十字花科物種NAC036蛋白的氨基酸序列比對Fig.3 Comparison of the amino acid sequence of NAC036 protein of non-heading Chinese cabbage and other Cruciferae species Ⅰ.不結球白菜Brassica campestris ssp. chinese;Ⅱ.蕪菁Brassica rapa XP_009112413.1;Ⅲ.甘藍型油菜Brassica napus CDY47486.1;Ⅳ.甘藍Brassica oleracea var. oleracea XP_013609230.1;Ⅴ.蘿卜Raphanus sativus XP_018457954.1;Ⅵ.山萮菜Eutrema salsugineum XP_006409356.1;Ⅶ.小花南芥Arabis alpine KFK_40091.1;Ⅷ.亞麻薺Camelina sativa XP_010515693.1;Ⅸ.玉山筷子芥Arabidopsis lyrata subsp. lyrata XP_002884035.1;Ⅹ.芥菜Capsella rubella XP_006298285.1;Ⅺ.擬南芥Arabidopsis thaliana OAP11171.1.

圖4 不結球白菜與其他十字花科物種的NAC036蛋白的進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of NAC036 proteins in non-heading Chinese cabbage and other Cruciferae species

2.4 BcNAC036的亞細胞定位分析

由圖5可見:在GFP激發(fā)光通道下,表達載體pCAMBIA1302-BcNAC036-GFP顯示綠色熒光信號,在RFP激發(fā)光通道細胞核顯示紅色熒光信號,表明是煙草的細胞核位置;疊加圖中顯示的黃色熒光信號(紅色與綠色熒光重合)位置是在細胞核,說明BcNAC036蛋白定位在細胞核。

圖5 BcNAC036在本氏煙草葉片中的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of BcNAC036 in leaves of Nicotinan benthamiana熒光信號:綠色來自于GFP;紅色來自于RFP;黃色是綠色和紅色重合疊加而來。Fluorescence signal:Green comes from GFP;Red comes from RFP;Yellow is the result of overlapping of green and red.

2.5 不結球白菜高溫處理后表型變化及基因BcNAC036的表達分析

由圖6可見:熱敏感品種‘矮腳黃’與耐高溫品種‘蘇州青’相比,其葉卷曲程度嚴重,伴隨出現(xiàn)植株萎蔫現(xiàn)象。由圖7可見:BcNAC036基因在‘矮腳黃’中表達量明顯高于‘蘇州青’,且高溫處理后2個品種的表達量均呈急劇下降的趨勢,表明該基因與不結球白菜耐熱性呈負相關,即耐熱性越高其相對表達量越低。

圖6 高溫處理后‘蘇州青’(左)和‘矮腳黃’(右)表型變化Fig.6 Phenotypic changes of ‘Suzhouqing’(left)and‘Aijiaohuang’(right) after high temperature treatment

圖7 高溫處理后‘蘇州青’和‘矮腳黃’BcNAC036基因表達量Fig.7 Expression level of BcNAC036 gene of ‘Suzhouqing’and ‘Aijiaohuang’ after high temperature treatment**P<0.01. The same as follows.

圖8 轉基因擬南芥BcNAC036過表達分析Fig.8 Overexpression analysis of BcNAC036 in transgenic Arabidopsis thaliana WT:野生型 Wild-type;1#、3#、10#:轉基因株系Transgenic plant. 下同。The same as follows.

2.6 轉基因擬南芥植株的鑒定

PCR擴增篩選出6個擬南芥的轉基因株系,T3代種群中選擇3個株系記為1#、3#、10#,對其進行高溫處理,其相對表達量分析結果(圖8)顯示,野生型的表達量要遠遠低于3個轉基因株系的,證實BcNAC036基因轉擬南芥成功。

2.7 BcNAC036基因過表達擬南芥植株耐熱性分析

由圖9-A可見:轉基因株系與野生型的生長情況基本一致。高溫處理后野生型基本都存活,而轉基因株系存活較少(圖9-B)。分別統(tǒng)計過表達的轉基因和野生型擬南芥的成活率,結果顯示:野生型成活率為90%,而1#、3#、10#的成活率分別是40%、45%、46%(圖9-C)。

圖9 轉基因與野生型擬南芥幼苗耐熱性鑒定(A、B)及成活率(C)Fig.9 Identification of high temperature resistance of transgenic and wild-type A. thaliana seedlings(A,B)and survival rate(C)

3 討論

在植物生長發(fā)育過程中都會受到熱害、寒害、凍害、干旱和鹽脅迫的影響,嚴重情況下會導致植物死亡。NAC轉錄因子在植物生長發(fā)育、形態(tài)建成以及響應各種生物、非生物脅迫的過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。本研究結果顯示,BcNAC036蛋白表達部位僅存在于細胞核,推測BcNAC036具備轉錄因子的功能,是參與調控植物耐熱途徑調控機制的關鍵基因。

本研究克隆得到BcNAC036基因,通過對其進行生物信息學分析,在該蛋白7～134個氨基酸殘基存在1個NAM蛋白結構域,是DNA結合區(qū)域。Duval等[23]從擬南芥cDNA文庫中分離到1個NAC結構域基因AtNAM。AtNAM的轉錄激活域,位于蛋白質的C端區(qū)域,在含NAC域的基因中,是1個高度分化的區(qū)域。不結球白菜NAC蛋白在NAM區(qū)域與ANAC036的氨基酸序列具有高度同源性。Nakashima等[24]對水稻NAC轉錄因子OsNAC6的功能進行研究,結果表明,在寒冷、干旱、高鹽等非生物脅迫條件下,OsNAC6基因表達上調,且OsNAC6具有轉錄激活的功能;過表達OsNAC6水稻植株中,與非生物和生物脅迫相關的基因表達上調。在擬南芥中,響應水楊酸或茉莉酸途徑的各種NAC基因突變體,延緩擬南芥生長[25]。研究顯示,擬南芥ONAC022亞群中2個NAC蛋白成員的功能被驗證,ANAC034和ANAC035參與調控花期和冷應激反應[26];ANAC009控制根帽干細胞有限區(qū)域內的細胞分裂[27]。綜上,NAC轉錄因子參與調控植物生長發(fā)育,響應生物和非生物脅迫。

NAC轉錄因子ANAC046是擬南芥葉片中葉綠素降解和衰老的正調控因子,并且擬南芥AtNAC036基因主要在葉片中表達[28]。Kato等[29]研究表明,NAC036轉基因植株葉片小、葉柄和葉莖均比野生型短,并且細胞形狀大小也比野生型小。這些差異使植物遭遇高溫脅迫時不利于蒸騰散熱,不利于吸水降溫,表明擬南芥AtNAC036基因與其耐熱性呈負相關。本研究中,不結球白菜BcNAC036基因與擬南芥高度同源,推測其耐熱性與擬南芥NAC036相似,即不結球白菜BcNAC036基因與耐熱性呈負相關。

本研究結果顯示,BcNAC036基因在熱敏感品種‘矮腳黃’中表達量明顯高于耐高溫品種‘蘇州青’,并且高溫處理后2個品種基因表達量均急劇下降,且擬南芥轉基因幼苗死亡率顯著高于野生型,表明該基因與不結球白菜耐熱性呈負相關。同時,本研究對不結球白菜文庫進行篩選,篩選出了與BcNAC036互作的蛋白BcMYB30。Liao等[30]的研究表明,擬南芥MYB30基因負調控高溫和氧化脅迫。不結球白菜BcMYB30與擬南芥高度同源,是否是BcNAC036基因激活了BcMYB30基因的大量表達,從而導致BcNAC036基因與不結球白菜耐熱性呈負相關,亦或是存在其他未知與BcNAC036互作的基因共同參與調控不結球白菜的耐高溫路徑,還有待進一步研究。