歐陽(yáng)賢華，陳福艷，陳麗霞*，黎建斌*，李大列，梅寧

（1.廣西安桂水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，廣西 南寧 530228；2.廣西芳草安桂生物科技有限公司，廣西 南寧 530001；3.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西遺傳育種與健康養(yǎng)殖遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

近20年來(lái)，隨著羅非魚(yú)（）養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖技術(shù)不斷完善，已頗具規(guī)模。但隨著養(yǎng)殖面積不斷擴(kuò)大，密度不斷增加，水環(huán)境持續(xù)惡化，病害頻繁暴發(fā)，特別是鏈球菌病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大的損失。養(yǎng)殖戶在病害防治過(guò)程中，由于防治技術(shù)水平參差不齊、病急亂投醫(yī)和節(jié)省成本等原因，發(fā)病季節(jié)大量頻繁地濫用藥物，造成食品安全、環(huán)境污染、產(chǎn)生耐藥性和抗藥性等隱患。因此，一方面如何在養(yǎng)殖過(guò)程中有效改善水質(zhì)，快速修復(fù)水體環(huán)境，減輕環(huán)境污染的壓力；另一方面，如何增強(qiáng)魚(yú)體免疫力，減少病害發(fā)生和藥物使用，成為當(dāng)今羅非魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。

有效微生物群（Effective Microorganisms, EM）為復(fù)合微生物菌群，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、農(nóng)業(yè)和養(yǎng)殖等領(lǐng)域，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。EM菌在水產(chǎn)行業(yè)上的應(yīng)用，通過(guò)外潑達(dá)到較好的凈化水質(zhì)、提高水體自?xún)裟芰Φ哪康?；?nèi)服可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，促進(jìn)生長(zhǎng)和提高成活率。胡京、夏來(lái)根等、張衛(wèi)芳、田功太等、馬江耀等在海滲、青蝦和淇河鯽等養(yǎng)殖池塘使用EM 菌，達(dá)到較好的調(diào)節(jié)水質(zhì)、促進(jìn)生長(zhǎng)和提高免疫力的目的。但通過(guò)定期投喂EM 菌，對(duì)羅非魚(yú)養(yǎng)殖池塘水質(zhì)和羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能、抗氧化及非特異性免疫方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。現(xiàn)于2018年4月在廣西某羅非魚(yú)養(yǎng)殖基地，采用定期投喂EM 菌的養(yǎng)殖模式，分析其對(duì)池塘以及羅非魚(yú)的生長(zhǎng)性能、血清抗氧化和非特異免疫指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)位于廣西某羅非魚(yú)養(yǎng)殖基地，該基地向陽(yáng)通風(fēng)、規(guī)劃整齊、交通便利、排灌方便。試驗(yàn)池塘為4 口（1、2、3和4塘），面積分別為2.53，2.73，3.00，2.87 hm。每口池塘均配備3 kW 葉輪式增氧機(jī)3 臺(tái)，150 W 自動(dòng)投料機(jī)1 臺(tái)。

將4 口魚(yú)塘分為2 組，對(duì)照組（1塘）與試驗(yàn)組（2、3和4塘），分別投喂不同飼料。對(duì)照組（1塘）只投喂基礎(chǔ)飼料；試驗(yàn)組（2、3和4塘）投喂基礎(chǔ)飼料加EM 菌液，每隔3 d 拌料投喂1 次，EM 菌液添加量為飼料量的4%，定期投喂直至收獲。

1.2 EM 菌發(fā)酵

EM 菌種由廣西助農(nóng)畜牧科技有限公司提供；培養(yǎng)基（碳源）由南寧歐海生物科技有限公司提供。EM 菌發(fā)酵方法根據(jù)說(shuō)明書(shū)，材料質(zhì)量比為：m（EM菌）∶m（碳源）∶m（自來(lái)水）=1∶3∶18。將其充分?jǐn)嚢杈鶆颍芊庥谒芰贤埃?00 kg）內(nèi)發(fā)酵2～3 d，避免陽(yáng)光暴曬，1 次未用完的發(fā)酵液，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 清塘與放苗

開(kāi)春后，當(dāng)水溫高于20 ℃時(shí)，開(kāi)始清塘、蓄水和消毒。4月3日投放苗種，水溫21～23 ℃；羅非魚(yú)養(yǎng)殖面積、苗種規(guī)格和放養(yǎng)密度見(jiàn)表1。

表1 各池塘羅非魚(yú)種苗投放情況

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)魚(yú)的投喂按照“定時(shí)、定量、定點(diǎn)和定質(zhì)”的“四定”原則，同時(shí)視天氣、水溫和魚(yú)的攝食情況適當(dāng)調(diào)整。每天投喂2 次，08：00 和16：00，投喂量早期按體質(zhì)量的4%～5%，中后期按體質(zhì)量的2%～3%，以40～60 min 吃完為宜。視水質(zhì)情況，每月加注新水10～20 cm；每天開(kāi)啟增氧機(jī)，中午1～2 h，夜間2～5 h。每天早晚巡塘，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)處理，做好養(yǎng)殖日志。

1.5 水質(zhì)與病害監(jiān)測(cè)

每月定期采用奧克丹便攜式測(cè)水儀（I 代）測(cè)定溶解氧（DO）、銨態(tài)氮（NH-N）、亞硝酸鹽氮（NO-N）和pH 值。病害監(jiān)測(cè)方法為常見(jiàn)魚(yú)病檢查及細(xì)菌分離方法。

1.6 生長(zhǎng)性能、血清抗氧化和非特異性免疫指標(biāo)測(cè)定

養(yǎng)殖后期，大部分羅非魚(yú)達(dá)到500 g/尾的上市規(guī)格，對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)抽樣，測(cè)量生長(zhǎng)性能（體長(zhǎng)和體質(zhì)量），數(shù)量為30 尾/口，測(cè)量方法按照常規(guī)方法進(jìn)行。另外，隨機(jī)抽取羅非魚(yú)10 尾/口，抽取血清檢測(cè)抗氧化指標(biāo)和溶菌酶的活力。尾靜脈抽血，操作緩慢，將血液置于1.5 mL EP 管，于4 ℃冰箱靜置4 h 后，離心（4000 r/min，10 min），取上清液分裝于1.5 mL EP 管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血清中的總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、溶菌酶（LZM）的活力和丙二醛（MDA）含量的測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

檢測(cè)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2016 軟件進(jìn)行初步處理并分析；采用SPSS22 軟件進(jìn)行單因素分析（Oneway ANOVA），Duncan 氏多重比較，結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05 為差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 池塘水質(zhì)

連續(xù)4 個(gè)月對(duì)池塘水質(zhì)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1（a）（b）（c）（d）。由圖1 可見(jiàn)，ρ（DO）不斷升高，但到9月有所下降，試驗(yàn)組（2、3和4塘）ρ（DO）比對(duì)照組（1塘）高，但是各組之間差異不顯著；養(yǎng)殖早期ρ（NH-N）和ρ（NO-N）較低，但到高溫投料旺季，各組的ρ（NH-N）和ρ（NO-N）都有所升高，且試驗(yàn)組（2、3和4塘）ρ（NH-N）和ρ（NO-N）比對(duì)照組（1塘）低，但各組間差異不顯著（P<0.05）；pH 值在養(yǎng)殖過(guò)程中略有上升，試驗(yàn)組（2、3和4塘）上升的幅度比對(duì)照組（1塘）小，但各組間pH 值差異不顯著?？梢?jiàn)投喂EM 菌液，有助于提高池塘的ρ（DO），降低ρ（NH-N）和ρ（NO-N），穩(wěn)定pH 值。

圖1 養(yǎng)殖過(guò)程中池塘水質(zhì)變化情況

2.2 試驗(yàn)魚(yú)生長(zhǎng)性能

各池塘魚(yú)抽樣測(cè)量生長(zhǎng)性能，結(jié)果見(jiàn)表2。各池塘羅非魚(yú)平均體長(zhǎng)和平均體質(zhì)量差異顯著，試驗(yàn)組（2和3塘）的平均體長(zhǎng)和平均體質(zhì)量均大于對(duì)照組（1塘）；試驗(yàn)組（2和3塘）全部達(dá)到上市規(guī)格（500 g 以上），而1和4塘羅非魚(yú)規(guī)格次之；從抽樣結(jié)果推算各池塘產(chǎn)量，試驗(yàn)組（2塘）和對(duì)照組（1塘）最高，試驗(yàn)組（3塘）次之，而試驗(yàn)組（4塘）最低。

表2 羅非魚(yú)抽樣檢測(cè)生長(zhǎng)性能結(jié)果①

2.3 試驗(yàn)魚(yú)血清抗氧化及非特異性免疫

各池塘羅非魚(yú)血清抗氧化及非特異性免疫檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)組（2、3和4塘）血清中TAOC顯著高于對(duì)照組（1塘），且各組之間差異顯著；試驗(yàn)組（2和3塘）的血清CAT 活力顯著高于對(duì)照組（1塘），而試驗(yàn)組（4塘）CAT 活力顯著低于對(duì)照組（1塘）；試驗(yàn)組（2和4塘）的血清SOD 活力顯著高于對(duì)照組（1塘），而試驗(yàn)組（3塘）SOD 活力顯著低于對(duì)照組（1塘）。試驗(yàn)組（3和4塘）的血清LZM 活力顯著高于對(duì)照組（1塘），而試驗(yàn)組（2塘）LZM 活力顯著低于對(duì)照組（1塘）。試驗(yàn)組（2、3和4塘）血清MDA 含量顯著低于對(duì)照組（1塘）?？梢?jiàn)試驗(yàn)組（2、3和4塘）羅非魚(yú)抗氧化能力和LZM活力相對(duì)優(yōu)于對(duì)照組（1塘），而試驗(yàn)組（2、3和4塘）MDA 濃度顯著低于對(duì)照組（1塘）。

表3 各池塘試驗(yàn)魚(yú)血清抗氧化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果①

2.4 養(yǎng)殖過(guò)程中試驗(yàn)魚(yú)病害及防治情況

羅非魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中，池塘曾用生石灰、二氧化氯、聚維酮碘和濃戊二醛進(jìn)行消毒，定期用EM 菌液拌飼料預(yù)防病害，但在整個(gè)養(yǎng)殖過(guò)程中，各池塘均發(fā)生病害并造成死亡，可見(jiàn)以上措施并不能完全杜絕病害的發(fā)生，各池塘發(fā)病情況見(jiàn)表4。各池塘病害發(fā)生時(shí)間和程度不盡相同，各池塘羅非魚(yú)死亡數(shù)量分別為對(duì)照組（1塘）死亡3300 多尾，試驗(yàn)組（2塘）死亡2200 尾，試驗(yàn)組（3塘）死亡1800 尾，試驗(yàn)組（4塘）死亡3600 尾；病死率分別是7.0%，4.6%，4.6%和8.5%。各池塘死亡情況不一致，對(duì)照組（1塘）、試驗(yàn)組（2和3塘）羅非魚(yú)養(yǎng)殖早中期發(fā)生細(xì)菌性敗血病并造成持續(xù)性死亡，后期少部分魚(yú)因捕魚(yú)造成應(yīng)激死亡；試驗(yàn)組（4塘）在養(yǎng)殖早中期較為順利，生長(zhǎng)速度快，但在養(yǎng)殖后期，因增氧機(jī)出現(xiàn)故障，造成大規(guī)格羅非魚(yú)缺氧死亡，損失較大。

表4 羅非魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中病害及死亡情況

3 討論

3.1 投喂EM 菌對(duì)池塘水質(zhì)的影響

EM 菌是復(fù)合微生物，包含有乳酸菌、芽孢桿菌、光合細(xì)菌和酵母菌等。將EM 菌應(yīng)用于水體，發(fā)揮各種菌不同生長(zhǎng)特性，在水體環(huán)境中進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，通過(guò)氧化、硝化、反硝化、氨化、硫化、解磷和固氮等作用，將水體中易引起水質(zhì)惡化的剩餌、排泄物等有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化或分解為無(wú)害的硝酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽等物質(zhì)，直接排放或被水中植物或藻類(lèi)吸收利用，實(shí)現(xiàn)水生態(tài)環(huán)境的良性循環(huán)，起到修復(fù)和優(yōu)化環(huán)境的作用。在本試驗(yàn)中，將EM 菌與飼料攪拌混合后投喂，其中一部分EM 菌被魚(yú)吞食進(jìn)入消化道；另一部分EM 菌散落水體，逐漸在水體中生長(zhǎng)繁殖，形成優(yōu)勢(shì)菌群，從而起到調(diào)節(jié)水質(zhì)的作用。本試驗(yàn)中，各池塘pH 值略有升高，可能與藻類(lèi)生長(zhǎng)旺盛、利用水體CO間接提升pH 值有關(guān)。而對(duì)照組（1塘）pH 值上升幅度較大，但各組間差異不顯著，這一結(jié)果與馬江耀等研究結(jié)果相似，EM 菌能顯著提高pH 值；與張衛(wèi)芳的研究結(jié)果也相似，使用EM 菌有逐漸增大pH 值的作用。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組（2、3、4塘）ρ（DO）在6—8月逐漸升高，9月份開(kāi)始下降，可能與9月份氣溫開(kāi)始下降、藻類(lèi)不穩(wěn)定有關(guān)，與劉其芝等認(rèn)為EM 菌提高甲魚(yú)養(yǎng)殖水體的ρ（DO）結(jié)果相同，而與馬江濯等使用EM 菌對(duì)ρ（DO）無(wú)顯著影響的研究結(jié)果有差異，具體原因有待研究。EM菌有助于降低水體中的ρ（NH-N），本試驗(yàn)中，圖1顯示，對(duì)照組（1塘）ρ（NH-N）達(dá)到2.2 mg/L 以上，而試驗(yàn)組在1.5 mg/L 左右，較對(duì)照組要低很多；ρ（NO-N）的控制效果與ρ（NH-N）類(lèi)似，試驗(yàn)組（2、3、4塘）明顯低于對(duì)照組（1塘），這一結(jié)果與高征等、李先明等和黃培鈴等的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中EM 菌投喂量為飼料的4%，對(duì)銨態(tài)氮、亞硝酸鹽氮有明顯的調(diào)節(jié)作用，但對(duì)DO 和pH 值的改善不顯著，是否與用量有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3.2 投喂EM 菌促進(jìn)羅非魚(yú)生長(zhǎng)

本試驗(yàn)中抽樣結(jié)果表明，試驗(yàn)組（2和3塘）羅非魚(yú)的平均體質(zhì)量比對(duì)照組（1塘）高，試驗(yàn)組（2塘）放養(yǎng)密度、放養(yǎng)規(guī)格與對(duì)照組（1塘）很接近，但試驗(yàn)組（2塘）平均體質(zhì)量比對(duì)照組（1塘）高；試驗(yàn)組（3塘）的密度比對(duì)照組（1塘）稍低，但試驗(yàn)組（3塘）平均體質(zhì)量比對(duì)照組（1塘）高；試驗(yàn)組（4塘）魚(yú)苗放養(yǎng)規(guī)格比對(duì)照組（1塘）小，試驗(yàn)組（4塘）平均體質(zhì)量比對(duì)照組（1塘）小，可能受缺氧死亡一批大規(guī)格魚(yú)的影響，具體原因有待研究。研究表明，EM 菌發(fā)酵飼料有諸多優(yōu)點(diǎn)：EM 菌營(yíng)養(yǎng)豐富，富含有蛋白質(zhì)、多種維生素和礦物質(zhì)等，能促進(jìn)生物生長(zhǎng)發(fā)育；各種有益菌在代謝過(guò)程中能產(chǎn)生生長(zhǎng)促進(jìn)因子和酶類(lèi)，能提高生物機(jī)體免疫力；EM 菌在腸道中發(fā)揮占位優(yōu)勢(shì)，被吞食的EM 菌在生物腸道中生長(zhǎng)繁殖，形成優(yōu)勢(shì)菌群，在一定程度上抑制有害菌生長(zhǎng)，減少病害發(fā)生；EM 菌發(fā)酵飼料，對(duì)生物起到脫毒和提高品質(zhì)的作用，促進(jìn)其消化吸收和生長(zhǎng)。伍莉等在飼料中添加EM菌，改善了大口鲇和鯽血液指標(biāo)，加快了試驗(yàn)魚(yú)的生長(zhǎng)。胡京研究認(rèn)為，潑灑EM 菌改善海參腸道環(huán)境，提高飼料轉(zhuǎn)化率，預(yù)防疾病，提高其生長(zhǎng)性能。李紹戊等通過(guò)投喂及外潑枯草芽孢桿菌促進(jìn)鯉和草魚(yú)的生長(zhǎng)，提高了飼料利用率。馮俊榮等通過(guò)投喂和外潑EM 菌的方式，提高了牙鲆的生長(zhǎng)速度。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果相似，投喂EM 菌可促進(jìn)魚(yú)的生長(zhǎng)。

3.3 長(zhǎng)期投喂EM 菌對(duì)羅非魚(yú)抗氧化和非特異性免疫的影響

抗氧化能力是機(jī)體應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的重要指標(biāo)，其活性和含量隨環(huán)境脅迫的發(fā)生而改變，可用于衡量環(huán)境污染程度和機(jī)體免疫能力。CAT 和SOD 是抗氧化酶系統(tǒng)中重要的酶類(lèi)，對(duì)生物體內(nèi)活性氧自由基的清除起重要作用；MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化物反應(yīng)中的最終產(chǎn)物，累積到一定量可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞的損傷；LZM 是機(jī)體非常重要的非特異性免疫指標(biāo)，其水平和活性直接關(guān)系到魚(yú)類(lèi)的免疫能力和健康，它通過(guò)酶解破壞病原體的細(xì)胞壁，使水分進(jìn)入細(xì)胞，造成細(xì)胞的崩解，從而殺滅入侵的細(xì)菌和真菌，對(duì)機(jī)體起到積極的防衛(wèi)作用。該研究中，試驗(yàn)組（2、3和4塘）的T-AOC、CAT、SOD、LZM 相對(duì)高于對(duì)照組（1塘），但有個(gè)別指標(biāo)比對(duì)照組（1塘）低，具體原因有待研究；試驗(yàn)組（2、3和4塘）MDA 顯著低于對(duì)照組（1塘）?？梢?jiàn)試驗(yàn)組（2、3和4塘）的血清抗氧化能力相對(duì)優(yōu)于對(duì)照組（1塘），可能與定期投喂EM 菌有關(guān)系，發(fā)揮了以上抗氧化酶對(duì)魚(yú)機(jī)體的作用，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。