岳冬雪，杜孟盈，皮亞寧，徐賡鑫，邱念偉，王仁君

（曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東曲阜273165）

0 引言

浮萍是一類最簡單的單子葉水生漂浮植物，屬于天南星科（Araceae）浮萍亞科（Lemnoideae），全世界共5 屬，約36 種。各類浮萍植株均較?。s0.5~15 mm），結(jié)構(gòu)簡單，根莖葉退化，僅由葉狀體和根系組成（或僅有葉狀體），葉狀體組織細胞內(nèi)充滿空氣，使浮萍完全適應(yīng)水面漂浮生活，廣泛分布于各類淡水水體中[1-2]。浮萍富含淀粉、蛋白質(zhì)、維生素和礦質(zhì)元素，是重要的潛在食品源、飼料、生物能源[1]，其中紫萍（Spirodela polyrhzia）和青萍（Lemna minor）還可入藥，具有宣散風(fēng)熱、透疹止癢、利水消腫等藥理作用[3]。此外，浮萍還具有快速吸附轉(zhuǎn)移氮磷元素、有機污染物、重金屬等有害物質(zhì)的能力，是毒理檢測和生態(tài)修復(fù)中常用的水生植物類群，具有很重要的生態(tài)價值[4]。

我國浮萍共有蕪萍屬（Wolffia）、紫萍屬（Spirodela）、青萍屬（Lemna）三個屬，其中蕪萍繁殖較快，但個體及其微小，不易實驗操作；紫萍生長較慢，生長環(huán)境要求高；青萍最為常見，分布于我國南北各省，生于水田、池沼及其他靜水水域，常與紫萍混生[5]。由于青萍繁殖較快，通常在浮萍群落中占絕對優(yōu)勢，最適于室內(nèi)培養(yǎng)，因此科學(xué)研究中常把青萍作為研究水生植物的模式生物[6]。本文系統(tǒng)介紹了青萍的室內(nèi)培養(yǎng)方法和經(jīng)驗，為青萍相關(guān)研究提供參考。

1 青萍的生物學(xué)特征

青萍植株結(jié)構(gòu)簡單，由葉狀體和根組成?？焖偕L時期的青萍，通常每株附著3~4 個葉狀體；葉狀體對稱，呈近圓形、倒卵形或橢圓形，全緣，長1.5~5 mm，寬2~3 mm；上表面呈綠色，稍凸起或沿中線隆起，葉脈不明顯；背面淺黃色或淺綠色或紫色，每個葉狀體垂生1 條絲狀根，根白色，最長3~4 cm。青萍主要通過出芽生殖進行無性繁殖，葉狀體背面兩側(cè)各具有一個向外開口的夾層囊（或僅一端具有開口）。成熟的葉狀體會在兩側(cè)的囊中分生出新的葉狀體，新葉狀體以極短的細柄與母體相連，成熟后脫落形成一個新的植物體。在冬季死亡之前，其夾囊內(nèi)產(chǎn)生橢圓形的冬芽，冬芽脫離母體后沉入水底越冬，第二年春天冬芽浮出水面，長出新株[5，7]。鳥類傳播是浮萍（含青萍）傳播到新地點的重要方式，浮萍能夠附著在水鳥的羽毛或爪上，靠鳥類傳播到不同的淡水水域中[4]。

2 青萍的室內(nèi)人工培養(yǎng)條件

2.1 培養(yǎng)溫度

青萍對溫度的適應(yīng)性較強，其生長繁殖溫度范圍為10~40℃；氣溫低于10℃青萍就會停止生長[8]；當(dāng)溫度低于5~7℃，青萍逐漸白化死亡[9]。陳俠樺等人[8]在不同溫度下人工培養(yǎng)青萍，發(fā)現(xiàn)在30℃條件下青萍生長速率最快，相對生長率和葉狀體直徑達到最大值。青萍屬的稀脈浮萍（Lemna aequinoctialis）則在25 ℃條件下表現(xiàn)出最大的相對生長速率[10]。因此建議青萍的人工室內(nèi)培養(yǎng)溫度控制在25~30℃。

2.2 光照強度

青萍可在6 μmol/m2/s 弱光下存活，其生長速度隨著光照強度的增加而加快，直到達到光合飽和點；超過飽和點，生長速率不再增大，甚至?xí)η嗥籍a(chǎn)生光抑制損傷，降低其生長速率[11]。青萍室內(nèi)生長的最適光照強度為5 000~10 000 Lux（約100~200 μmol/m2/s）。5 000 Lux 下青萍的生長速率約為2 000 Lux 光強下的2.5 倍，但5 000 Lux 和10 000 Lux 光強下青萍的生長速率差別不大[12]；光強繼續(xù)增加會降低青萍的葉綠素含量和光合效率[11，13]。我們實驗過程中還發(fā)現(xiàn)，強光照射到培養(yǎng)溶液中，還會導(dǎo)致培養(yǎng)溶液內(nèi)產(chǎn)生大量綠藻，附著于青萍根部，影響其生長。用黑色容器培養(yǎng)青萍可減少外部光源入射培養(yǎng)溶液，并能吸收透射入溶液中的光線，降低培養(yǎng)液中的光照強度，減少綠藻生長，有利于青萍生長。因此建議使用深色不透光容器培養(yǎng)青萍，或在透明容器外纏繞黑色膠帶，盡量減少培養(yǎng)溶液中的光照強度[14-16]。室內(nèi)培養(yǎng)光照達到5 000 Lux 青萍即可快速生長，且可以避免強光引起培養(yǎng)溶液的溫度升高和綠藻繁殖，一般熒光燈或LED 光源均能達到此光照要求。

光周期也影響青萍生長，青萍在短日照條件下生長速率低于長日照[17]。通過不同光周期生長實驗發(fā)現(xiàn)，青萍生長最適光周期為16 h：8 h，該光周期條件下有利于青萍葉狀體中淀粉的積累，葉綠素含量最高；若繼續(xù)延長光期反而會抑制葉綠素的合成，降低氣孔導(dǎo)度，影響光合作用[18]。

2.3 培養(yǎng)溶液

2.3.1 營養(yǎng)液的篩選。浮萍喜氮、磷豐富的富養(yǎng)化水體，培養(yǎng)浮萍最常用的培養(yǎng)溶液有Hoagland 營養(yǎng)液和Hunter 營養(yǎng)液。錢曉晴等[14]以稀脈浮萍、紫萍、少根紫萍為研究對象，證明3 種浮萍在Hoagland 營養(yǎng)液中的長勢均優(yōu)于Hunter 營養(yǎng)液。Hoagland 營養(yǎng)液中的氮磷比約為Hunter 營養(yǎng)液中氮磷比的6.5 倍[16]，說明浮萍更喜歡高氮磷比的富養(yǎng)化水體。程曉瑞[19]則證明在氮磷摩爾濃度比為5：1 的營養(yǎng)液中，浮萍長勢最好。我們用完全Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)的青萍長勢稍好于1/2濃度的Hoagland 營養(yǎng)液，因此建議用Hoagland 完全營養(yǎng)液培養(yǎng)青萍。

2.3.2 營養(yǎng)液的pH。青萍對水體pH 值適應(yīng)范圍較廣，可以在pH 為5~9 的范圍內(nèi)正常生長，pH 低于5.0對青萍的生長有明顯的抑制作用[20]。謝靖等[10]發(fā)現(xiàn)青萍在pH 為5.5 時相對生長速率最大；Mclay 等人[21]實驗結(jié)果顯示青萍最佳生長范圍為4~6，這一結(jié)果不太可靠。因為我們測試結(jié)果顯示青萍生長最適pH 為5.5~6.0，低于5.0 青萍生長速率顯著下降。因此建議把營養(yǎng)液pH 值調(diào)整至5.5~6.0。

2.3.3 培養(yǎng)方法。孫源等[22]用盛有Hoagland 營養(yǎng)液六孔板、培養(yǎng)皿、燒杯等深度不同的三種容器培養(yǎng)青萍，發(fā)現(xiàn)溶液越深，青萍的長勢越好，燒杯培養(yǎng)的青萍長勢最快。我們用水體深度為25 cm 的黑色水桶（容積20 L）擴繁青萍（浮萍初始水面覆蓋度約10%），無需更換培養(yǎng)液，青萍可在一周左右長滿水面；水深太淺，水體會大量蒸發(fā)，若未能及時更換營養(yǎng)液，會顯著影響青萍生長。實驗處理時，為了節(jié)約營養(yǎng)液，節(jié)省實驗空間，增大實驗重復(fù)數(shù)，我們用水體深度為6 cm，表面積為65 cm2的圓柱形黑色塑料容器培養(yǎng)青萍，每3 天更換1 次營養(yǎng)液，保證營養(yǎng)液成分穩(wěn)定。因此建議擴繁青萍時使用水體深度為20 cm 以上的深色不透光容器，實驗處理時建議用水體深度為5 cm 以上（超過青萍根的長度，不影響青萍飄移和根系生長），表面積為1 dm2左右的黑色容器進行培養(yǎng)。另外，青萍喜靜水，耐缺氧能力較強，無需進行通氣培養(yǎng)或者攪拌，通氣或攪拌反而會抑制青萍生長[23]。

3 室內(nèi)培養(yǎng)青萍的生長規(guī)律

前人在初始實驗時，每個培養(yǎng)容器中選用10 株青萍作為起始株數(shù)進行培養(yǎng)（該文獻把每個明顯伸出母體的葉狀體記為1 株，全部選用兩葉相連的青萍），培養(yǎng)一定時間后，統(tǒng)計每個培養(yǎng)容器的總株數(shù)，用總株數(shù)表示青萍的生長速率，發(fā)現(xiàn)起始株數(shù)為10 時誤差最小[24]。理論上講，起始株數(shù)越多，實驗誤差越小，上述實驗未設(shè)置對照，實驗結(jié)果不可靠。我們統(tǒng)計了室內(nèi)培養(yǎng)條件下單葉青萍、兩葉青萍和三葉青萍的比例，發(fā)現(xiàn)三葉青萍比例最高。我們?nèi)? 個相同的黑色培養(yǎng)盆，以10 個大小一致的三葉青萍（30 個葉狀體）為起始生物量進行室內(nèi)培養(yǎng)，保證培養(yǎng)盆的光照等環(huán)境條件完全一致，連續(xù)培養(yǎng)10 天，統(tǒng)計每天每個培養(yǎng)盆內(nèi)青萍的葉狀體總數(shù)，可以得到數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠的青萍生長曲線數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示青萍的生長規(guī)律是極顯著的指數(shù)生長曲線（圖1）；其他浮萍也具有類似生長規(guī)律[18]。超過一定的天數(shù)，由于生長和營養(yǎng)的限制，青萍的生長會逐漸受到抑制，生長曲線變成“S”形[22]，青萍處理時間建議不要超過10 天。生長曲線也可以用每個培養(yǎng)容器內(nèi)青萍總鮮重繪制，不過稱量總鮮重時會對浮萍造成損傷，數(shù)據(jù)也不如葉狀體數(shù)穩(wěn)定?？梢韵惹蟪隹傰r重與總?cè)~狀體數(shù)的比例關(guān)系：每100 株三葉青萍的鮮重（300 個葉狀體）大約0.60 g，然后將葉狀體數(shù)生長曲線換算成鮮重生長曲線，二者的規(guī)律基本一致[16]。對青萍進行逆境處理后，會抑制青萍生長，單葉青萍和兩葉青萍的比例大大增加，這時用株數(shù)繪制生長曲線是不合理的，這種情況用鮮重生長曲線最為合適。實驗者應(yīng)根據(jù)浮萍生長情況選擇合適的生長曲線。

圖1 青萍室內(nèi)培養(yǎng)的生長曲線

科學(xué)實驗中往往只需統(tǒng)計處理后每個培養(yǎng)容器內(nèi)青萍的最終總生物量（葉狀體總數(shù)或總鮮重），統(tǒng)計葉狀體總數(shù)比較費力，總鮮重更為可行。具體方法是：用小網(wǎng)撈出所有青萍，控去水滴，然后平鋪在兩層吸水紙上，上面蓋一層吸水紙，自然吸水5 分鐘后（不要擠壓），用精密天平稱量青萍總重量[25]。在適宜的室內(nèi)培養(yǎng)條件下，青萍約2~3 天繁殖一代[6]，繁殖6 代之后母體逐漸衰老死亡[2]。所以建議青萍的處理周期控制在10天左右，不要超過15 天，避免有大量衰亡的母體出現(xiàn)。大量擴繁或生產(chǎn)時，也要定期采收青萍，避免生長密度過高加快青萍的老化死亡，污染青萍產(chǎn)品。要注意的是，如果青萍采收過多，會導(dǎo)致青萍水體覆蓋度過低，水中藻類過量滋生，青萍的生長環(huán)境也會惡化，影響青萍的總產(chǎn)量與質(zhì)量[23]。了解青萍的生長規(guī)律對于科學(xué)研究及生產(chǎn)都至關(guān)重要。

青萍生長狀況還可用自然分開的株數(shù)、總干重、根長、葉狀體直徑表示。青萍新生葉狀體與母體相連的細柄極易斷裂，很難數(shù)清自然分開的青萍株數(shù)，該指標(biāo)的穩(wěn)定性較差。青萍的發(fā)育階段不同，其葉狀體大小及根的長短變化較大，因此也不宜用全部植株的平均大小或平均根長表示。測量每個培養(yǎng)容器內(nèi)青萍的總鮮重是最簡單可靠的生長指標(biāo)。若需準(zhǔn)確測量葉狀體直徑，可在顯微鏡下用顯微標(biāo)尺測量成熟葉狀體的直徑表示葉狀體大小。葉狀體面積則可用精度較高的葉面積儀掃描一定數(shù)量的成熟葉狀體總面積，然后計算每個成熟葉狀體的平均面積。如果環(huán)境對根系生長影響較為明顯，可以只測量成熟葉狀體的平均根長來量化青萍的生長狀況。

4 室內(nèi)培養(yǎng)青萍的注意事項

野外采集的青萍需要用自來水輕輕沖洗幾遍，選擇生長狀態(tài)良好、葉片肥碩、干凈完整的青萍用上述方法進行擴繁。用擴繁后的已經(jīng)適應(yīng)了室內(nèi)環(huán)境的青萍進行科研實驗。

實驗處理或者更換營養(yǎng)液時，撈取葉狀體需注意保護細根和葉狀體，建議用彎頭鑷子從青萍葉狀體下方挑起單個青萍，逐一進行移取，以免對青萍造成傷害。

在野外采集或室內(nèi)培養(yǎng)時，若獲得優(yōu)異單株，可用此單株進行擴繁，然后進行科學(xué)實驗，保證遺傳背景一致，并為青萍的生產(chǎn)提供優(yōu)良種質(zhì)。

為了保證科學(xué)研究數(shù)據(jù)的可靠性，除處理因素外，要確保每個培養(yǎng)容器的其他環(huán)境條件盡可能一致。為防止因位置造成光照不均，樣本設(shè)計可采用拉丁方設(shè)計，并每天進行前后、左右平移，減小因行效應(yīng)或列效應(yīng)導(dǎo)致的實驗誤差。

每隔3 天左右更換一次營養(yǎng)液，保證培養(yǎng)溶液營養(yǎng)成分穩(wěn)定。可將青萍撈入更換了營養(yǎng)液的新容器內(nèi)，原來的容器清洗后備用，以洗去滋生的綠藻。

稱量總鮮重時，用濾水小網(wǎng)將青萍從溶液中撈起，輕輕掂掉水滴，然后再用衛(wèi)生紙吸水5 分鐘。吸水后盡快用精密天平（≤0.001 g）稱量總鮮重，避免水分蒸發(fā)會使鮮重不斷下降。統(tǒng)計葉狀體數(shù)時最好由同一人進行統(tǒng)計，保證統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)一致。