李群超，沙玉霞，周浩泉

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院兒科，合肥230001)

膿毒癥是由感染引起的一種全身炎癥反應(yīng)綜合征，多繼發(fā)于嚴(yán)重的燒傷、創(chuàng)傷、慢性疾病、危重病繼發(fā)院內(nèi)感染等，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為膿毒性休克，甚至多器官功能衰竭[1]。一項(xiàng)針對(duì)全國44所醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房的橫斷面調(diào)查報(bào)告顯示，重癥監(jiān)護(hù)病房中膿毒癥的發(fā)病率為20.6%，90 d病死率為35.5%[2]。一項(xiàng)調(diào)查分析顯示，影響急診醫(yī)師診治膿毒癥的最主要原因是早期識(shí)別能力有限(34.0%)，其次是治療費(fèi)用過高(14.7%)[3]。由此可見，膿毒癥早期診斷與降低治療費(fèi)用對(duì)膿毒癥患者的治療極其重要。研究發(fā)現(xiàn)，胞外體不僅能調(diào)節(jié)膿毒癥患者機(jī)體炎癥免疫反應(yīng)、保護(hù)其器官功能，還可作為膿毒癥診斷和治療的潛在靶點(diǎn)[4]。張國虎等[5]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)來源的胞外體可通過微RNA(microRNA，miRNA/miR)-126抑制大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞中高遷移率族蛋白B1的水平而降低炎癥反應(yīng)并保護(hù)受損的器官功能，從而明顯提高小鼠存活率。與此同時(shí)，胞外體不僅可以參與機(jī)體的免疫應(yīng)答、抗原呈遞，修復(fù)受損組織，還具有毒性較小、免疫反應(yīng)少、循環(huán)中相對(duì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[6]，在膿毒癥的診治中起重要作用，有望為膿毒癥的治療提供新的策略。

1 胞外體

胞外體是一種直徑為40～100 nm的脂質(zhì)雙層盤狀囊泡，作為特異性細(xì)胞外載體，能夠在細(xì)胞間傳遞 miRNA、蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)，發(fā)揮細(xì)胞間通信作用，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞生物學(xué)功能[7]。胞外體來源廣泛，幾乎人體所有類型的細(xì)胞均能夠分泌，如巨噬細(xì)胞、血小板、平滑肌細(xì)胞；血液、唾液、支氣管肺泡灌洗液、尿液等體液中亦可檢出，且易于檢測(cè)[8]。同時(shí)，由于胞外體組織來源不同，不同病理、生理狀態(tài)下會(huì)分泌具有特異性的分子標(biāo)志物，在疾病的早期診斷和治療方面具有巨大的潛能[9-10]，如膿毒癥、心血管疾病、癌癥等疾病的早期診療。此外，胞外體還具有靶向性、特異性、穩(wěn)定性、低毒性和低免疫原性等生物學(xué)特性[11]，且能穿越血腦屏障等主要生理屏障，可作為藥物傳遞載體。

胞外體的產(chǎn)生機(jī)制尚不完全清楚，內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體途徑是其最經(jīng)典途徑：首先細(xì)胞質(zhì)膜向內(nèi)凹陷形成早期胞內(nèi)體，隨后在內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體及多種輔助蛋白的調(diào)控下，細(xì)胞質(zhì)中的信使RNA、miRNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等物質(zhì)包裹形成多泡胞內(nèi)體，最后通過胞吐作用釋放到細(xì)胞外[12-13]。胞外體表面生物膜與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和組成極為相似，具有高度的生物穩(wěn)定性，同時(shí)膜表面也具有許多特征分子，如四跨膜家族蛋白(CD9、CD35、CD63、CD81、CD82)、熱激蛋白(heat shock protein,HSP)家族(如HSP70、HSPA5、HSP90)、抑癌基因101等[14]。可根據(jù)胞外體大小、形態(tài)、濃度、蛋白質(zhì)組成等特性，采用超速離心法、聚合沉淀法、蛋白質(zhì)印跡法、流式細(xì)胞儀等方法對(duì)其進(jìn)行分離提純及鑒定[15-16]。

2 胞外體參與膿毒癥的炎癥調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)

從初始感染到進(jìn)展為膿毒癥是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，早期研究認(rèn)為過度炎癥反應(yīng)引發(fā)持續(xù)放大的全身炎癥反應(yīng)綜合征是導(dǎo)致膿毒癥病死的主要原因。但研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中會(huì)出現(xiàn)成熟粒細(xì)胞減少以及成熟比例下降、淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞減少等現(xiàn)象[17]，提示其固有免疫和特異性免疫均受到抑制，表明膿毒癥是炎癥反應(yīng)與免疫抑制共同作用的結(jié)果[18]。因此，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并合理調(diào)控炎癥與免疫反應(yīng)，對(duì)膿毒癥的預(yù)防與治療均有重要意義。

2.1膿毒癥的炎癥調(diào)控 膿毒癥機(jī)體炎癥反應(yīng)失控是機(jī)體代償與失代償?shù)膭?dòng)態(tài)過程，并且是非線性演變的過程，可進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體穩(wěn)態(tài)失調(diào)。胞外體可以介導(dǎo)細(xì)胞間通信，在膿毒癥炎癥反應(yīng)和免疫監(jiān)測(cè)等方面起重要作用。Reithmair等[19]通過高通量測(cè)序技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)膿毒癥患者miRNA譜進(jìn)行表征分析，發(fā)現(xiàn)健康志愿者與膿毒癥患者胞外體miR-21-5p、miR-193a-5p、miR-199b-5p等表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且miR-199b-5p可作為膿毒癥與膿毒癥休克患者的潛在監(jiān)測(cè)指標(biāo)，對(duì)膿毒癥的診斷和生存預(yù)測(cè)具有重要意義。胞外體炎癥調(diào)控也取決于患者機(jī)體炎癥介質(zhì)水平。當(dāng)機(jī)體炎癥反應(yīng)較強(qiáng)時(shí)，可表現(xiàn)出抑制免疫的特性。在盲腸結(jié)扎和穿刺膿毒癥模型中，脂肪源性MSC來源的胞外體可通過調(diào)節(jié)炎癥氧化信號(hào)軸抑制大鼠全身免疫炎癥反應(yīng)，有效地降低循環(huán)、腦脊液中炎癥介質(zhì)水平，保護(hù)腦組織免受膿毒癥損傷[20]。同時(shí)，也有研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)MSC來源的胞外體miR-27b過表達(dá)可以抑制組蛋白去甲基化酶含Jumonji結(jié)構(gòu)域蛋白3和核因子κB在基因啟動(dòng)子區(qū)的募集來減少腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-6等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，并增加抗炎因子IL-10的表達(dá)，提高膿毒癥小鼠的存活率[21]。

2.2膿毒癥的免疫調(diào)節(jié) 巨噬細(xì)胞是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成，對(duì)膿毒癥患者的免疫監(jiān)測(cè)與免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要，其中M1型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而M2型巨噬細(xì)胞可調(diào)節(jié)免疫抑制修復(fù)。Juan等[22]發(fā)現(xiàn)在膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)中M2型巨噬細(xì)胞來源的胞外體miR-93-5過表達(dá)，可降低IL-1β、IL-18和細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮保護(hù)腎組織的作用；而M1型巨噬細(xì)胞則相反。在膿毒癥初始階段，巨噬細(xì)胞表型以M1型為主，隨著疾病的進(jìn)展，巨噬細(xì)胞表型逐漸向M2型轉(zhuǎn)化[22]，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫抑制。但由于膿毒癥幸存者存在長期顯著的免疫抑制，巨噬細(xì)胞功能嚴(yán)重受損，導(dǎo)致機(jī)體自身調(diào)節(jié)效果較差。Zhao等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注小鼠模型中，MSC衍生的胞外體miR-182可通過抑制Toll樣受體4/核因子κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M2型極化，減輕炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，改善小鼠心肌缺血再灌注損傷，而敲除miR-182則對(duì)小鼠心臟保護(hù)作用欠佳。Song等[24]使用IL-1β處理人臍帶來源的MSC胞外體介導(dǎo)miR-146a轉(zhuǎn)移至巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，可有效改善膿毒癥小鼠的癥狀。以上研究提示胞外體可以通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，減輕膿毒癥患者炎癥反應(yīng)，以保護(hù)受損的組織和器官，改善預(yù)后。這為提高膿毒癥患者自身免疫力提供了新的方向，為膿毒癥治療應(yīng)用提供了新的依據(jù)。

獲得性免疫系統(tǒng)對(duì)膿毒癥的發(fā)生發(fā)展也起著關(guān)鍵作用。在膿毒癥早期大量炎癥介質(zhì)釋放，機(jī)體炎癥過度反應(yīng)，甚至引發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血；而后期淋巴細(xì)胞大量凋亡、耗竭，又使機(jī)體進(jìn)入免疫抑制狀態(tài)，膿毒癥患者脾臟中的記憶性T細(xì)胞CD4+和CD8+數(shù)量顯著減少[25-26]。Gao等[27]發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠中富含細(xì)胞因子/趨化因子的胞外體通過誘導(dǎo)Th1/Th2細(xì)胞的分化，可增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的增殖與遷移，抑制炎癥反應(yīng)，延長盲腸結(jié)扎和穿刺小鼠的生存時(shí)間。

綜上，胞外體可通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)比例、巨噬細(xì)胞極化、淋巴細(xì)胞增殖分化，參與機(jī)體的炎癥調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)。此外，胞外體還具有穩(wěn)定、安全、易保存、可人為調(diào)節(jié)其內(nèi)容物等優(yōu)點(diǎn)，在調(diào)節(jié)膿毒癥患者的炎癥與免疫失衡方面具有巨大的潛力，可用于改善患者的免疫功能。

3 胞外體對(duì)膿毒癥器官功能的保護(hù)作用

膿毒癥發(fā)生發(fā)展，最終至多器官功能衰竭是一個(gè)連續(xù)的過程，是炎癥介質(zhì)大量釋放、凝血系統(tǒng)激活和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷相互作用的結(jié)果。因此，準(zhǔn)確評(píng)估感染嚴(yán)重程度、及時(shí)發(fā)現(xiàn)并控制炎癥風(fēng)暴、進(jìn)行呼吸循環(huán)支持、盡早修復(fù)受損組織器官是有效避免多器官功能障礙綜合征等嚴(yán)重并發(fā)癥產(chǎn)生的核心。胞外體在受損的組織可發(fā)揮多種生物學(xué)功能，參與靶細(xì)胞調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管與組織修復(fù)，可以有效減輕器官功能損害。

3.1肺 膿毒癥患者通常會(huì)出現(xiàn)急性肺損傷(acutelunginjury,ALI)或急性呼吸窘迫綜合征等肺部并發(fā)癥，表現(xiàn)為肺泡巨噬細(xì)胞激活、細(xì)胞因子過量釋放、炎癥細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致肺內(nèi)炎癥反應(yīng)失控。肺泡上皮細(xì)胞作為膿毒癥患者肺泡防御的第一道防線，在肺損傷過程中不僅最先被破壞，還是肺部疾病進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)因子。研究發(fā)現(xiàn)，肺泡上皮來源的胞外體可促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞活化，加重膿毒癥患者肺損傷[28]。

提高緊密連接蛋白穩(wěn)定性與減輕局部炎癥介質(zhì)釋放可保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞，從而達(dá)到減輕肺功能損傷、改善預(yù)后的目的。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell,EPC)可通過清除細(xì)菌、減少炎癥反應(yīng)、減輕血管滲漏等方式降低膿毒癥引起的肺損傷，是一種有前景的治療策略[29]。但EPC不易大量獲得且具有潛在風(fēng)險(xiǎn)，難以直接應(yīng)用于臨床。Tang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)小鼠ALI模型中miR-126-5p可以增加緊密連接蛋白的表達(dá)，降低小鼠肺損傷嚴(yán)重程度。Wu等[31]研究發(fā)現(xiàn)，EPC分泌的胞外體miR-126可促進(jìn)肺內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，改善ALI。也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-126-3p和miR-126-5p在EPC胞外體中大量表達(dá)并分別抑制了脂多糖誘導(dǎo)的高遷移率族蛋白B1和血管細(xì)胞黏附分子-1的水平，降低了小鼠炎癥反應(yīng)[32]；而EPC胞外體中缺失miR-126則不能改善膿毒癥患者的生存率。以上研究表明，EPC來源的胞外體具有保護(hù)膿毒癥患者器官功能的作用，提示miR-126可能是一種減輕肺損傷的潛在機(jī)制。因此，誘導(dǎo)EPC來源的胞外體并傳遞miR-126可以減輕肺組織炎癥反應(yīng)，預(yù)防微血管功能障礙，可能為膿毒癥患者的治療開辟新途徑。但仍需要進(jìn)一步研究EPC來源的胞外體作用機(jī)制，以使其真正成為ALI/急性呼吸窘迫綜合征臨床治療的新策略。

3.2心臟 心臟功能受損是膿毒癥患者不良預(yù)后的重要原因，主要表現(xiàn)為心肌功能障礙、收縮力下降、心肌順應(yīng)性損傷[33]。Xu等[34]將脂多糖誘導(dǎo)MSC衍生的胞外體作用于小鼠心肌梗死模型，發(fā)現(xiàn)其可通過抑制核因子κB信號(hào)通路并部分激活蛋白激酶B(proteinkinase,PKB/Akt)1/Akt2信號(hào)通路減輕心肌梗死后的炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡。心肌缺血再灌注小鼠模型中MSC衍生的胞外體miR-182通過抑制Toll樣受體4/核因子κB信號(hào)通路并調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M2型極化，減小梗死面積[23]，提示胞外體miR-182在MSC的膿毒癥心臟保護(hù)中起著重要作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注大鼠模型中MSC來源胞外體可減輕心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)和心肌細(xì)胞損傷[35]。以上研究提示，MSC來源的胞外體在心肌修復(fù)中有重要作用，為減輕膿毒癥的心功能損傷提供了新思路。

胞外體是一種很有前景的藥物遞送載體，但單核吞噬系統(tǒng)對(duì)胞外體的快速攝取，會(huì)使其積累于肝臟和脾臟，限制其在心臟等靶器官的分布。預(yù)先阻斷胞外體的攝取，然后傳遞治療性胞外體，可以有效地改善治療藥物在目標(biāo)靶器官的分布，是一種很有前途的基因治療方法。在阿奇霉素誘導(dǎo)的心臟毒性模型，Wan等[36]預(yù)先注射胞外體阻斷劑阻斷單核吞噬系統(tǒng)對(duì)胞外體的攝取，顯著提高了胞外體的治療效果。然而，有些胞外體可通過增加氧化酶活性，損傷線粒結(jié)構(gòu)與功能，引發(fā)心臟能量代謝障礙，參與心肌功能的損傷。鞘磷脂酶抑制劑GW4869是胞外體產(chǎn)生和釋放的抑制劑，Essandoh等[37]研究發(fā)現(xiàn)，GW4869治療可顯著抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞的胞外體和炎癥介質(zhì)(腫瘤壞死因子-α、IL-1β、IL-6)的釋放，從而改善心臟功能。因此，進(jìn)一步研究不同來源的胞外體對(duì)心臟的作用機(jī)制，闡明其對(duì)膿毒癥患者心臟功能的影響，將會(huì)極大改善膿毒癥患者的預(yù)后，提高其生命質(zhì)量。

3.3腎臟 AKI主要是由膿毒癥及膿毒性休克所致，是膿毒癥的一種潛在且致命的并發(fā)癥。AKI的發(fā)病率、病死率均較高，且缺乏有效的治療方法。因此，及時(shí)發(fā)現(xiàn)AKI并給予安全有效的支持治療對(duì)改善膿毒癥患者腎損傷預(yù)后尤為必要。

MSC(如骨髓、臍帶和脂肪來源的MSC)在治療AKI中顯示了良好的療效，其分泌的胞外體也受到高度重視。Pan等[38]發(fā)現(xiàn)胞外體通過上調(diào)miR-21并將其整合到腎小管上皮細(xì)胞中，然后靶向下游的程序性細(xì)胞死亡因子4/核因子κB和人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因/Akt通路，可發(fā)揮抗炎和抗凋亡作用，減少膿毒癥小鼠炎癥介質(zhì)的系統(tǒng)性積累，使其免于多器官功能障礙。Fu等[39]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在盲腸結(jié)扎和穿刺膿毒癥模型中miR-21可通過人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因/磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt信號(hào)通路降低炎癥介質(zhì)水平，減少腎細(xì)胞凋亡，減輕膿毒癥小鼠的腎損傷。臍帶MSC胞外體通過上調(diào)miR-146b水平抑制核因子κB活性，也可顯著降低血肌酐和尿素氮水平，提高盲腸結(jié)扎和穿刺小鼠的存活率[40]；骨髓MSC胞外體可向腎組織傳遞miR-199a-3p，保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞免受損傷[41]；脂肪源性MSC胞外體可減輕AKI模型腎臟炎癥和微循環(huán)紊亂狀態(tài)[42]。由此可見，MSC來源的胞外體通過作用于受損的腎臟組織，參與靶細(xì)胞調(diào)控，減輕腎功能損害，為膿毒癥腎損傷的治療提供了新思路。

4 小 結(jié)

胞外體因獨(dú)特的生物學(xué)特性及治療潛力而備受關(guān)注，許多研究探索了胞外體與膿毒癥之間的聯(lián)系。胞外體在膿毒癥的炎癥調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)和器官功能保護(hù)方面起積極的作用。胞外體參與調(diào)控膿毒癥發(fā)生發(fā)展的各個(gè)病理生理過程，發(fā)揮調(diào)節(jié)功能的同時(shí)也可能具有兩面性，如不同來源的胞外體可能產(chǎn)生相反的作用；同時(shí)同種來源的胞外體多靶點(diǎn)調(diào)控膿毒癥的過程中也可能會(huì)產(chǎn)生負(fù)面作用。此外，由于胞外體膜的穩(wěn)定性，能保護(hù)其內(nèi)物質(zhì)不被分解，可以作為藥物載體進(jìn)行靶向治療，但分離純化工藝復(fù)雜，載藥量低，無法規(guī)模量產(chǎn)?？傊?，胞外體在膿毒癥早期預(yù)防、治療與監(jiān)測(cè)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。