普天磊，韓學琴，廖承飛，羅會英，何 璐，鄧紅山，范建成，金 杰

（云南省農(nóng)業(yè)科學院 熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所/元謀干熱河谷植物園，云南 元謀 651300）

辣木（Moringa oleiferaLam.）為辣木科辣木屬的多年生落葉喬木，共有13個種，生長速度快，種植6個月即可開花結(jié)果，產(chǎn)量高，適應性強，在熱帶、亞熱帶地區(qū)均可種植［1-2］。辣木全株富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分［3］，黃酮、多酚、多糖、異硫氰酸酯、生物堿、萜類等功效成分，既能有效地抵抗營養(yǎng)不良，又具有降血糖、降尿酸、抗腫瘤、調(diào)血脂、抗氧化、抗炎、保肝等藥理作用［4-5］，是一種極具營養(yǎng)價值、藥用價值和經(jīng)濟價值的植物。辣木于2012年被我國衛(wèi)健委批準為新資源食品，現(xiàn)已廣泛應用于食品、飼料、日化、凈水等領(lǐng)域［6］。

繁育系統(tǒng)是種群有性生殖的紐帶，一般通過花表型性狀、花粉活力、柱頭可授性、花粉胚珠比等參數(shù)評判［8-9］?；ǚ刍盍Φ臏y定方法分為2種：一種為染色法，即I2-KI染色法、氯化三苯四氮唑法（TTC法）、醋酸洋紅染色法等；另一種為離體萌發(fā)法，離體培養(yǎng)法是能較好地反映花粉活力真實值的方法，柱頭可授性一般采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法測定［10-11］。辣木原產(chǎn)于印度、肯尼亞、尼日利亞等國家，主要分布于我國的云南、海南、廣東、福建等地［7］。我國栽培的辣木多從國外引進，國內(nèi)辣木育種進展緩慢，優(yōu)質(zhì)品種匱乏，繁育類型分析對辣木遺傳育種工作的開展具有重要意義。本研究通過對辣木花形態(tài)特征的觀測以及花粉活力、柱頭可授性的分析，以期為辣木雜交育種工作的開展提供基礎支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來自云南省農(nóng)業(yè)科學院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所辣木創(chuàng)新基地（101.87°E，25.69°N，海拔1118.2 m），屬于季風型干熱河谷氣候，常年平均氣溫21.9 ℃，年降水量低于700 mm。選取植株健壯，生長良好，產(chǎn)量較高的辣木材料，于早晨9:00花藥散粉時，隨機摘取不同開放狀態(tài)的辣木花朵帶回實驗室，分離出花藥與柱頭，測定花粉活力和柱頭可授性。

1.2 花部特征的觀察和測量

分別取10朵不同開放狀態(tài)的辣木花進行解剖，并采用游標卡尺依次測量花冠直徑、花冠長度、萼片直徑、萼片長度、雄蕊長度、雌蕊長度。

1.3 花粉活力的測定

添加300 μL的液體培養(yǎng)基于EP小管，培養(yǎng)基由175 g/L蔗糖、400 mg/L氯化鈣及150 mg/L硼酸構(gòu)成，分別取辣木不同開放狀態(tài)的花藥置于培養(yǎng)基中，每個狀態(tài)重復3次，將花粉輕輕剝離并均勻分散于培養(yǎng)液，置于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，避光條件下自然培養(yǎng)，用顯微鏡（江南永新BM2000）定時觀察，花粉萌發(fā)率穩(wěn)定后，隨機選取5個不重復的視野，每個視野不少于150?；ǚ哿?，統(tǒng)計視野內(nèi)的花粉萌發(fā)數(shù)和花粉總數(shù)，并計算花粉萌發(fā)率，根據(jù)花粉萌發(fā)率判斷花粉活力的強弱，計算公式如下：辣木萌發(fā)率（%）=萌發(fā)的花粉數(shù)（粒）/總花粉數(shù)（粒）×100%。

1.4 柱頭可授性的測定

取不同開放狀態(tài)的辣木花朵柱頭置于凹面載玻片上，滴加由1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22的比例配制而成的反應液至浸滿柱頭，迅速置于顯微鏡下觀察柱頭的反應狀況，根據(jù)氣泡產(chǎn)生的多少和快慢來判斷柱頭活性的強弱。

1.5 異交指數(shù)（OCI）的評判

依據(jù) Dafni的標準評判辣木的繁育系統(tǒng)類型，具體如下：花朵直徑＜1 mm記為0，1～2 mm記為1，2～6 mm記為2，＞6 mm記為3；花藥開裂的同時柱頭具有可授性或雌蕊先熟記為0，雄蕊先熟記為1；柱頭與花藥在同一高度記為0，空間分離記為1；三者之和為 OCI值。當OCI=0時，交配方式為閉花受精；當OCI=1時，為專性自交；當OCI=2時，為兼性自交；當OCI=3 時，自交親和，有時需要傳粉者；當OCI=4 時，異交，部分自交親和且需要傳粉者［12］。

1.6 花粉-胚珠比（P/O）的測定

將辣木單花子房解剖，花藥溶解，并置于顯微鏡下統(tǒng)計單花胚珠數(shù)及花粉數(shù)。依據(jù)Cruden的標準判斷交配方式：P/O值為2.7～5.4時，閉花受精；為18.1～39.0時，專性自交；為31.9～396.0時，兼性自交；為244.7～2588.0時，兼性異交；為2108.0～195525.0時，專性異交［13］。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計辣木花粉總數(shù)和花粉萌發(fā)數(shù)，采用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，SAS 9.0軟件進行方差分析，GraphPad Prism 6軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木花部的形態(tài)特征

辣木花形態(tài)特征性狀測定結(jié)果見表1，具體形態(tài)和開放狀態(tài)見圖1，辣木花序腋生，為圓錐花序，由上到下無明顯的開放順序（圖1A）。花有梗，氣味芳香，花瓣呈白色，底部微紅，左右對稱，花瓣5片，最上一片花瓣較大，中間兩瓣次之，最下兩瓣最小，且聯(lián)合呈龍骨狀（圖1G），花瓣直徑9.29～12.56 mm，長度為10.65～13.08 mm。萼筒盆狀，花萼5片，線狀披針形，呈白色（圖1F），直徑為8.51～13.68 mm，長度為8.18～12.01 mm，花朵開放后向下彎曲。雄蕊5枚，平均長度為7.91 mm，左右對稱分布，底部密布短絨毛，其高度從中間到兩邊依次降低，花藥黃色，退化雄蕊5枚（圖1C，圖1D）。雌蕊1枚，平均長度為7.52 mm，子房上位，子房外背短絨毛，尾部呈紅色，花柱微彎曲（圖1E）。辣木一年四季均可開花，且集中開花兩次，單次花期1周左右，花朵開放第1天花蕾萌動，花萼先打開，第2天花瓣打開，隨著花朵開放天數(shù)的增加，花瓣顏色逐漸加深，由白色變?yōu)榈S色，并逐漸萎縮凋落；同時，柱頭逐漸高于雄蕊，若授粉成功則結(jié)為果莢（圖1H～圖1N）。

表1 辣木花表型性狀測定結(jié)果 mm

圖1 辣木單花開放進程

2.2 花粉活力分析

采用離體萌發(fā)法對辣木花粉活力進行評估，由圖2和圖3可知，辣木花粉粒呈類球形，有一個萌發(fā)孔萌發(fā)出花粉管，花粉管內(nèi)有內(nèi)含物分布，其長度隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增長。辣木花粉在現(xiàn)蕾期有微弱的花粉活力，隨著花朵開放時間的延長，花粉活力逐漸增強，在花朵開放第3天時，花粉活力最強，且顯著高于其余狀態(tài)；第4天后，花粉活力顯著降低，第6天花粉萌發(fā)率最低，但與第4、5天差異不顯著。

圖2 辣木花粉活力的測定

圖3 辣木花粉萌發(fā)形態(tài)

2.3 柱頭可授性分析

通過聯(lián)苯胺—過氧化氫法對不同開放狀態(tài)的辣木花柱頭進行檢測（表2，圖4），結(jié)果表明，辣木花現(xiàn)蕾期柱頭可授性較弱，部分不產(chǎn)生氣泡，柱頭無可授性；隨著開放天數(shù)的增加，柱頭可授性逐漸增強，當花朵開放達到第4、5天時，產(chǎn)生的氣泡最多，冒出最迅速，反應液變藍，柱頭可授性最強；花朵開放第6天時，氣泡生成減少，反應液不變色，可授性減弱。

圖4 辣木柱頭可授性檢測

2.4 繁育系統(tǒng)評判

辣木花瓣直徑9.29～12.56 mm，花冠直徑＞6 mm，賦值為3；花藥開裂時柱頭具有可授性，賦值為0；雌雄器官在空間位置分離，賦值為1。辣木雜交指數(shù)OCI值累計分值等于4。根據(jù)Dafni的標準，初步判斷繁育系統(tǒng)為部分自交親和，異交則需要傳粉者。

辣木花粉和胚珠形態(tài)見圖3和圖5，辣木花粉類球形，胚珠呈水滴形；單花花粉數(shù)平均為19400粒；胚珠數(shù)平均為22.67個；花粉—胚珠比（P/O）平均為855.76；據(jù)Cruden的標準，辣木P/O值在244.7～ 2588.0之間，初步判斷辣木花屬于兼性異交類型。

圖5 辣木胚珠形態(tài)

3 結(jié)論與討論

花粉活力的高低是辣木雜交育種成功的關(guān)鍵，本試驗采用離體萌發(fā)法以及對辣木的花粉活力進行測定，發(fā)現(xiàn)辣木在開花第3天時花粉活力最高，與呂亞等［14］研究結(jié)果稍有不同，他們認為狹瓣辣木花粉活力在開花第2天達到最強，而PKM1花粉活力在開花第1天達最強。這可能是由于選用的辣木材料、植株生長環(huán)境不同而導致花粉活力的差異，花粉采集時間及培養(yǎng)環(huán)境的不同，亦會導致花粉活力的差異。黃瓊等［15］研究表明薄殼山核桃花粉活力由高到低的變化規(guī)律為：散粉盛期＞散粉初期＞即將散粉期＞散粉末期。楊瀾等［16］研究表明16個小時為紅司花粉最適培養(yǎng)時間，且12～28 ℃有利于提高多肉植物紅司的花粉萌發(fā)率，20～36 ℃有利于花粉管伸長。本試驗對辣木單一材料秋季花期早晨9:00的花粉活力進行檢測，而辣木品種材料多，且一年四季均可開花，后續(xù)還需增加不同辣木材料種類及對不同采樣時間點的花粉活力進行檢測，繼續(xù)改進和完善辣木的花粉活力檢測方法。

本試驗采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法對柱頭可授性進行測定，發(fā)現(xiàn)在辣木開花第1天就有可授性，第4、5天時柱頭可授性最強。植物可通過自身的生理生化反應來維持柱頭可授性，Bhattacharya［17］、劉輝［18］等研究表明辣木柱頭可授性與柱頭上分布的酯酶分泌物密切相關(guān)，酯酶分泌物在辣木開花第1天不表達，從開花第3天開始大量表達。相關(guān)研究［14］發(fā)現(xiàn)狹瓣辣木和PKM1柱頭可授性均在開花第3天最強，該結(jié)果與本研究稍有差異，這可能是由于研究對象的不同導致的。不同的研究對象，植物柱頭可授性持續(xù)時間長短不同，木地膚在開花第8～12天時柱頭可授性最強［19］，野鳶尾柱頭可授性在開花5～6 h最強［20］，蘭州百合在開花當天8:00～12:00柱頭可授性最強［21］。周英等［22］發(fā)現(xiàn)不同木槿品種的柱頭可授性不同，淺紫紅心等品種柱頭可授性最強，牡丹木槿的最弱。

目前我國培育出的辣木品種主要有3種，PKM1、PKM2及紅河一號［23］，辣木優(yōu)質(zhì)品種匱乏，繁育類型研究對促進辣木品種培育具有重要意義。辣木花朵開放第1天柱頭就有可授性，第4天達到最強；花粉自開放第1天起就具有活力，5朵花藥在柱頭兩側(cè)由高到低排布，為辣木自花授粉創(chuàng)造了良好的環(huán)境條件。與此同時，辣木花粉黏連在花藥上，不易吹落授粉，花朵氣味芳香，單花可為傳粉者提供60.5%糖含量的花蜜報酬物，主要傳粉者為蜂類，使辣木接受外源花粉而進行異花授粉［24］。結(jié)合本研究的異交指數(shù)、花粉胚珠比的判定結(jié)果，筆者認為辣木的繁育類型為部分自交親和，兼性異交繁育類型。

本文對辣木的花粉活力和柱頭可授性進行測定，發(fā)現(xiàn)該辣木材料的花粉活力在開花第3天最強，柱頭可授性在開花第4、5天達到最強，花粉活力最高時期與柱頭可授性最強時期不重疊。后續(xù)開展雜交育種工作時，可選擇在開花第3天時采取花粉保存，并于開花第4天或第5天進行授粉，授粉完成后立即套袋，防止傳粉昆蟲對授粉結(jié)果的影響。