李 暉，宋金秋，湯國(guó)祥，吳陽(yáng)祥，張大軍，王曉平，向曉寒，王 霞，賀 蘭，侯強(qiáng)紅

（1.湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.益陽(yáng)市赫山區(qū)畜牧工作站，湖南 益陽(yáng) 410013；3.鳳凰縣兩林鄉(xiāng)人民政府，湖南 鳳凰 416211；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；5.懷化職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 懷化 416000）

泰勒蟲(chóng)是一種可經(jīng)蜱傳播的血液原蟲(chóng)，該病原可寄生在反芻動(dòng)物（如牛、羊）的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)，引起嚴(yán)重的臨床癥狀，如貧血、高熱和消瘦等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致病畜死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1，2］。羊泰勒蟲(chóng)首次報(bào)道于埃及，目前該病原在全世界廣泛流行，且羊泰勒蟲(chóng)有多個(gè)種，如綿羊泰勒蟲(chóng)（Theileria ovis）、萊氏泰勒蟲(chóng)（Theileria lestoquardi）、呂氏泰勒蟲(chóng)（Theileria luwenshuni）和隱藏泰勒蟲(chóng)（Theileria recondita）等。不同地區(qū)羊群中泰勒蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)種存在差異，如甘肅地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種為呂氏泰勒蟲(chóng)和尤氏泰勒蟲(chóng)［3］，而新疆羊群中綿羊泰勒蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種，且其陽(yáng)性率高達(dá)62.64%［4］，以上已有結(jié)果說(shuō)明中國(guó)羊群泰勒蟲(chóng)感染情況較為復(fù)雜且嚴(yán)重。

湘西自治州地處湖南省西部，該地區(qū)牧草資源豐富，為當(dāng)?shù)厣窖蝠B(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供了天然的有利條件。湘西地區(qū)的山羊養(yǎng)殖發(fā)展迅速，其飼養(yǎng)量已超過(guò)120 萬(wàn)頭，年產(chǎn)值愈億元，山羊養(yǎng)殖為湘西自治州當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展作出了巨大的貢獻(xiàn)［5］。為了對(duì)湘西地區(qū)山羊泰勒蟲(chóng)的流行情況進(jìn)行調(diào)查及種類鑒定，本研究從該地區(qū)12 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)共收集204 份山羊血液樣品，應(yīng)用PCR 法檢測(cè)泰勒蟲(chóng)的流行情況，并隨機(jī)挑選16 個(gè)蟲(chóng)株18S rRNA 序列PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序與分析，初步明確該地區(qū)山羊泰勒蟲(chóng)的種類，以期為該地區(qū)山羊泰勒蟲(chóng)病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

根據(jù)湘西山區(qū)的自然地理地貌和山羊養(yǎng)殖特點(diǎn)，于2018 年8 月至2019 年8 月分別從湖南省湘西自治州的鳳凰縣、花垣縣、保靖縣部分養(yǎng)殖場(chǎng)（每個(gè)縣隨機(jī)挑選4 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)）隨機(jī)無(wú)菌采集204 份山羊血樣，其中鳳凰縣、花垣縣和保靖縣采集樣品數(shù)量分別為86 份、61 份和57 份，樣品標(biāo)記后低溫送至華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，待檢。

1.2 主要試劑

TIANamp Genomic DNA Kit（產(chǎn)品編號(hào)：DP304-03，北京）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；50×TAE 電泳緩沖液購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；瓊脂糖、DL2000 DNA Marker 和2×Super PCR Mix 購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.3 基因組DNA 提取及PCR 檢測(cè)

血液基因組DNA 的提取步驟按照DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取的基因組DNA 保存于-20 ℃。利用泰勒蟲(chóng)屬特異性引物18S rRNA-F：5′-AACCT?GGTTGATCCTGCCAGTAGTCAT-3′和18S rRNA-R：5′-GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′擴(kuò)增該原蟲(chóng)18S rRNA 基因的V4 高變區(qū)，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 體系（50 μL）包括：PCR預(yù)混液25.0 μL、上下游引物（10 pmol/L）各2.0 μL、基因組DNA 3.0 μL 和去離子水18.0 μL，反應(yīng)條件為94 ℃5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min，每個(gè)反應(yīng)均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，其中陽(yáng)性對(duì)照基因組DNA 來(lái)源于綿羊泰勒蟲(chóng)，陰性對(duì)照基因組設(shè)置為去離子水，PCR 反應(yīng)結(jié)束后取5.0 μL 產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并觀察結(jié)果。

1.4 序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析

挑選具有代表性的陽(yáng)性樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，使用DNAstar軟件對(duì)獲得的序列進(jìn)行拼接，同時(shí)與GenBank 收錄的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比較，應(yīng)用MEGA 7.0 軟件中的鄰接法（Neighor-joining）構(gòu)建種系發(fā)育樹(shù)，boot?strap 值設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 檢測(cè)結(jié)果

采用泰勒蟲(chóng)屬通用檢測(cè)引物18S rRNA-F/18S rRNA-R 對(duì)采自湘西地區(qū)的204 份樣品進(jìn)行了PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共167 份樣品檢測(cè)為泰勒蟲(chóng)病陽(yáng)性，其平均檢出率為81.86%。凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增片段大小約400 bp，無(wú)非特異性條帶，且陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均成立。部分樣品PCR 產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖1 所示。

圖1 羊泰勒蟲(chóng)樣品18S rRNA 基因序列PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 湘西地區(qū)山羊泰勒蟲(chóng)分子流行特點(diǎn)分析

分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果（表1）顯示，湘西地區(qū)山羊泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性率為81.86%。進(jìn)一步分析該地區(qū)山羊泰勒蟲(chóng)的分子流行病學(xué)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鳳凰縣、花垣縣、保靖縣羊泰勒蟲(chóng)病陽(yáng)性率差異較小，分別為82.56%、77.05%和85.96%。此外，不同品種山羊泰勒蟲(chóng)病感染率較為一致，黑山羊和本地山羊陽(yáng)性率分別為79.52%和83.47%；但不同飼養(yǎng)模式羊群泰勒蟲(chóng)病陽(yáng)性率存在一定差異，其中舍飼山羊和散養(yǎng)山羊泰勒蟲(chóng)病感染率分別為75.78% 和92.10%。

表1 湘西地區(qū)山羊泰勒蟲(chóng)病分子病學(xué)流行分析結(jié)果

2.3 湘西地區(qū)山羊泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)種鑒定結(jié)果

本研究從被調(diào)查的12 個(gè)羊場(chǎng)中隨機(jī)抽選了16份PCR 陽(yáng)性樣品（每個(gè)羊場(chǎng)1 份樣品）進(jìn)行測(cè)序鑒定蟲(chóng)種，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有樣品擴(kuò)增的18S rRNA 序列大小基本一致，為396~400 bp，核苷酸序列同源性為 99.70%~100.00%，且與呂氏泰勒蟲(chóng)分離（KY973285）核苷酸序列同源性均超過(guò)99.50%，但與其他充足分離株對(duì)應(yīng)序列同源性相對(duì)較低；進(jìn)一步遺傳進(jìn)化分析結(jié)果（圖2）顯示，本研究獲得的樣品與已知呂氏泰勒蟲(chóng)分離株屬于同一分支，與其他蟲(chóng)株所屬分支相隔較遠(yuǎn)，提示本研究獲得的蟲(chóng)株樣品均為呂氏泰勒蟲(chóng)。

圖2 基于18S rRNA 基因序列構(gòu)建呂氏泰勒蟲(chóng)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 小結(jié)與討論

泰勒蟲(chóng)病在牛羊養(yǎng)殖過(guò)程中較為常見(jiàn)，泰勒蟲(chóng)病病原-泰勒蟲(chóng)主要感染宿主（如牛、羊）的巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致病畜出現(xiàn)高熱、貧血和消瘦，部分發(fā)病動(dòng)物可出現(xiàn)體表淋巴結(jié)腫大，甚至死亡［1］。大量研究表明，中國(guó)羊泰勒蟲(chóng)流行情況十分嚴(yán)重，但不同地區(qū)流行情況差異較大，如新疆阿勒泰地區(qū)［6］羊泰勒蟲(chóng)病陽(yáng)性率為23.3%，吉林省部分地區(qū)［7］羊血液樣品中泰勒蟲(chóng)病原檢出率為28.08%，但四川省攀西地區(qū)［8］山羊泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性率高達(dá)73.44%，部分縣（市）羊群陽(yáng)性率達(dá)100.0%，說(shuō)明泰勒蟲(chóng)病在中國(guó)不同地區(qū)分布廣泛且嚴(yán)重，相應(yīng)的流行病學(xué)調(diào)查將有利于防控措施的制定與實(shí)施。

目前，山羊養(yǎng)殖業(yè)在湘西地區(qū)畜牧業(yè)中一直占有重要的地位，但近年來(lái)頻發(fā)疑似羊泰勒蟲(chóng)病的案例給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前針對(duì)泰勒蟲(chóng)PCR 診斷的分子標(biāo)記基因有很多，其中18S rRNA 基因序列因其在寄生蟲(chóng)的生物進(jìn)化過(guò)程中較為穩(wěn)定，同時(shí)也具有高變性，可作為理想的分子標(biāo)記用于蟲(chóng)種鑒定和遺傳變異等研究［9，10］。為初步調(diào)查湘西地區(qū)山羊泰勒蟲(chóng)病流行情況，本試驗(yàn)應(yīng)用PCR 技術(shù)對(duì)該地區(qū)的204 份山羊血液樣品泰勒蟲(chóng)病流行情況進(jìn)行調(diào)查與種類鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)病原18S rRNA 基因檢出率為81.86%，本文調(diào)查結(jié)果高于吉林?。?］和陜西?。?1］部分地區(qū)。分析湘西地區(qū)山羊泰勒蟲(chóng)病感染情況如此嚴(yán)重可能有以下原因：該地區(qū)畜牧養(yǎng)殖業(yè)較為發(fā)達(dá)，但養(yǎng)殖水平較低，導(dǎo)致疫病多發(fā)；湘西地區(qū)多山和樹(shù)叢，同時(shí)氣候較適合蜱蟲(chóng)的繁殖，而蜱蟲(chóng)是泰勒蟲(chóng)的重要傳播媒介［12］，這導(dǎo)致羊群在采食過(guò)程中感染泰勒蟲(chóng)病的幾率提高；當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶忽視對(duì)羊泰勒蟲(chóng)病的防控。進(jìn)一步對(duì)被調(diào)查樣品進(jìn)行不同地區(qū)、品種及飼養(yǎng)模式的比較分析，發(fā)現(xiàn)不同品種和地區(qū)羊群感染率差異較小，這可能與當(dāng)?shù)厣窖蚩缈h交易較為頻繁，且不同山羊品種對(duì)泰勒蟲(chóng)易感性差異較小等有關(guān)，但舍飼羊群較散養(yǎng)羊群感染率低，其原因可能是盡管泰勒蟲(chóng)在該地區(qū)羊群中流行情況較為嚴(yán)重，但散養(yǎng)羊群較舍飼羊群接觸到病原或其宿主（蜱蟲(chóng)）的幾率更大［7］。

本研究通過(guò)對(duì)部分泰勒蟲(chóng)樣品18S rRNA 基因序列進(jìn)行測(cè)序與分析，發(fā)現(xiàn)其基因序列與呂氏泰勒蟲(chóng)參考株同源性均高于99.50%，且進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明它們位于同一分支，因此可確定本文測(cè)序的16 份山羊源泰勒蟲(chóng)樣品均為呂氏泰勒蟲(chóng)，但未檢出其他泰勒蟲(chóng)，提示該地區(qū)羊群中呂氏泰勒蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種，其結(jié)果與袁延慶等［13］和田萬(wàn)年等［7］調(diào)查結(jié)果基本一致，但與孟林明等［12］報(bào)道呂氏泰勒蟲(chóng)與其他泰勒蟲(chóng)混合感染這一情況存在差異。由于本研究未對(duì)所有泰勒蟲(chóng)PCR 陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序，故無(wú)法確定該地區(qū)羊群是否感染其他泰勒蟲(chóng)。本文調(diào)查結(jié)果為湘西地區(qū)山羊泰勒蟲(chóng)病的防控提供了科學(xué)依據(jù)，但該地區(qū)羊群是否感染除呂氏泰勒蟲(chóng)外其他蟲(chóng)株還需要進(jìn)一步研究。