王晨宇，黃鴻兵，李佳佳，尹思慧，代培，俞雅文，徐宇，許志強(qiáng)，唐建清

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

克氏原螯蝦（），又名淡水克氏原螯蝦，隸屬節(jié)肢動物門，甲殼綱，十足目，爬行亞目，螯蝦科，原螯蝦屬。原產(chǎn)于北美洲，于1930年前后被引入中國，經(jīng)過近70年的發(fā)展，已成為我國重要的水生經(jīng)濟(jì)動物。2021年中國小龍蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展報告顯示，全國小龍蝦養(yǎng)殖面積達(dá)到145.64 萬hm，養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)到239.37 萬t。

1981年，Meyers 等首次從克氏原螯蝦蝦殼中提取并獲得蝦青素。蝦青素（Astaxanthin）是一種類胡蘿卜素，屬于酮式類胡蘿卜素,化學(xué)名為3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′-胡蘿卜素，在自然界中廣泛存在，呈紅色固體粉末狀，脂溶性，不溶于水，對高溫和光照比較敏感，且具有很強(qiáng)的抗氧化性，其抗氧化性是維生素E 的5 倍以上。

Wade 等研究發(fā)現(xiàn)，成年澳洲龍蝦蝦殼中蝦青素的含量、結(jié)構(gòu)等因素與蝦殼殼色有一定的關(guān)系；蝦青素與蛋白質(zhì)多分子復(fù)合物殼青素的結(jié)合是龍蝦殼呈現(xiàn)藍(lán)色的原因。目前，有關(guān)蝦青素的提取方法比較多，常見的有油溶法、堿提法、有機(jī)溶劑提取法等，其中有機(jī)溶液提取法是目前市場上比較行之有效的提取方法之一。蝦青素的測定方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、高效薄層析色譜法、LC-MS 分析法。目前大多數(shù)檢測儀器以高效液相色譜法為主，可準(zhǔn)確區(qū)分蝦青素和其他類胡蘿卜素，也有研究者采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法。

現(xiàn)以克氏原螯蝦為研究對象，利用高效液相色譜檢測克氏原螯蝦不同部位蝦殼中蝦青素含量，分析其中蝦青素中游離型和酯型蝦青素的相對含量，探究蝦青素含量與殼色的關(guān)系，旨在為克氏原螯蝦蝦青素綜合提取及后續(xù)相關(guān)體色研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜儀1260（美國Agilent 公司），T25 均質(zhì)機(jī)（德國IKA 公司），913 pH 計(jì)（瑞士萬通公司），BSA822 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器），移液槍（德國Eppendorf 公司），14R 離心機(jī)（Dynamica Velocity）。

試劑分別為甲醇、乙腈（德國默克公司），全反式蝦青素標(biāo)品（上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

克氏原螯蝦均采集于江蘇省淡水水產(chǎn)研究所浦口基地，采集時間為2021年10月，選擇同一塘口的克氏原螯蝦，規(guī)格、體色均為隨機(jī)抽樣。總共采樣9 只克氏原螯蝦，分別為1～9 號，采集其頭胸甲殼、尾肢殼、鉗甲、足甲部位的甲殼進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 殼色測定

采用HSB 模型對蝦殼殼色進(jìn)行測定，其中H為色調(diào)（°），S 為飽和度（%），B 為亮度（%），采樣前進(jìn)行拍照，記錄殼色，設(shè)備為佳能m 6 微單，圖像分析采用Adobe Photoshop CS6（美國Adobe）軟件，測定蝦殼不同部位顏色。

1.2.3 游離蝦青素的測定方法

1.2.3.1 樣品的提取

稱取樣品攪拌加無水硫酸鎂、均質(zhì)器、丙酮（20 mL）提取2 次；取2 mL 樣品提取液，加入2.9 mL 0.02 mol/L NaOH 甲醇過夜，渦旋混合后充氮密閉，在4 ℃冰箱中反應(yīng)12 h；然后在溶液中加入0.1 mL 0.6 mol/L 磷酸甲醇中和剩余的堿，再加100 mg PSA混勻靜置上機(jī)。

1.2.3.2 色譜條件

色譜柱：Cremo-LC-026 柱；流動相：甲醇30%乙腈70%；流量：1.0 mL/min；檢測波長：476 nm；檢測器：紫外檢測器；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。分別取樣品溶液和蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下洗脫。游離蝦青素含量測定換算公式如下。

式中：ρ——樣品質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——樣品體積，40 mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

ω——總蝦青素含量，μg/g。

標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=100.0643 x-7.1980（R=0.99946），表明蝦青素在0～12 μg/mL 線性關(guān)系良好，可用于蝦青素總量的測定。

1.2.4 游離型和酯化型蝦青素測定方法

根據(jù)《水產(chǎn)品及其制品中蝦青素含量的測定高效液相色譜法》（SC/T 3053—2019），對樣品進(jìn)行皂化處理，皂化后測定的為酯化型和游離型蝦青素的總量，第一次未皂化測定的為游離型蝦青素的總量，將其減去第一次測定的蝦青素量即為酯化型蝦青素的含量。皂化后總蝦青素含量測定換算公式如下。

式中：ρ——樣品質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——樣品體積，40 mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

ω——總蝦青素含量，μg/g。

標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=103.7193 x-8.3930（R=0.99944），表明蝦青素在0～12 μg/mL 時，線性關(guān)系良好，可用于蝦青素總量的測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

測定結(jié)果采用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）（n=3）表示；采用Gragh Pad Prism 6 軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位蝦殼中總蝦青素含量差異分析

采用有機(jī)溶劑提取克氏原螯蝦不同部位的蝦殼蝦青素，采用高效液相色譜分析，結(jié)果見圖1（a）（b）。由圖1 可見，蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（游離型）在5.6 min附近處有特征吸收峰，為全反式蝦青素；在6.7 和7.1 min 處分別出現(xiàn)特征峰，為13-順式蝦青素和9-順式蝦青素。洗脫時間表明，克氏原螯蝦不同部位均有游離型全反式蝦青素存在。

圖1 蝦青素高效液相色譜圖

將對蝦殼提取物進(jìn)行皂化操作，將其中酯化性蝦青素轉(zhuǎn)化為游離型蝦青素，測量總蝦青素含量。不同編號克氏原螯蝦蝦殼總蝦青素含量對比見圖2（a）（b）（c）（d）。由圖2 可見，總蝦青素含量最高值為3 號尾肢殼（311.37±0.16）μg/g，最低值為8 號鉗殼（35.25±0.05）μg/g，同規(guī)格克氏原螯蝦尾肢殼蝦青素總量高于其他部位，頭甲殼和鉗殼含量相近，足殼中含量最少。

圖2 不同編號克氏原螯蝦蝦殼總蝦青素含量對比

2.2 不同部位蝦殼游離和酯化蝦青素含量差異分析

蝦青素六元環(huán)上的羥基能夠與脂肪酸結(jié)合形成蝦青素脂肪酸酯。蝦青素酯類在477 nm 附近也有特征吸收，但是因?yàn)槭杷愿哂谟坞x型，所以洗脫時間長、出峰時間晚。樣品中待測物采用丙酮或二氯甲烷-甲醇混合溶液提取，經(jīng)堿皂化，其中的蝦青素酯轉(zhuǎn)化為游離態(tài)蝦青素。

不同編號克氏原螯蝦蝦殼中游離型蝦青素和酯化型蝦青素含量對比見圖3（a）（b）（c）（d）（e）（f）。由圖3 可見，游離型蝦青素含量最高值為4 號尾肢殼（140.29±0.19）μg/g，最低值為7 號足殼（20.65±0.07）μg/g。酯化蝦青素含量最高值為3 號頭甲殼（164.78 μg/g），最低值為2 號足殼（7.02 μg/g），酯化蝦青素量在頭胸甲和尾肢甲中含量高于游離蝦青素，而在蝦足殼中含量相似，游離型和酯型蝦青素的相對含量比例各不相同，差異較大，這可能由于選樣的克氏原螯蝦在大小規(guī)格體色上差異較大。由此可見，游離型蝦青素和酯化蝦青素的比例可能隨著龍蝦性征的改變而發(fā)生改變。

圖3 不同編號克氏原螯蝦蝦殼中游離型蝦青素和酯化型蝦青素含量對比

2.3 不同部位蝦殼中蝦青素含量與結(jié)構(gòu)差異和殼色深淺之間的關(guān)系

HSB 模型分析克氏原螯蝦蝦殼殼色見圖4（a）（b）（c）（d）（e）（f）（g）（h）（i）。根據(jù)HSB 顏色模型，色調(diào)越近0 點(diǎn)紅色加深，飽和度S 色，亮度B 越高色彩越明亮。運(yùn)用Adobe Photoshop CS6 對其進(jìn)行HSB 模型分析，分析后數(shù)值經(jīng)Gragh Pad Prism 6處理后得到圖5（a）（b）（c）（d）（e）（f）。

圖4 不同編號克氏原螯蝦HSB 模型體色分析。

由圖3 和圖5 可見，游離蝦青素含量較高的蝦普遍會呈現(xiàn)較深的殼色，色彩偏暗，飽和度也會較低，游離蝦青素含量較少，趨向于淺紅或者麻青的殼色，而色彩較明亮，飽和度較高。

圖5 不同編號克氏原螯蝦殼色的比較

3 討論

克氏原螯蝦獲得脂溶性類胡蘿卜素只能通過攝食，然后由代謝過程轉(zhuǎn)運(yùn)至色素細(xì)胞中。該試驗(yàn)選擇了同一塘口同一批次的克氏原螯蝦，規(guī)格多為5～8 cm 的紅殼蝦和青殼蝦，紅殼蝦性腺發(fā)育階段大多處于II、III 期，而青殼蝦性腺發(fā)育階段大多處于I、II 期，但也有部分5 cm 左右紅殼小蝦，性腺未成熟卻呈現(xiàn)紅色的狀態(tài)，這與郭風(fēng)英等、龔志等研究結(jié)果相似。由此可見，大部分的試驗(yàn)可以證明體色并非判定性成熟的標(biāo)志之一。費(fèi)志良等認(rèn)為青殼原螯蝦是當(dāng)年紅殼蝦蛻殼越冬后呈現(xiàn)的狀態(tài)。費(fèi)志良等還發(fā)現(xiàn)紅殼蝦生長速度較慢，含肉率偏低，但營養(yǎng)較為豐富，青殼蝦生長速度較快。本試驗(yàn)對克氏原螯蝦蝦殼進(jìn)行HSB 模型分析發(fā)現(xiàn)，隨著殼色值的降低，殼色不斷加深，游離蝦青素的含量越高，說明蝦青素含量的變化直接導(dǎo)致克氏原螯蝦殼色的改變。

黃永裕等研究不同類胡蘿卜素添加對中華鋸齒米蝦（）紅色品系體色的影響。結(jié)果顯示，天然蝦青素、螺旋藻、人工蝦青素、葉黃素對體色黃色值改善效果依次提升。河蟹的體色也基本取決于其類胡蘿卜素含量，蝦蟹類水生動物一般不能自身合成類胡蘿卜素，將食物中的類胡蘿卜素直接轉(zhuǎn)化為自身所需要的類胡蘿卜素，當(dāng)蝦蟹機(jī)體出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)時，蝦青素可清除其體內(nèi)的活性氧自由基。因此，體色的變化還有可能受到外部環(huán)境刺激所致，類胡蘿卜素攝入量和消耗量的變化同樣對蝦蟹類的體色具有較大的影響，增加了對蝦蟹體色與蝦青素含量探究的不確定性。該試驗(yàn)中，選擇的克氏原螯蝦均來自同一塘口，受到不同環(huán)境刺激的可能性較小，但在運(yùn)輸過程中部分蝦有應(yīng)激反應(yīng)，其對蝦青素含量變化的影響程度有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

采用高效液相色譜檢測其蝦殼不同部位蝦青素的含量，分析克氏原螯蝦甲殼顏色與蝦青素含量的關(guān)系。結(jié)果表明，克氏原螯蝦尾肢殼蝦青素總量高于其他部位，頭甲殼和鉗殼含量相近，足殼中含量最少；克氏原螯蝦殼色與游離蝦青素的含量有著密切的關(guān)系；游離型蝦青素和酯化蝦青素的比例可能隨著龍蝦性征的改變而發(fā)生變化。今后，可以通過研究蝦青素形態(tài)變化的基因，進(jìn)一步探究克氏原螯蝦體色變化的具體調(diào)控機(jī)制，為克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展提供參考。