張文文，吳琴燕，殷錫峰，孟 嫻，倪衛(wèi)東，梁紅芳

（1.鎮(zhèn)江市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測試中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212009；2.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400；3.句容市中醫(yī)院，江蘇 句容 212400）

蒼術(shù)為菊科多年生草本植物，根莖為中藥蒼術(shù)的基原植物之一，具有燥濕健脾，祛風(fēng)散寒，明目的功效［1］。蒼術(shù)屬植物在我國分布較廣，因江蘇茅山地區(qū)的蒼術(shù)品質(zhì)較好，故名為茅蒼術(shù)［2］。蒼術(shù)中主要藥用成分為蒼術(shù)素、蒼術(shù)苷、β-桉葉醇、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ等［3］。2015年版《中國藥典》將蒼術(shù)素規(guī)定為蒼術(shù)的指標(biāo)性成分，含量不低于0.3%［3］，而在茅蒼術(shù)中該含量約為0.6%［4］。大量報(bào)道表明，蒼術(shù)苷存在于蒼耳子中，含量達(dá)到0.1%［5］，蒼術(shù)苷是否存在于蒼術(shù)中暫未見報(bào)道。目前，對蒼術(shù)化學(xué)成分的檢測主要采用HPLC法和GC-MS法進(jìn)行測定，存在樣品基質(zhì)干擾較大、前處理復(fù)雜、檢測時(shí)間長等問題［3］，本研究擬建立茅蒼術(shù)中蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷的UPLC-MS/MS檢測方法，以期為茅蒼術(shù)的質(zhì)量評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

超高效液相色譜：Agilent 1290；質(zhì)譜檢測器：ABsciex 4500；電子天平：XP105DR 型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；超純水系統(tǒng)：AWL-020I-P，艾科浦儀器有限公司；超聲波清洗器：KQ-250E型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；醫(yī)用離心機(jī)：H2050R 型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

甲醇和乙腈（色譜純，美國默克公司）；乙酸銨（≥98%，德國CNW 公司）；蒼術(shù)素、蒼術(shù)苷標(biāo)準(zhǔn)樣品購買于成都曼思特生物科技有限公司，純度＞98%。質(zhì)譜用水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

母液配置：分別稱取蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷1 mg，蒼術(shù)素加入1 mL丙酮溶解，蒼術(shù)苷加入1 mL甲醇溶解，分別配置成1 mg/mL的母液，-20 ℃保存后，備用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：按照梯度稀釋法，分別配置蒼術(shù)素濃度為100、50、25、12.5、6.125 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，蒼術(shù)苷濃度為4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3 儀器工作條件

色譜柱：Agilent C 18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸混合水溶液（A）和0.1%甲酸混合乙腈溶液（B），洗脫梯度：0～1 min，40%A；1～5 min，40%～10%A；5～9 min，10%A；9.00～9.10 min，10%～40%A；9.10～12.00 min，40%A。進(jìn)樣體積為1 μL；流速為0.2 mL/min；柱溫為40 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI）；離子源加熱溫度（TEM）450 ℃；離子源電壓（IS）為-4500 V；碰撞氣（CAD）為medium；氣簾氣（CUR）為10；霧化氣（GS1）為45 ℃；輔助氣（GS2）為45℃。檢測方式為多反應(yīng)檢測模式（MRM），監(jiān)測離子及相應(yīng)參數(shù)見表1所示。

表1 MRM監(jiān)測模式條件下質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品前處理

茅蒼術(shù)（購買于句容茅山農(nóng)戶）通過試驗(yàn)粉碎機(jī)（FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司）對蒼術(shù)進(jìn)行粗粉碎至過40目篩網(wǎng)后備用。

提取溶劑試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取1 g蒼術(shù)粉末，分別采用水、乙腈、丙酮、異丙醇、乙醚、乙酸乙酯和甲醇7種提取劑40 mL，室溫條件下超聲（250 W，頻率35 kHz）提取30 min，離心取上清待測。

提取時(shí)間試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取1 g蒼術(shù)粉末，選擇合適的提取溶劑40 mL，在室溫條件下，分別超聲提取5、15、30、45、60 min，離心取上清待測。

提取甲醇含量試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取1 g蒼術(shù)粉末，分別取40 mL濃度為0、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇，室溫條件下超聲提取30 min，離心取上清待測。

提取液固比試驗(yàn)：取40 mL甲醇和一定量的蒼術(shù)粉，在液固比分別為5、10、20、40、80和120 mL/g時(shí)，室溫條件下超聲提取30 min，離心取上清待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 依據(jù)每個(gè)化合物響應(yīng)值的差別，把蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷分別配置為25.0和0.5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化，2種化合物均在正離子掃描模式下，蒼術(shù)素獲得了準(zhǔn)分子離子［M+H］+，蒼術(shù)苷獲得的脫鉀離子［M-K+H］+，響應(yīng)明顯較高，以此作為母離子，進(jìn)行子離子掃描分析，圖1、圖2為2種化合物的二級掃描質(zhì)譜圖，選擇響應(yīng)值高的離子為二級特征離子，該離子碎片與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［6-7］。根據(jù)特征離子，對去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使得離子對的信號達(dá)到最高，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如表1所示。

圖1 蒼術(shù)苷二級掃描質(zhì)譜圖

圖2 蒼術(shù)素二級掃描質(zhì)譜圖

2.1.2 色譜條件優(yōu)化 根據(jù)2種化合物的理化性質(zhì)，選用C18色譜柱，選擇5 mol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）為水相，乙腈為有機(jī)相，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定1.2所述洗脫程序，可以在8 min內(nèi)獲得良好的分離效果和適當(dāng)?shù)某龇鍟r(shí)間。蒼術(shù)素在4.5 min左右出峰，蒼術(shù)苷在1.5 min左右出峰，且基質(zhì)中雜峰較多，此梯度可以實(shí)現(xiàn)蒼術(shù)素與雜質(zhì)較好的分離（圖3、圖4）。蒼術(shù)苷分子量較大、干擾小，樣品中含量低。

圖3 標(biāo)樣中蒼術(shù)素色譜圖

圖4 標(biāo)樣中蒼術(shù)苷色譜圖

2.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

根據(jù)1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制濃度數(shù)據(jù)，獲得方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限如表2所示。

表2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

2.3 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的影響 乙腈［8］、丙酮［8］、異丙醇［9］、乙醚［9］、乙酸乙酯［10］、甲醇［11］和三氯甲烷［8］是非極性物質(zhì)的主要提取劑，蒼術(shù)素為非極性物質(zhì)，蒼術(shù)苷為極性物質(zhì)，采用水、乙腈、丙酮、異丙醇、乙醚、乙酸乙酯、甲醇和三氯甲烷的同時(shí)提取蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷（圖5），發(fā)現(xiàn)采用甲醇提取，蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷提取量均高于其他提取劑，分別為0.908 mg/g和7.010 μg/g。

圖5 不同提取溶劑對蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷含量的影響

2.3.2 提取時(shí)間的影響 由圖6可知，提取時(shí)間對蒼術(shù)素有一定的影響，隨著時(shí)間的延長，提取量升高，30 min后不再變化；提取時(shí)間對蒼術(shù)苷無明顯影響，30 min為最佳提取時(shí)間。

圖6 提取時(shí)間對蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷含量的影響

2.3.3 甲醇濃度的影響 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，適量的水對原料具有溶脹作用，可以促進(jìn)有效成分的溶出。由圖7可知，在對倉術(shù)的提取過程中，甲醇濃度的不同，對蒼術(shù)苷的影響較大，濃度越高，提取量越高；而對蒼術(shù)素的影響不明顯，因此，水的溶脹作用并未有效促進(jìn)蒼術(shù)苷和蒼術(shù)素的提取量，最佳提取溶劑為100%濃度甲醇。

圖7 甲醇濃度對蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷含量的影響

2.3.4 提取液固比的影響 液固比的影響如圖8所示，由圖8可知，液固比在80 mL/g時(shí)，蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷提取量達(dá)到最佳值，繼續(xù)增加液固比，含量變化不明顯。

圖8 液固比對蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷含量的影響

2.4 回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差

取40 mL甲醇，加入0.5 g蒼術(shù)粉，并加入一定量的蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷標(biāo)品，使蒼術(shù)中分別含有1.0、0.5、0.2 mg/g的蒼術(shù)素標(biāo)樣和2.5、10.0和20.0 μg/g的蒼術(shù)苷標(biāo)樣，每個(gè)濃度重復(fù)4次，計(jì)算該方法的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果表明，3個(gè)濃度加標(biāo)水平下，蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷的回收率分別為77.9%～95.0%和72.5%～106.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.3%～9.5%和9.5%～12.6%，均符合檢測要求（表3）。

表3 樣品加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

建立了使用LC-MS/MS快速測定茅蒼術(shù)中蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷的方法，通過優(yōu)化質(zhì)譜和色譜參數(shù)，2種化合物均具有較高的離子化效應(yīng)的離子對和最佳檢測條件。采用超聲提取，對提取溶劑、提取時(shí)間、甲醇濃度和固液比4個(gè)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以甲醇為提取劑，在液固比為80 mL/g，超聲提取30 min，蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷的提取量均達(dá)到了較高水平，分別約為1.6 mg/g和18 μg/g。該方法前處理簡單、分析快速、定性定量準(zhǔn)確、檢測限低，可以滿足茅蒼術(shù)中對蒼術(shù)素和蒼術(shù)苷的檢測要求。