徐雨生，高明菊，趙寧東，黃再?gòu)?qiáng)，田迎秋，胡展育，余正勇

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.湖南雜交水稻研究中心雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410125；3.文山學(xué)院三七醫(yī)藥學(xué)院，云南 文山 663000）

黃精（Polygonatum sibiricumDelar. ex Redoute）為百合科黃精屬多年生的草本植物，其根莖是藥用成分最多的部位，主要分布在中國(guó)南部熱帶以外的地方［1］。黃精的藥用歷史已有2 000 多年，是目前中國(guó)常用的中藥材之一。研究表明，黃精中含有很多對(duì)人體有利的成分，如薯蕷皂苷元、黃精多糖、強(qiáng)心苷、生物堿、氨基酸等［2，3］，薯蕷皂苷元有抗炎和抗病毒的藥理作用，黃精多糖有降血脂和血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥理作用，還有抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用［4-6］。

目前黃精的開(kāi)發(fā)利用現(xiàn)狀存在諸多問(wèn)題［7］：野生資源枯竭并且質(zhì)量不穩(wěn)定；人工栽培歷史悠久但技術(shù)落后；對(duì)黃精的采收和加工等缺少科學(xué)依據(jù)?；瘜W(xué)成分研究進(jìn)展較明顯，但是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確；藥品與保健品開(kāi)發(fā)較少；行業(yè)規(guī)模與藥材價(jià)格走勢(shì)不明朗等問(wèn)題［8］。薯蕷皂苷元和黃精多糖可能是黃精的質(zhì)量標(biāo)志性成分［9］，但這些成分的有效性還需要進(jìn)一步探究。

中國(guó)歷代中醫(yī)藥典籍都有關(guān)于黃精及其炮制方法的記載，隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，許多優(yōu)良的炮制加工方法相繼產(chǎn)生，如壓力蒸氣消毒干燥法、微波干燥法、綜合評(píng)分干燥法等［10，11］。不同區(qū)域的黃精炮制加工各有其特點(diǎn)，在繼承黃精傳統(tǒng)加工工藝的同時(shí)，更需要不斷創(chuàng)新和研究，為推行黃精飲片“安全、穩(wěn)定、有效、可控”的質(zhì)量生產(chǎn)管理規(guī)范化奠定基礎(chǔ)。隨著世界經(jīng)濟(jì)水平及人們生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)冷凍干燥物資的需求量增大。近年來(lái)，電子計(jì)算機(jī)和傳感測(cè)量技術(shù)使冷凍干燥技術(shù)的發(fā)展進(jìn)入新時(shí)期，冷凍干燥中藥飲片具有明顯的市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)［12］。

目前，建立中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法主要有兩種：采用分析儀器建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，能夠相對(duì)較少地受個(gè)人主觀因素的干擾；傳統(tǒng)的人工經(jīng)驗(yàn)判別法的優(yōu)點(diǎn)是能夠比較全面地反映與藥物療效相關(guān)中藥材的質(zhì)量，缺點(diǎn)是易受個(gè)人主觀因素的干擾。中國(guó)雖然已經(jīng)在中藥質(zhì)量控制和中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面取得較大的進(jìn)步，定量控制藥材的水平也在不斷提高［13］，但是總體水平還相對(duì)較低，與現(xiàn)代化還存在較大距離，需要進(jìn)一步深入探究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所有樣品均為黃精凍干片的粉末，分別來(lái)自云南省文山壯族苗族自治州文山市（簡(jiǎn)稱(chēng)云南文山）、云南省麗江市（簡(jiǎn)稱(chēng)云南麗江）、安徽省六安市（簡(jiǎn)稱(chēng)安徽六安）、廣西省百色市（簡(jiǎn)稱(chēng)廣西百色）；氫氧化鈉、丙三醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；碘（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；碘化鉀（上海市四赫維化工有限公司）；酚酞（上海市四赫維化工有限公司）；無(wú)水葡萄糖（北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司）；蒽酮（上海申博化工有限公司）；濃硫酸（上海展云化工有限公司）；3，5 二硝基水楊酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；甲醇、乙腈（均為色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.2 性狀鑒別

本試驗(yàn)參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2020 年版）（下文簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》），根據(jù)3 批樣品的形態(tài)、色澤、氣、味、質(zhì)地考察。

1.3 薄層色譜鑒別

稱(chēng)取黃精凍干片粉末1.0 g，放入錐形瓶?jī)?nèi)，加入20 mL 70%的甲醇溶液，再加熱回流1 h，將處理好的樣品抽濾，濾液需蒸干；待完全蒸干后再用去離子水10 mL 沖洗剩余的殘?jiān)箽堅(jiān)耆芙?，在錐形瓶?jī)?nèi)加入20 mL 正丁醇溶液，振蕩3 min，重復(fù)提取1 次，合并正丁醇液，蒸干后剩余的殘?jiān)屑尤? mL 的甲醇溶液，使其溶解，待測(cè)。另外取凍干后的黃精對(duì)照藥材1.0 g，同法制成對(duì)照品溶液。再用薄層色譜法進(jìn)行試驗(yàn)，取供試品液和對(duì)照品液各10 μL，將其分別點(diǎn)在同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60~90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（5.0∶2.0∶0.1）作為展開(kāi)劑，放入展開(kāi)缸中展開(kāi)，取出后晾干，用5%香草醛硫酸溶液噴在薄層板上，把薄層板放在烘箱中，溫度調(diào)到105 ℃，待薄層板有清晰的斑點(diǎn)顯示后，對(duì)其進(jìn)行視檢即可。

1.4 顯微鑒別法

通過(guò)顯微鏡（尼康E400 型）對(duì)樣品進(jìn)行照片采集。

1.5 水分檢測(cè)

將樣品盤(pán)放入水分測(cè)定儀內(nèi)，置零，在樣品盤(pán)中放入凍干后的黃精粉末5 g，記錄數(shù)據(jù)。計(jì)算出供試品的含水量（%）。

1.6 總灰分測(cè)定

按照《中國(guó)藥典》中有關(guān)總灰分的測(cè)定方法，取粉碎至細(xì)的黃精凍干片粉末2.0 g，放在灼燒到恒定重量的坩堝內(nèi)，稱(chēng)量其重（要求準(zhǔn)確至0.01 g），慢慢熾灼，隨時(shí)觀察。灼燒至完全炭化后，慢慢升高溫度到600 ℃左右，使灼燒后的黃精凍干粉末完全灰化到恒定的重量。最后根據(jù)殘?jiān)亓?，?jì)算出供試品內(nèi)總灰分的含量。

1.7 醇溶性浸出物測(cè)定

按照《中國(guó)藥典》（通則2201 熱浸法）浸出物測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。稱(chēng)取黃精凍干片粉末2 g，置250 mL的錐形瓶中，加50%乙醇50 mL，密塞，稱(chēng)重后靜置1 h，連接回流冷凝管微沸1 h，放冷取下錐形管，稱(chēng)重后密塞，50%乙醇補(bǔ)足減重，搖勻，過(guò)濾，量取濾液25 mL 置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，105 ℃下干燥3 h 后，干燥器中冷卻30 min，精密稱(chēng)重后計(jì)算即可。

1.8 總多糖含量的測(cè)定

1.8.1 對(duì)照品溶液的制備 105 ℃下干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品33 mg，置100 mL 容量瓶中，加水溶解并定容至刻度線，搖勻，即得。

1.8.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配制的溶液（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL）至10 mL 具塞刻度試管，加去離子水至2.0 mL，搖勻，加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度線并混勻，冰水浴至冷，取出即可。按照紫外-可見(jiàn)分光光度法（通則0401），計(jì)算繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8.3 供試品溶液的制備 稱(chēng)取4 個(gè)不同產(chǎn)地黃精凍干片粉末0.25 g，至圓底燒瓶中（60 ℃干燥至恒重），加80%乙醇150 mL 后加熱回流1 h（水浴），趁熱過(guò)濾，殘?jiān)?0%熱乙醇洗滌3 次（每次10 mL），合并濾液，放冷后轉(zhuǎn)移至250 mL，加水至刻度線搖勻。精確量取上述混合溶液1 mL，置10 mL 具塞干燥試管，加去離子水至2.0 mL 后，再加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度線并混勻（以去離子水代替供試品為空白），于582 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算黃精凍干片的總多糖。

1.9 薯蕷皂苷元含量的測(cè)定

1.9.1 波長(zhǎng)的選擇 色譜柱：Hypersil ODSC-18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-超純水（75∶25，V/V）進(jìn)行梯度洗脫，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)是190~440 nm；檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：將各對(duì)照品溶液進(jìn)行高效液相掃描，測(cè)出對(duì)照品溶液的最大吸收值。

1.9.2 對(duì)照品溶液制備 稱(chēng)取薯蕷皂苷元（批號(hào)為JS90124）1.08 mg，用50%乙醇溶液溶解、超聲處理至溶解，然后定容到2 mL，作為對(duì)照品，最后用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾后備用，待HPLC 測(cè)定。

1.9.3 供試品溶液制備 稱(chēng)取云南文山黃精凍干粉末1.000 g 于150 mL 具塞錐形瓶中，加50%乙醇溶液50 mL，密封，50 Hz 超聲儀中超聲處理30 min 后取出，放冷，用50%乙醇補(bǔ)足失重，振搖后過(guò)濾，濾液保留，通過(guò)0.45 μm 微孔濾膜即得供試品溶液。

1.9.4 樣品含量測(cè)定 稱(chēng)取4 個(gè)不同產(chǎn)地的凍干黃精飲片粉末2 g，按照“1.9.3”的制備方法進(jìn)行制備，依據(jù)上文所述的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算薯蕷皂苷元的含量。

1.10 薯蕷皂苷元對(duì)3 種癌細(xì)胞的影響

以阿霉素為對(duì)照品，采用噻唑藍(lán)（MTT）法考察了黃精薯蕷皂苷元對(duì)A431（人表皮癌細(xì)胞）、H1975（人肺腺癌細(xì)胞）和Ramos（人B 淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞）的抗腫瘤活性。3 種細(xì)胞培養(yǎng)成熟后用酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度，選擇570 nm 波長(zhǎng)，以RPMI-1640 培養(yǎng)液做空白對(duì)照，測(cè)各孔的吸光度。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率＝（對(duì)照組吸光度－試驗(yàn)組吸光度）/對(duì)照組吸光度×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀鑒別

由于4 個(gè)樣品中有2 個(gè)樣品來(lái)自同一省份，故選擇3 個(gè)來(lái)自不同省份的樣品。黃精凍干片性狀鑒別結(jié)果（圖1）顯示，本品的性狀為淡黃色至黃色的中空泡沫狀薄片，切片后切面為角質(zhì)樣，有很多淡黃色的筋脈小點(diǎn)；氣微，味苦但是略回甜，嚼之具有黏性；質(zhì)脆，易折斷。

圖1 3 批樣品的切片

2.2 薄層色譜鑒別

薄層色譜鑒別結(jié)果（圖2）顯示，在與黃精對(duì)照藥材色譜圖相對(duì)應(yīng)的位置上，4 個(gè)產(chǎn)地的黃精凍干片均能顯示出相同顏色的斑點(diǎn)，重現(xiàn)性良好。

圖2 黃精凍干片薄層色譜圖

2.3 顯微鑒別

本品粉末為淡黃色至黃色。顯微鑒別結(jié)果（圖3）顯示，表皮細(xì)胞的外壁較厚，薄壁組織散有大量的黏液細(xì)胞，內(nèi)含的草酸鈣針晶束散在，針晶長(zhǎng)18~88 μm。有很多的維管束散列，大多數(shù)為周木型。

圖3 黃精凍干粉末

2.4 含水量的測(cè)定

測(cè)定了4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精凍干片含水量（表1），其含水量均值為2.8%~4.7%，均沒(méi)有超過(guò)5.0%。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，可將本品含水量限度定為不得超過(guò)5.0%納入標(biāo)準(zhǔn)。

表1 不同產(chǎn)地黃精凍干片含水量 （單位：%）

2.5 總灰分含量的測(cè)定

根據(jù)測(cè)定所得殘?jiān)亓浚?jì)算出本試驗(yàn)中4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精凍干片的總灰分。結(jié)果（表2）顯示，4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精凍干片總灰分范圍為1.9%~3.4%（均沒(méi)有超過(guò)4.0%）。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，可將本品總灰分限度不得超過(guò)4.0%納入標(biāo)準(zhǔn)。

表2 不同產(chǎn)地黃精凍干片總灰分含量 （單位：%）

2.6 醇溶性浸出物的測(cè)定

根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)計(jì)算乙醇浸出物含量，結(jié)果（表3）顯示，4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精凍干片的醇溶性浸出物在72.19%~78.99%（均未低于70.0%）。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，可將乙醇浸出物限度定為不低于70.0%納入標(biāo)準(zhǔn)。

表3 不同產(chǎn)地黃精凍干片乙醇浸出物含量（單位：%）

2.7 總多糖含量的測(cè)定

2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 結(jié)果（圖4）顯示，線性方程為y=5.732 3x-0.033 3，r=0.998，結(jié)果表明無(wú)水葡萄糖在0.033~0.198 mg 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7.2 樣品含量的測(cè)定 測(cè)定了4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精凍干片中總糖的含量，結(jié)果（表4）顯示，其總糖都不低于7.0%。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，可將本品總糖的限度定為不得少于7.0%納入標(biāo)準(zhǔn)。

表4 不同產(chǎn)地的黃精凍干片總多糖含量（單位：%）

2.8 薯蕷皂苷元含量的測(cè)定

2.8.1 波長(zhǎng)的選擇 在最大吸收波長(zhǎng)440 nm 處響應(yīng)值較強(qiáng)，因此選擇測(cè)定波長(zhǎng)為440 nm。

2.8.2 黃精薯蕷皂苷元對(duì)照品HPLC 色譜圖 用HPLC 檢測(cè)已制備好的對(duì)照品溶液，得到含有明顯薯蕷皂苷元主峰的色譜圖（圖5），圖5 中的峰1 為薯蕷皂苷元色譜。

圖5 黃精薯蕷皂苷元對(duì)照品HPLC 色譜圖

2.8.3 黃精薯蕷皂苷元供試品HPLC 色譜圖 用HPLC 檢測(cè)已制備供試品溶液，得到含有多條明顯鋒的高效液相色譜圖（圖6），其中含有對(duì)應(yīng)對(duì)照品溶液的明顯薯蕷皂苷元峰，峰1 為薯蕷皂苷元。

圖6 黃精薯蕷皂苷元供試品HPLC 色譜圖

2.8.4 樣品含量測(cè)定 測(cè)定了4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精凍干片中薯蕷皂苷元的含量，結(jié)果（表5、表6）顯示，r=0.999 2，線性范圍為1.08~10.80 mg/mL，4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精經(jīng)該法凍干后薯蕷皂苷元都不低于0.18%。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，可將本品薯蕷皂苷元的限度定為不得少于0.18%納入標(biāo)準(zhǔn)。

表5 不同產(chǎn)地黃精薯蕷皂苷元方程及其范圍

表6 不同產(chǎn)地黃精的薯蕷皂苷元含量

2.9 黃精提取物薯蕷皂苷元對(duì)3 種癌細(xì)胞的影響

試驗(yàn)結(jié)果（表7）顯示，薯蕷皂苷元對(duì)A431（人表皮癌細(xì)胞）細(xì)胞抑制活性與阿霉素相當(dāng)，即抗A431腫瘤活性較佳，但是對(duì)H1975（人肺腺癌細(xì)胞）、Ra?mos（人B 淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞）均無(wú)抗腫瘤活性，為后期開(kāi)發(fā)純天然抗人表皮癌細(xì)胞新藥提供一定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表7 薯蕷皂苷元的抗腫瘤活性（單位：L/（mol·cm））

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果中4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃精凍干片各種化學(xué)成分?jǐn)?shù)值均在《中國(guó)藥典》規(guī)定范圍內(nèi)，說(shuō)明此項(xiàng)研究可為后續(xù)研究?jī)龈牲S精的藥理活性、臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)等提供理論依據(jù)，同時(shí)也可為后續(xù)普通炮制黃精提供借鑒。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地黃精凍干片的水分、總灰分、醇溶性浸出物、總糖、薯蕷皂苷元含量存在一定差異，但測(cè)定結(jié)果在《中國(guó)藥典》規(guī)定范圍內(nèi)。4 個(gè)產(chǎn)地的凍干黃精的含水量平均值為3.80%，總灰分平均值為2.70%，醇溶性浸出物平均值為75.78%，總糖平均值為8.95%，薯蕷皂苷元含量不低于0.18%。與《中國(guó)藥典》要求相比，水分測(cè)定值雖然偏低，但在要求范圍內(nèi)，說(shuō)明凍干后的黃精有一般凍干產(chǎn)品延長(zhǎng)保存時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。前期較少文獻(xiàn)報(bào)道黃精凍干飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案，因此，在撰寫(xiě)黃精凍干片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案中，建議黃精凍干片含水量不超過(guò)5.0%，總灰分不超過(guò)4.0%，醇溶性浸出物含量不少于70.0%，總糖不少于7.0%，薯蕷皂苷元含量不低于0.18%。黃精凍干飲片中薯蕷皂苷元含量差異不大，但是相較其他炮制方法，凍干黃精飲片粉末的薯蕷皂苷元含量較高，且薯蕷皂苷元抗A431 腫瘤活性較佳，為后期凍干黃精質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究及補(bǔ)充提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。