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        黃精凍干片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及其提取物薯蕷皂苷元抗腫瘤活性研究

        2022-08-10 08:08:08徐雨生高明菊趙寧東黃再?gòu)?qiáng)田迎秋胡展育余正勇
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年13期

        徐雨生,高明菊,趙寧東,黃再?gòu)?qiáng),田迎秋,胡展育,余正勇

        (1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128;2.湖南雜交水稻研究中心雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410125;3.文山學(xué)院三七醫(yī)藥學(xué)院,云南 文山 663000)

        黃精(Polygonatum sibiricumDelar. ex Redoute)為百合科黃精屬多年生的草本植物,其根莖是藥用成分最多的部位,主要分布在中國(guó)南部熱帶以外的地方[1]。黃精的藥用歷史已有2 000 多年,是目前中國(guó)常用的中藥材之一。研究表明,黃精中含有很多對(duì)人體有利的成分,如薯蕷皂苷元、黃精多糖、強(qiáng)心苷、生物堿、氨基酸等[2,3],薯蕷皂苷元有抗炎和抗病毒的藥理作用,黃精多糖有降血脂和血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥理作用,還有抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[4-6]。

        目前黃精的開(kāi)發(fā)利用現(xiàn)狀存在諸多問(wèn)題[7]:野生資源枯竭并且質(zhì)量不穩(wěn)定;人工栽培歷史悠久但技術(shù)落后;對(duì)黃精的采收和加工等缺少科學(xué)依據(jù)?;瘜W(xué)成分研究進(jìn)展較明顯,但是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確;藥品與保健品開(kāi)發(fā)較少;行業(yè)規(guī)模與藥材價(jià)格走勢(shì)不明朗等問(wèn)題[8]。薯蕷皂苷元和黃精多糖可能是黃精的質(zhì)量標(biāo)志性成分[9],但這些成分的有效性還需要進(jìn)一步探究。

        中國(guó)歷代中醫(yī)藥典籍都有關(guān)于黃精及其炮制方法的記載,隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展,許多優(yōu)良的炮制加工方法相繼產(chǎn)生,如壓力蒸氣消毒干燥法、微波干燥法、綜合評(píng)分干燥法等[10,11]。不同區(qū)域的黃精炮制加工各有其特點(diǎn),在繼承黃精傳統(tǒng)加工工藝的同時(shí),更需要不斷創(chuàng)新和研究,為推行黃精飲片“安全、穩(wěn)定、有效、可控”的質(zhì)量生產(chǎn)管理規(guī)范化奠定基礎(chǔ)。隨著世界經(jīng)濟(jì)水平及人們生活水平的提高,消費(fèi)者對(duì)冷凍干燥物資的需求量增大。近年來(lái),電子計(jì)算機(jī)和傳感測(cè)量技術(shù)使冷凍干燥技術(shù)的發(fā)展進(jìn)入新時(shí)期,冷凍干燥中藥飲片具有明顯的市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)[12]。

        目前,建立中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法主要有兩種:采用分析儀器建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),能夠相對(duì)較少地受個(gè)人主觀因素的干擾;傳統(tǒng)的人工經(jīng)驗(yàn)判別法的優(yōu)點(diǎn)是能夠比較全面地反映與藥物療效相關(guān)中藥材的質(zhì)量,缺點(diǎn)是易受個(gè)人主觀因素的干擾。中國(guó)雖然已經(jīng)在中藥質(zhì)量控制和中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面取得較大的進(jìn)步,定量控制藥材的水平也在不斷提高[13],但是總體水平還相對(duì)較低,與現(xiàn)代化還存在較大距離,需要進(jìn)一步深入探究。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        所有樣品均為黃精凍干片的粉末,分別來(lái)自云南省文山壯族苗族自治州文山市(簡(jiǎn)稱(chēng)云南文山)、云南省麗江市(簡(jiǎn)稱(chēng)云南麗江)、安徽省六安市(簡(jiǎn)稱(chēng)安徽六安)、廣西省百色市(簡(jiǎn)稱(chēng)廣西百色);氫氧化鈉、丙三醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司);碘(成都市科隆化學(xué)品有限公司);碘化鉀(上海市四赫維化工有限公司);酚酞(上海市四赫維化工有限公司);無(wú)水葡萄糖(北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司);蒽酮(上海申博化工有限公司);濃硫酸(上海展云化工有限公司);3,5 二硝基水楊酸(成都市科隆化學(xué)品有限公司);甲醇、乙腈(均為色譜純,天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

        1.2 性狀鑒別

        本試驗(yàn)參照《中華人民共和國(guó)藥典》(2020 年版)(下文簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》),根據(jù)3 批樣品的形態(tài)、色澤、氣、味、質(zhì)地考察。

        1.3 薄層色譜鑒別

        稱(chēng)取黃精凍干片粉末1.0 g,放入錐形瓶?jī)?nèi),加入20 mL 70%的甲醇溶液,再加熱回流1 h,將處理好的樣品抽濾,濾液需蒸干;待完全蒸干后再用去離子水10 mL 沖洗剩余的殘?jiān)箽堅(jiān)耆芙?,在錐形瓶?jī)?nèi)加入20 mL 正丁醇溶液,振蕩3 min,重復(fù)提取1 次,合并正丁醇液,蒸干后剩余的殘?jiān)屑尤? mL 的甲醇溶液,使其溶解,待測(cè)。另外取凍干后的黃精對(duì)照藥材1.0 g,同法制成對(duì)照品溶液。再用薄層色譜法進(jìn)行試驗(yàn),取供試品液和對(duì)照品液各10 μL,將其分別點(diǎn)在同一硅膠G 薄層板上,以石油醚(60~90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(5.0∶2.0∶0.1)作為展開(kāi)劑,放入展開(kāi)缸中展開(kāi),取出后晾干,用5%香草醛硫酸溶液噴在薄層板上,把薄層板放在烘箱中,溫度調(diào)到105 ℃,待薄層板有清晰的斑點(diǎn)顯示后,對(duì)其進(jìn)行視檢即可。

        1.4 顯微鑒別法

        通過(guò)顯微鏡(尼康E400 型)對(duì)樣品進(jìn)行照片采集。

        1.5 水分檢測(cè)

        將樣品盤(pán)放入水分測(cè)定儀內(nèi),置零,在樣品盤(pán)中放入凍干后的黃精粉末5 g,記錄數(shù)據(jù)。計(jì)算出供試品的含水量(%)。

        1.6 總灰分測(cè)定

        按照《中國(guó)藥典》中有關(guān)總灰分的測(cè)定方法,取粉碎至細(xì)的黃精凍干片粉末2.0 g,放在灼燒到恒定重量的坩堝內(nèi),稱(chēng)量其重(要求準(zhǔn)確至0.01 g),慢慢熾灼,隨時(shí)觀察。灼燒至完全炭化后,慢慢升高溫度到600 ℃左右,使灼燒后的黃精凍干粉末完全灰化到恒定的重量。最后根據(jù)殘?jiān)亓?,?jì)算出供試品內(nèi)總灰分的含量。

        1.7 醇溶性浸出物測(cè)定

        按照《中國(guó)藥典》(通則2201 熱浸法)浸出物測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。稱(chēng)取黃精凍干片粉末2 g,置250 mL的錐形瓶中,加50%乙醇50 mL,密塞,稱(chēng)重后靜置1 h,連接回流冷凝管微沸1 h,放冷取下錐形管,稱(chēng)重后密塞,50%乙醇補(bǔ)足減重,搖勻,過(guò)濾,量取濾液25 mL 置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,105 ℃下干燥3 h 后,干燥器中冷卻30 min,精密稱(chēng)重后計(jì)算即可。

        1.8 總多糖含量的測(cè)定

        1.8.1 對(duì)照品溶液的制備 105 ℃下干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品33 mg,置100 mL 容量瓶中,加水溶解并定容至刻度線,搖勻,即得。

        1.8.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配制的溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL)至10 mL 具塞刻度試管,加去離子水至2.0 mL,搖勻,加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度線并混勻,冰水浴至冷,取出即可。按照紫外-可見(jiàn)分光光度法(通則0401),計(jì)算繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.8.3 供試品溶液的制備 稱(chēng)取4 個(gè)不同產(chǎn)地黃精凍干片粉末0.25 g,至圓底燒瓶中(60 ℃干燥至恒重),加80%乙醇150 mL 后加熱回流1 h(水浴),趁熱過(guò)濾,殘?jiān)?0%熱乙醇洗滌3 次(每次10 mL),合并濾液,放冷后轉(zhuǎn)移至250 mL,加水至刻度線搖勻。精確量取上述混合溶液1 mL,置10 mL 具塞干燥試管,加去離子水至2.0 mL 后,再加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度線并混勻(以去離子水代替供試品為空白),于582 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,計(jì)算黃精凍干片的總多糖。

        1.9 薯蕷皂苷元含量的測(cè)定

        1.9.1 波長(zhǎng)的選擇 色譜柱:Hypersil ODSC-18 色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-超純水(75∶25,V/V)進(jìn)行梯度洗脫,柱溫為30 ℃,流速為1 mL/min,進(jìn)樣量為10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)是190~440 nm;檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇:將各對(duì)照品溶液進(jìn)行高效液相掃描,測(cè)出對(duì)照品溶液的最大吸收值。

        1.9.2 對(duì)照品溶液制備 稱(chēng)取薯蕷皂苷元(批號(hào)為JS90124)1.08 mg,用50%乙醇溶液溶解、超聲處理至溶解,然后定容到2 mL,作為對(duì)照品,最后用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾后備用,待HPLC 測(cè)定。

        1.9.3 供試品溶液制備 稱(chēng)取云南文山黃精凍干粉末1.000 g 于150 mL 具塞錐形瓶中,加50%乙醇溶液50 mL,密封,50 Hz 超聲儀中超聲處理30 min 后取出,放冷,用50%乙醇補(bǔ)足失重,振搖后過(guò)濾,濾液保留,通過(guò)0.45 μm 微孔濾膜即得供試品溶液。

        1.9.4 樣品含量測(cè)定 稱(chēng)取4 個(gè)不同產(chǎn)地的凍干黃精飲片粉末2 g,按照“1.9.3”的制備方法進(jìn)行制備,依據(jù)上文所述的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算薯蕷皂苷元的含量。

        1.10 薯蕷皂苷元對(duì)3 種癌細(xì)胞的影響

        以阿霉素為對(duì)照品,采用噻唑藍(lán)(MTT)法考察了黃精薯蕷皂苷元對(duì)A431(人表皮癌細(xì)胞)、H1975(人肺腺癌細(xì)胞)和Ramos(人B 淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞)的抗腫瘤活性。3 種細(xì)胞培養(yǎng)成熟后用酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度,選擇570 nm 波長(zhǎng),以RPMI-1640 培養(yǎng)液做空白對(duì)照,測(cè)各孔的吸光度。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組吸光度-試驗(yàn)組吸光度)/對(duì)照組吸光度×100%。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 性狀鑒別

        由于4 個(gè)樣品中有2 個(gè)樣品來(lái)自同一省份,故選擇3 個(gè)來(lái)自不同省份的樣品。黃精凍干片性狀鑒別結(jié)果(圖1)顯示,本品的性狀為淡黃色至黃色的中空泡沫狀薄片,切片后切面為角質(zhì)樣,有很多淡黃色的筋脈小點(diǎn);氣微,味苦但是略回甜,嚼之具有黏性;質(zhì)脆,易折斷。

        圖1 3 批樣品的切片

        2.2 薄層色譜鑒別

        薄層色譜鑒別結(jié)果(圖2)顯示,在與黃精對(duì)照藥材色譜圖相對(duì)應(yīng)的位置上,4 個(gè)產(chǎn)地的黃精凍干片均能顯示出相同顏色的斑點(diǎn),重現(xiàn)性良好。

        圖2 黃精凍干片薄層色譜圖

        2.3 顯微鑒別

        本品粉末為淡黃色至黃色。顯微鑒別結(jié)果(圖3)顯示,表皮細(xì)胞的外壁較厚,薄壁組織散有大量的黏液細(xì)胞,內(nèi)含的草酸鈣針晶束散在,針晶長(zhǎng)18~88 μm。有很多的維管束散列,大多數(shù)為周木型。

        圖3 黃精凍干粉末

        2.4 含水量的測(cè)定

        測(cè)定了4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精凍干片含水量(表1),其含水量均值為2.8%~4.7%,均沒(méi)有超過(guò)5.0%。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,可將本品含水量限度定為不得超過(guò)5.0%納入標(biāo)準(zhǔn)。

        表1 不同產(chǎn)地黃精凍干片含水量 (單位:%)

        2.5 總灰分含量的測(cè)定

        根據(jù)測(cè)定所得殘?jiān)亓浚?jì)算出本試驗(yàn)中4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精凍干片的總灰分。結(jié)果(表2)顯示,4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精凍干片總灰分范圍為1.9%~3.4%(均沒(méi)有超過(guò)4.0%)。根據(jù)測(cè)定結(jié)果,可將本品總灰分限度不得超過(guò)4.0%納入標(biāo)準(zhǔn)。

        表2 不同產(chǎn)地黃精凍干片總灰分含量 (單位:%)

        2.6 醇溶性浸出物的測(cè)定

        根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)計(jì)算乙醇浸出物含量,結(jié)果(表3)顯示,4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精凍干片的醇溶性浸出物在72.19%~78.99%(均未低于70.0%)。根據(jù)測(cè)定結(jié)果,可將乙醇浸出物限度定為不低于70.0%納入標(biāo)準(zhǔn)。

        表3 不同產(chǎn)地黃精凍干片乙醇浸出物含量(單位:%)

        2.7 總多糖含量的測(cè)定

        2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 結(jié)果(圖4)顯示,線性方程為y=5.732 3x-0.033 3,r=0.998,結(jié)果表明無(wú)水葡萄糖在0.033~0.198 mg 范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。

        圖4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.7.2 樣品含量的測(cè)定 測(cè)定了4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精凍干片中總糖的含量,結(jié)果(表4)顯示,其總糖都不低于7.0%。根據(jù)測(cè)定結(jié)果,可將本品總糖的限度定為不得少于7.0%納入標(biāo)準(zhǔn)。

        表4 不同產(chǎn)地的黃精凍干片總多糖含量(單位:%)

        2.8 薯蕷皂苷元含量的測(cè)定

        2.8.1 波長(zhǎng)的選擇 在最大吸收波長(zhǎng)440 nm 處響應(yīng)值較強(qiáng),因此選擇測(cè)定波長(zhǎng)為440 nm。

        2.8.2 黃精薯蕷皂苷元對(duì)照品HPLC 色譜圖 用HPLC 檢測(cè)已制備好的對(duì)照品溶液,得到含有明顯薯蕷皂苷元主峰的色譜圖(圖5),圖5 中的峰1 為薯蕷皂苷元色譜。

        圖5 黃精薯蕷皂苷元對(duì)照品HPLC 色譜圖

        2.8.3 黃精薯蕷皂苷元供試品HPLC 色譜圖 用HPLC 檢測(cè)已制備供試品溶液,得到含有多條明顯鋒的高效液相色譜圖(圖6),其中含有對(duì)應(yīng)對(duì)照品溶液的明顯薯蕷皂苷元峰,峰1 為薯蕷皂苷元。

        圖6 黃精薯蕷皂苷元供試品HPLC 色譜圖

        2.8.4 樣品含量測(cè)定 測(cè)定了4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精凍干片中薯蕷皂苷元的含量,結(jié)果(表5、表6)顯示,r=0.999 2,線性范圍為1.08~10.80 mg/mL,4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精經(jīng)該法凍干后薯蕷皂苷元都不低于0.18%。根據(jù)測(cè)定結(jié)果,可將本品薯蕷皂苷元的限度定為不得少于0.18%納入標(biāo)準(zhǔn)。

        表5 不同產(chǎn)地黃精薯蕷皂苷元方程及其范圍

        表6 不同產(chǎn)地黃精的薯蕷皂苷元含量

        2.9 黃精提取物薯蕷皂苷元對(duì)3 種癌細(xì)胞的影響

        試驗(yàn)結(jié)果(表7)顯示,薯蕷皂苷元對(duì)A431(人表皮癌細(xì)胞)細(xì)胞抑制活性與阿霉素相當(dāng),即抗A431腫瘤活性較佳,但是對(duì)H1975(人肺腺癌細(xì)胞)、Ra?mos(人B 淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞)均無(wú)抗腫瘤活性,為后期開(kāi)發(fā)純天然抗人表皮癌細(xì)胞新藥提供一定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

        表7 薯蕷皂苷元的抗腫瘤活性(單位:L/(mol·cm))

        3 討論

        本試驗(yàn)結(jié)果中4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精凍干片各種化學(xué)成分?jǐn)?shù)值均在《中國(guó)藥典》規(guī)定范圍內(nèi),說(shuō)明此項(xiàng)研究可為后續(xù)研究?jī)龈牲S精的藥理活性、臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)等提供理論依據(jù),同時(shí)也可為后續(xù)普通炮制黃精提供借鑒。

        試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地黃精凍干片的水分、總灰分、醇溶性浸出物、總糖、薯蕷皂苷元含量存在一定差異,但測(cè)定結(jié)果在《中國(guó)藥典》規(guī)定范圍內(nèi)。4 個(gè)產(chǎn)地的凍干黃精的含水量平均值為3.80%,總灰分平均值為2.70%,醇溶性浸出物平均值為75.78%,總糖平均值為8.95%,薯蕷皂苷元含量不低于0.18%。與《中國(guó)藥典》要求相比,水分測(cè)定值雖然偏低,但在要求范圍內(nèi),說(shuō)明凍干后的黃精有一般凍干產(chǎn)品延長(zhǎng)保存時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。前期較少文獻(xiàn)報(bào)道黃精凍干飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案,因此,在撰寫(xiě)黃精凍干片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案中,建議黃精凍干片含水量不超過(guò)5.0%,總灰分不超過(guò)4.0%,醇溶性浸出物含量不少于70.0%,總糖不少于7.0%,薯蕷皂苷元含量不低于0.18%。黃精凍干飲片中薯蕷皂苷元含量差異不大,但是相較其他炮制方法,凍干黃精飲片粉末的薯蕷皂苷元含量較高,且薯蕷皂苷元抗A431 腫瘤活性較佳,為后期凍干黃精質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究及補(bǔ)充提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。

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