邱 浩，郭 倩，崔浪軍，閆鵬東，閆亞平

(西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室/藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室/陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119)

白及為蘭科植物白及Bletillastriata(Thunb.) Reichb.f.的干燥塊莖，具有止血、抗菌、消腫、抗腫瘤、生肌斂瘡等功效[1]，其主要次生代謝物白及多糖具有抗炎癥、抗腫瘤、降血脂、降血糖和抗衰老等作用[2]。此外，白及多糖具有良好降解性、相容性和可修飾性，多用于藥物遞送系統(tǒng)、傷口敷料、生物材料等[3]。

關(guān)鍵次生代謝物含量是衡量藥用植物品質(zhì)的重要指標(biāo)，其合成除了與植物自身遺傳特性密切相關(guān)外，與外界環(huán)境特征也顯著相關(guān)。根際土壤真菌不僅能誘導(dǎo)植物合成特定的次生代謝物，有些真菌還能夠提高植物的抗病性，從而提升植物產(chǎn)量[4]。土壤理化因子是土壤肥力的重要指標(biāo)，土壤真菌對土壤養(yǎng)分的穩(wěn)定和可持續(xù)利用起到關(guān)鍵作用[5]，二者相互作用，顯著影響植物生長和次生代謝物質(zhì)的積累。研究表明，土壤Zn2+、Mn2+等能夠改變植物根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，影響植物的生長和次生代謝物的合成[6]。如人參(PanaxginsengC. A. Mey.)根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)改變能提高宿主植物多糖含量的積累[7]，而大豆(Giycinemax(L)Merrill)根際土壤的鐮刀真菌等則降低宿主多糖含量[8]。因此，篩選與宿主植物次生代謝物質(zhì)積累密切相關(guān)的土壤理化因子和根際土壤真菌，對于藥用植物次生代謝物質(zhì)積累機制的揭示和高產(chǎn)、科學(xué)田間管理方案的研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。

有研究表明，土壤養(yǎng)分狀況能夠影響白及多糖及產(chǎn)量變化[9]，且根際土壤真菌群落與白及產(chǎn)量和多糖變化關(guān)系密切[10]。然而，影響白及產(chǎn)量及質(zhì)量主要根際土壤真菌種類和關(guān)鍵土壤理化因子尚不清楚?；诖耍P者研究以不同產(chǎn)地的白及和根際土壤為材料，系統(tǒng)分析、揭示關(guān)鍵根際土壤理化因子和真菌種類與白及產(chǎn)量、多糖含量之間的關(guān)系，為開發(fā)高質(zhì)高產(chǎn)的白及田間管理技術(shù)方案提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

2019年采集7個產(chǎn)地的白及及其根際土壤樣品。每個產(chǎn)地隨機選取30株白及(分為3組，每組10株)，收集白及根系表面土壤，混合均勻，除去雜質(zhì)，冰盒運回實驗室，分為兩部分待測：一部分自然風(fēng)干用于土壤理化性質(zhì)的測定，另一部分立即放入-80℃冰箱，用于土壤真菌群落分析。產(chǎn)地見表1。

表1 白及樣品來源

1.2 白及產(chǎn)量、多糖含量測定

將采收后的部分附子曬干至恒重，稱量其重量并計算產(chǎn)量。粉碎后，采用苯酚—濃硫酸法測定多糖含量[11]。

1.3 根際土壤理化因子測定

土壤中大量與微量元素含量的測定采用PW2403型X-Ray熒光光譜儀(Brukers 8，德國)[12]。

1.4 根際土壤真菌測定

使用Soil Genomic DNA Kit(天根)試劑盒提取土壤總DNA，測定總DNA濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA提取質(zhì)量。利用引物(ITSIF. 5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'，ITS2R. 5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')PCR擴增后，建庫、Illumina HiSeq高通量測序。利用云平臺(http://www.biocloud.net/)進行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析等。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用 R(v4.1.1；http://www.r-project.org/)分析數(shù)據(jù)。在P<0.05水平上采用單因素方差(One-way ANOVA)分析白及多糖、產(chǎn)量多樣性指數(shù)之間的差異，繪制理化因子含量熱圖、真菌豐度熱圖、相關(guān)性熱圖，分析根際土壤理化因子與真菌對白及質(zhì)量及產(chǎn)量的影響，產(chǎn)量、多糖、理化因子、真菌數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理以確保分析準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 白及品質(zhì)含量分析

方差分析結(jié)果表明(表2)，陜西省商洛市山陽縣(A)和云南省麗江市永勝縣(D)產(chǎn)地的白及產(chǎn)量接近，與其他產(chǎn)地差異顯著(P<0.05)。除河南省三門峽市(E)產(chǎn)地的白及多糖含量明顯高于其他產(chǎn)地外，多糖含量在其他產(chǎn)地含量相近。

表2 產(chǎn)量及多糖含量

2.2 根際土壤理化因子分析

對白及根際土壤理化因子進行聚類，繪制熱圖。如圖1所示，不同產(chǎn)地理化因子可聚為三類，陜西省商洛市(A)、湖北省宜昌市(B)、河南省三門峽市(E)、云南省普洱市(G)聚為一類；云南省麗江市(D)、湖南省張家界市(F)聚為一類；陜西省漢中市聚為一類(C)。其中，Ca2+在河南省三門峽市(E)含量較高，在其他產(chǎn)地含量相近，Zn2+、P等在陜西省漢中市含量較高，其他產(chǎn)地含量相近。Na+、Mg2+等在陜西省商洛市(A)、湖北省宜昌市(B)含量較高，在其他產(chǎn)地含量相近，Al3+、Fe2+等在不同產(chǎn)地含量相近。

圖1 根際土壤理化因子含量熱圖

2.3 根際土壤真菌多樣性指數(shù)

通過繪制稀性曲線，評判樣本的當(dāng)前測序深度是否足以反映樣本真菌多樣性。隨樣品測序量的增大，相應(yīng)深度下的Operational Taxonomic Unit(OTU)數(shù)量不斷增多，隨著測序數(shù)據(jù)量不斷增大，各曲線趨向平坦，繼續(xù)增加測序深度發(fā)現(xiàn)新的 OTU 概率較小，說明每個樣品測序數(shù)量已經(jīng)滿足數(shù)據(jù)分析需求，測序可以反映出樣品中真菌群落的多樣性信息，因此測序數(shù)據(jù)充足、合理，可以用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析(圖2)。

圖2 根際土壤真菌稀釋曲線

較不同產(chǎn)地附子根際土壤真菌Alpha多樣性(表3)。其中，Shannon、Simpson、Ace指數(shù)均在云南省麗江市(D)、湖南省張家界市(F)、云南省普洱市(G)之間相似；Chao指數(shù)在陜西省商洛市(A)、湖北省宜昌市(B)之間相似，以及陜西省漢中市(C)、云南省麗江市(D)、湖南省張家界市(F)之間相似，Coverage在不同產(chǎn)地均相似。

表3 根際土壤真菌Alpha多樣性指數(shù)

2.4 根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析

對白及根際土壤屬水平真菌進行主成分分析，繪制不同產(chǎn)根際土壤真菌主成分分析圖(PCA)反映真菌群落的組成差異性。如圖3所示，兩種主成分累積貢獻率56.62%。第一主成分分析表明，除A產(chǎn)地，根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)在其他產(chǎn)地相近。第二主成分分析表明，除C產(chǎn)地，真菌群落結(jié)構(gòu)在其他產(chǎn)地相近。

圖3 根際土壤真菌PCA

2.5 根際土壤真菌差異性分析

對白及根際土壤真菌中豐度較高的真菌屬進行聚類，繪制物種豐度熱圖。如圖4所示，E、F和G聚為一類，呈現(xiàn)出：青霉菌屬(Penicillium)、葡萄球菌屬(Staphylotrichum)、 木拉克酵母屬(Cystofilobasidium)等豐度高，鐮刀菌屬(Fusarium)、莖點霉屬(Phoma)、鏈格孢屬(Alternaria)豐度低的特點。其余的聚為另一類，呈現(xiàn)出：鐮刀菌屬(Fusarium)、莖點霉屬(Phoma)、鏈格孢屬(Alternaria)豐度高、青霉菌屬(Penicillium)、葡萄球菌屬(Staphylotrichum)、 木拉克酵母屬(Cystofilobasidium)豐度低的特點。且在G中青霉菌屬(Penicillium)、葡萄球菌屬(Staphylotrichum)等真菌豐度最高。F中木拉克酵母屬(Cystofilobasidium)、梭孢殼屬(Thielavia)等真菌豐度最高。 E中頭束霉屬(Cephalotrichum)、被孢霉屬(Mortierella)等真菌豐度最高。D中鏈格孢屬(Alternaria)、莖點霉屬(Phoma)等真菌豐度最高。C中鐮刀菌屬(Fusarium)、織球殼菌屬(Plectosphaerella)等真菌豐度最高。B中擬盾殼霉屬(Paraconiothyrium)真菌豐度最高。A中毛殼菌屬(Chaetomium)、耐冷酵母屬(Guehomyces)真菌豐度最高。

圖4 根際土壤真菌群落物種差異

2.6 白及產(chǎn)量、多糖與根際土壤理化因子、真菌群落相關(guān)性分析

將白及產(chǎn)量、多糖含量與豐度前20的根際土壤真菌，以及土壤關(guān)鍵理化因子進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，產(chǎn)量、多糖含量只與少量真菌及個別理化因子顯著相關(guān)(圖5)。其中產(chǎn)量、多糖含量與土壤Cystofilobasidium、Thielavia豐度、以及Zn2+含量正相關(guān)，與土壤Phoma豐度和Na+含量負相關(guān)。此外，土壤Penicillium和Fusarium豐度與白及產(chǎn)量正相關(guān)，與多糖含量負相關(guān)， 而Al3+、Ca2+與多糖含量正相關(guān)，與產(chǎn)量負相關(guān)；

圖5 白及根際土壤真菌及理化因子與產(chǎn)量相關(guān)性分析

3 結(jié)果與討論

多糖是白及的主要活性成分，具有很強的抗菌性和抗癌特性?？梢栽鰪娧軆?nèi)皮細胞的增殖和血管內(nèi)皮生長因子的表達的[13]。已有研究表明，植物遺傳特性、根際土壤理化因子、土壤真菌群落結(jié)構(gòu)會影響白及多糖的積累及產(chǎn)量[14]。然而，影響白及多糖及產(chǎn)量具體的理化因子與土壤真菌尚不明確，本研究對不同產(chǎn)地白及進行研究發(fā)現(xiàn)，部分理化因子、真菌與白及多糖積累及產(chǎn)量密切相關(guān)。

次生代謝產(chǎn)物通過調(diào)控植物和土壤生物之間的相互作用，在植物演替或凋落物分解等生態(tài)系統(tǒng)過程中發(fā)揮著重要作用[15]。部分根際土壤真菌能促進植物吸收礦質(zhì)養(yǎng)分，提高植物抗性，調(diào)節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[16]。筆者研究結(jié)果表明，白及產(chǎn)量、根際土壤理化因子含量在不同產(chǎn)地間差異較大，而白及多糖含量和根際土壤真菌多樣性指數(shù)在不同產(chǎn)地間差異不大，但根際土壤真菌屬水平上豐度較高的真菌屬在不同產(chǎn)地差異較大。由此可初步推測，根際土壤理化因子及真菌群落結(jié)構(gòu)與白及產(chǎn)量、多糖含量可能密切相關(guān)。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，諸多土壤理化因子中，白及多糖含量與Zn2+和Ca2+含量正相關(guān)，與Na+含量負相關(guān)，而產(chǎn)量與Zn2+含量正相關(guān)，與Al3+負相關(guān)。類似的研究結(jié)果已有報道。Zn2+能提高玉米(ZeamaysL.)和豌豆(PisumsativumL.)的產(chǎn)量屬性及產(chǎn)量[17]，改善辣椒發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)特性，有助于辣椒(CapsicumannuumL.)的栽培[18]。Na+可提升甜菜(BetavulgarisL.)土壤pH，增加土壤結(jié)皮并降低滲透率，降低甜菜蔗糖含量，從而降低甜菜質(zhì)量與產(chǎn)量[19]。土壤中鋁能夠降低植物根伸長率和枝條生長、減少生物量產(chǎn)量、導(dǎo)致養(yǎng)分失衡以及生理和代謝過程改變，降低作物產(chǎn)量和質(zhì)量[20]。而Ca2+能有效改善土壤鹽分，降低鋁毒性，促進植物成長，提高產(chǎn)量和增強抗病性[21]。此外，土壤理化因子還可通過影響土壤真菌群落，進而改變植物的生長和影響植物次生代謝物的積累[22]。本研究結(jié)果表明，白及多糖及產(chǎn)量與木拉克酵母屬(Cystofilobasidium)、梭孢殼屬(Thielavia)正相關(guān)，與莖點霉屬(Phoma)負相關(guān)，產(chǎn)量與青霉菌屬(Penicillium)正相關(guān)，多糖含量與鐮刀菌屬(Fusarium)負相關(guān)，雖然不能確定這些菌是否能直接合成多糖類物質(zhì)，但已有的研究表明，這些屬的菌與宿主植物的次生代謝物質(zhì)的積累關(guān)系密切。土壤中的木拉克酵母屬(Cystofilobasidium)能夠促進南瓜(Cucurbitamoschata(Duch. ex Lam.) Duch. ex Poiret)次生代謝物的合成與積累[23]，Cystofilobasidium與Sporobolomyces比例增加，能夠提升胡蘿卜(DaucuscarotaL. var. sativa Hoffm.)中內(nèi)胡蘿卜素的積累，提升胡蘿卜質(zhì)量與產(chǎn)量[24]。土壤中的梭孢殼屬(Thielavia)為植物提供高活性的內(nèi)切葡聚糖酶，增加植物葡萄糖的積累，促進植物對土壤營養(yǎng)成分的吸收，從而提升苜蓿(MedicagosativaLinn)、玉米的產(chǎn)量[25～26]。莖點霉屬(Phoma)是引發(fā)植物葉病的主要病原菌[27]，能夠提升土壤中病原菌Leptosphaeriamaculans和Leptosphaeriabiglobosa比例，提高油菜(BrassicanapusL.)病害率，降低有效成分積累與產(chǎn)量[28]。青霉菌屬(Penicillium)對抑制真菌病害方面的功效[29]，能夠提升櫻桃(CerasuspseudocerasusG. Don)與玉米等植物產(chǎn)量[30]。鐮刀菌屬(Fusarium)引起的鐮刀菌枯萎病，嚴重影響了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成及土壤酸堿度[31]，從而使菠菜(SpinaciaoleraceaL.)、香蕉(MusananaLour.)等作物有效成分積累減少，產(chǎn)量降低[32]。由此說明，通過調(diào)節(jié)根際土壤中Zn2+、Na+、Ca2+、Al3+的含量及木拉克酵母屬(Cystofilobasidium)、梭孢殼屬(Thielavia)、莖點霉屬(Phoma)、青霉菌屬(Penicillium)、鐮刀菌屬(Fusarium)的豐度，可能可以改變白及產(chǎn)量及多糖含量。

綜上所述，白及產(chǎn)量及理化因子在不同產(chǎn)地間差異較大，多糖及真菌群落多樣性在不同產(chǎn)地間具有較高的相似性。提高Zn2+、Ca2+含量及木拉克酵母屬(Cystofilobasidium)、青霉菌屬(Penicillium)、梭孢殼屬(Thielavia)的豐度，降低Na+、Al3+的含量及莖點霉屬(Phoma)、鐮刀菌屬(Fusarium)的豐度，可能能夠提升白及產(chǎn)量及多糖含量。