鄭鳳長 熊?？?趙海龍 朱小康 薛繼軍 袁繼寶 李瑩 陳靜 朱自江

甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州730050

區(qū)域癌化理論證實病理形態(tài)結(jié)構(gòu)正常但Lugol’s染色異常的食管上皮即是食管上皮中的癌化區(qū)域，此區(qū)域中必然存在食管鱗癌早期的基因改變［1，2］?；谶@一理論基礎(chǔ)，我們初步建立了食管癌早期癌化區(qū)域與食管癌組織、正常食管組織間差異表達的基因文庫，用于進行后期研究工作。抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）是基于抑制性PCR 的未知差異表達基因篩選技術(shù)，目前已廣泛應用于差異表達基因的篩選，SSH 具有快速、高效、高特異性、高敏感性的優(yōu)點。本研究探討應用SSH法篩選獲得的CRNN 基因在早期食管癌變中的潛在價值，并初步評估其在早期食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2016 年1～12 月病理診斷的食管癌鱗癌切除標本。納入標準：無其他惡性腫瘤既往病史、未接受放療或化療，且癌組織距上切緣大于5cm 的患者標本。排除標準：上切緣陽性或存在其他病理類型標本、患者拒絕收集標本者。共納入符合要求患者標本68 例，對標本進行Lugol's 液染色處理。

1.2 組織標本收集 食管癌切除標本離體20 分鐘內(nèi)進行取材?？v向剖開食管腔，用醫(yī)用生理鹽水充分噴洗食管黏膜，噴灑Lugol's 液，5 分鐘后用醫(yī)用生理鹽水洗去食管黏膜表面Lugol's 液后觀察染色情況。依次收集主癌灶、主癌灶外Lugol's 液染色陽性區(qū)及正常食管黏膜染色區(qū)的小片或點狀食管黏膜，將所取標本分為三份，其中一份用于病理診斷（取10%中性福爾馬林溶液適量，固定組織，石蠟包埋后4 μm 切片，HE 染色）；其余兩份立即置入液氮裝置保存，后轉(zhuǎn)入-80℃凍存。通過對68 例患者標本進行Lugol's 液染色，將15 例病理表型正常、存在主癌灶以外Lugol's 液染色陽性區(qū)的組織納入研究中。

1.3 試劑和儀器 主要試劑：0.25%胰蛋白酶（Hyclone J140032），30%丙烯酰胺（Solarbio A1010），4×蛋白上樣緩沖液（Solarbio P1016，Agarose Qxoid），BCA 蛋白定量試劑盒（Solarbio P1510），DEPC 水（Beyotime R0021），NNN N-四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma WX13B2984V），PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa RR036A），RIPA Lysis Buffer（普利萊基因技術(shù)有限公司C1053），RNA Marker（Invitrogen RL6000），RNAiso Plus（TaKaRa SD1410），YBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa RR820A），蛋白質(zhì)Marker（Therm 26616），甘氨酸（Glycine）（Solarbio G8200），過硫酸銨（AP）（天津永晟精細化工公司20130428），辣根酶標記山羊抗兔lgG（北京中杉金橋FL-335），磷酸鹽緩沖液（PBS）（Solarbio 509E025），十二烷基磺酸鈉（SDS）（Sigma 323A033），胎牛血清（Wisent 86150021）。

主要儀器：超純水系統(tǒng)（Milli-Q Advantage），小型制冰機（SIM-f140 SANYO），臺式高速冷凍離心機（eppen dorf Centrifuge 5810R），臺式高速冷凍離心機（eppendorf Centrifuge 5417R），超微量分光光度計（ND2000 Thermo），超凈工作臺（蘇州華宇 HS-840），PCR 儀（Bio-rad MyCycler），石蠟切片機（SLEE CUT4062），全自動組織包埋機（Sakura Finetek Japan Co.5232），全自動組織脫水機（Sakura Finetek Japan CO.VIP-5Jr-J2），電動顯微鏡（0LYMPUS IX81），恒溫水浴鍋（鄭州南北儀器HH-4），恒溫金屬浴（Eppendorf 5352），電泳儀（BioRad Mini Protean Tetra），半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（BioRad Trans-Blot SD），凝膠成像儀（BioRad CHEMI DOC XRS+），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗DNP-9052BS-Ⅲ），超低溫冰箱（Haier DW-86W420），快速混勻器（江蘇新航儀器SK-1）。

1.4 方法 Real-Time PCR 檢測食管鱗癌組織、區(qū)域組織及正常組織CRNN RNA。

1.4.1 RNA 的提取。將收集的食管鱗癌手術(shù)切除標本癌組織、區(qū)域組織、正常組織，分別標記為Ca、L（+）、L（-）。①從-80℃取出組織樣本，稱重，每份樣本取100mg；將組織置于2mL RNase free 離心管中，冰上剪碎，加入1mL RNAiso Plus，1 枚鋼珠，置于組織勻漿儀（鋼珠及組織勻漿儀經(jīng)-80℃預冷30min），50Hz 4min；將離心管從組織勻漿儀上取下，冰上靜置5 min 充分裂解；12 000×g，4℃，離心10min；將液體轉(zhuǎn)入1.5mL RNase free 離心管，室溫靜置10min；加入200μL 的氯仿，劇烈震蕩30s，室溫靜置5min；12 000×g，4℃，離心10min；將上層液相轉(zhuǎn)入新的同種離心管中；加入同體積異丙醇，充分震蕩混勻，靜置10 分鐘；12 000×g，4℃，離心15 分鐘，可見乳白色沉淀于管底；棄液體，加入1mL 的75%乙醇洗滌沉淀，12 000×g，4℃，離心1 分鐘；小心除去蓋玻片，用濾紙吸去血清，滴加一抗（兔抗人單克隆抗體，1 ∶200 稀釋），用蓋玻片加封，37℃孵育2h；棄液體，超凈工作臺中空氣干燥RNA 沉淀后溶解于50μL DEPC處理水中，取5μL 小樣用于檢測RNA 完整性。②RNA完整性鑒定：封閉：PAP 筆畫圈，加血清后用蓋玻片加封，孵育37℃20min。③RNA 濃度及純度分析：小心除去蓋玻片，用濾紙吸去血清，滴加一抗（兔抗人單克隆抗體，1 ∶200 稀釋），用蓋玻片加封，37℃孵育2h。

1.4.2 cDNA 合成。取上一步得到的RNA，將濃度調(diào)整在450～500ng/μL 之間進行cDNA 合成。PrimeScript RT Master Mix 2μL、RNA 1μL、DEPC-treated water 7μL。渦旋混勻30s，離心1 min，置于PCR 儀上，37℃15min，85℃5s，4℃。將產(chǎn)物儲存于-20℃，待Real-Time PCR用。

1.4.3 Real-Time PCR。實驗準備：以β-actin 為管家基因，引物由TaKaRa 公司設(shè)計合成，序列如下：

用DEPC-處理水將引物溶解，并配置成100 μM的儲備液，10μL 分裝，-20℃保存，取一份儲備液稀釋至20μM 用于Real-Time PCR。①按TaKaRa 公司SYBR*Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明建立反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10μL、PCR Forward Prime r0.2μL、PCR Reverse Primer 0.2μL、cDNA 1μL、DEPC-treated water 8.6μL。②置于Real-Time PCR 儀上，按照設(shè)定程序進行反應。③實時熒光定量PCR 結(jié)果分析。采用Livak 法計算mRNA 的相對表達量，計算公式為：CT=CT目的基因-CT 管家基因；△△CT=△CT 實驗組-△CT 空白對照組；2-△△CT表示實驗組目的基因表達量相對于正常對照組表達量的倍數(shù)關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，定量資料采用（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA 的提取 本次實驗所提取的RNA 完整性高、質(zhì)量好，無降解，無蛋白質(zhì)等污染。見表1。

表1 RNA濃度與純度

2.2 Real-Time PCR 結(jié)果 以CRNN mRNA 在正常食管黏膜組織表達量為對照，將其均數(shù)設(shè)置為1，在區(qū)域組織、食管鱗癌組織中的表達量與在正常食管黏膜表達量的比值即為相對表達量，統(tǒng)計結(jié)果顯示CRNN基因在食管鱗癌組織與正常食管黏膜組織中的相對表達量差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）、在區(qū)域組織與正常食管黏膜組織中相對表達量差異也具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2、圖1、2、3。

表2 CRNN mRNA 在三組組織中的表達

圖1 CRNN 溶解曲線

圖2 CRNN 擴增曲線

圖3 食管組織中CRNN mRNA 的表達

3 討論

目前普遍認為，食管癌是一種由多因素共同作用、多種基因參與、多個階段發(fā)展的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展與多種基因表達相關(guān)。通過研究腫瘤組織與正常組織、瘤旁組織或不同病理分期、發(fā)展階段之間的基因差別，挖掘差別基因功能及其在癌變過程中的作用，是研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要手段，避免了全基因組表達差異研究面臨的一個問題，即得到一大批差異表達的基因，往往是數(shù)十至數(shù)百之多，由于所得到的基因數(shù)量過大無法處理。

抑制消減雜交技術(shù)［3-5］是在PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上出現(xiàn)的，是通過抑制性PCR 的未知差異表達基因篩選技術(shù)，其首先通過消減雜交使有豐度差異的單鏈DNA 得到均衡，再通過抑制性PCR 使目標基因得以富集。目前廣泛應用于差異表達基因的篩選，較之其他方法，其具有以下特點：①特異性高。通過兩次消減雜交和PCR，選擇性擴增目的cDNA 片段、抑制非目的cDNA 片段，提高了差異基因的檢出率。②靈敏度高。與基因芯片技術(shù)相比，SSH 技術(shù)通過平衡cDNA 豐度，完整保留低豐度差異基因，避免過量分離高豐度差異基因，利于稀少基因的表達。③快速、高效。數(shù)天內(nèi)即可完成，每次可同時分離幾十至幾百個差異基因。④操作簡單。實驗方法簡單、技術(shù)成熟、對設(shè)備要求低。

目前，抑制性消減雜交技術(shù)在腫瘤相關(guān)基因的研究中已體現(xiàn)出重要的價值，尤其在肝癌、腎癌、前列腺癌、食管癌、骨肉瘤的差異基因研究中。DongXY 等［3］采用SSH 技術(shù)，構(gòu)建了一例原發(fā)性肝癌患者肝癌組織與癌旁肝臟組織的差異基因文庫，篩選出差異基因19 個，其中已知基因17 個。Choi SY 等［4］對直腸癌細胞與相應的正常直腸細胞進行抑制性消減雜交，發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)高表達的已知基因9 個，劉潔薇等［5］應用SSH 技術(shù)，成功構(gòu)建了人大細胞肺癌高低轉(zhuǎn)移細胞株差異基因文庫，篩選出與腫瘤相關(guān)基因6 個，其中5 個與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。既往對于腫瘤差異表達基因的篩選，多是從腫瘤組織、正常組織或腫瘤組織、瘤旁組織、正常組織之間篩選，因腫瘤組織與瘤旁組織或正常組織之間在基因水平上差異很大，且差異基因很難說明腫瘤發(fā)展的時序性。因此，我們選擇食管癌組織、癌化區(qū)域與正常食管黏膜組織，進行抑制性消減雜交，篩選差異基因，癌化區(qū)域是比不典型增生更早的癌前病變，通過癌化區(qū)域與正常食管黏膜組織、食管癌組織差異基因的研究，能從中找出真正的食管癌早期基因，或在食管癌發(fā)生、發(fā)展中有重要作用、更具代表性的基因。

通過Real-Time PCR 法檢測CRNN 在食管鱗癌組織、癌化區(qū)域組織及正常食管黏膜組織中的表達。Real-Time PCR 檢測CRNN mRNA 的表達，從mRNA 水平進行驗證。該方法檢測結(jié)果所顯示的表達趨勢是，CRNN基因在食管鱗癌組織和正常食管黏膜組織中的表達具有差異性，在癌化區(qū)域組織與正常食管黏膜組織中表達具有差異性，而且CRNN 基因在正常食管黏膜、癌化區(qū)域組織及食管鱗癌組織中的表達依次降低，這與抑制消減雜交結(jié)果是一致的。同時也驗證了區(qū)域癌化理論，而我們所篩選的差異表達基因可作為食管鱗癌早期基因備選基因進行后續(xù)研究。

CRNN 位于染色體1q21 區(qū)段，含有4 個外顯子，共編碼495 個氨基酸，CRNN 蛋白N 端含一個Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域及EF 手性結(jié)構(gòu)域，C 端含有兩個谷氨酰胺和蘇氨酸富含的60 個氨基酸的重復序列。CRNN 是表皮分化復合物基因家族的一個新成員，與表皮終末分化密切相關(guān)［6］，在頭頸部鱗癌［7］、口腔鱗癌［8］、宮頸鱗癌中低表達［9］，目前研究已證實，CRNN 與食管癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，在食管鱗癌中表達明顯下調(diào)，其表達與食管癌的分化程度呈正相關(guān)，在體外和體內(nèi)試驗的功能性研究表明，CRNN 在食管鱗癌細胞中有很強的腫瘤抑制能力。通過上調(diào)Rb 和P21 表達，將細胞周期阻滯在G1/S 從而起到抑制腫瘤的作用［10］。通過RNA 干擾沉默CRNN 表達可以達到有效地抑制腫瘤作用［10］。在食管黏膜抵抗病原微生物入侵、熱與酸性食物刺激以及上皮細胞分化的過程中發(fā)揮著重要作用。多因素分析表明，CRNN 的下調(diào)是食管鱗狀細胞癌的獨立預后因素［11］。

Li GM 等［12］通過實驗研究證實，CRNN 在人類正常鱗狀上皮高表達，在食管鱗癌中低表達，這與本研究結(jié)果是相吻合的。進一步研究發(fā)現(xiàn)S100 結(jié)構(gòu)域是CRNN 發(fā)揮功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，它可以通過多聚化更好地保護細胞，通過核磁共振、超速離心、凝膠過濾層析、質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)交聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)S100 結(jié)構(gòu)域具有鈣依賴的多聚性質(zhì)，而多聚體的形成更有利于保護細胞免受脫氧膽酸和乙醇的損傷，這也從微觀上證實了CRNN 是抵制環(huán)境壓力和保持組織完整性的應激蛋白之一。

駱愛萍等［6］通過cDNA 微陣列方法研究顯示CRNN在食管鱗癌中的表達明顯下調(diào)，通過對110 例食管鱗癌組織標本、配對的食管鱗狀上皮組織中CRNN 表達與食管鱗癌臨床、病理指標的相關(guān)性研究表明，CRNN表達與食管鱗癌的分化程度呈正相關(guān)，說明CRNN 可能與食管鱗癌細胞分化缺陷相關(guān)。通過對CRNN 啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子AP-1、HSF 及CEBP 的結(jié)合位點的研究，AP-1 家族成員：Fra1、c-Fos 及c-Jun，HSF 家族成員：HSF1 與HSF2，轉(zhuǎn)錄因子Fra1、c-Fos、c-Jun、HSF1、HSF2 及CEBP 的表達呈正相關(guān)，化療藥物致食管鱗癌細胞DNA 損傷因素可誘導CRNN 及轉(zhuǎn)錄因子Fra1、c-Fos、c-Jun 及CEBP 表達，而這些轉(zhuǎn)錄因子與細胞應激反應、細胞分化、增殖及DNA 損傷相關(guān)，表明CRNN與食管鱗癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。Chen K 等［13］利用cDNA 微陣列分析顯示，CRNN 在食管鱗癌組織中明顯下調(diào)，不論是mRNA 水平還是蛋白水平，且與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及總生存率相關(guān)。多變量分析結(jié)果表明CRNN 下調(diào)是食管鱗癌預后的獨立因素。通過對食管鱗癌細胞的研究，CRNN 主要是通過上調(diào)P21WAF1/CIP1 和Rb 的表達，將細胞周期阻滯G1/S 作用點而起到腫瘤抑制作用。進一步通過RNA 干擾沉默CRNN表達，能有效地抑制其腫瘤抑制作用。張薇等［14］通過對CRNN 基因遺傳多態(tài)性的研究，共發(fā)現(xiàn)SNP 位點6個，攜帶-1139CC 基因型者患食管鱗癌的風險明顯升高，表明CRNN 基因遺傳多態(tài)性與食管鱗癌發(fā)病發(fā)現(xiàn)相關(guān)。CRNN 在食管黏膜抵病原微生物入侵、各類外界刺激以及上皮分化的過程中發(fā)揮著重要的作用。

目前國際上已有研究證明在食管標本中，碘染色不著色但病理表現(xiàn)正常的黏膜組織仍存在DNA 水平的基因突變，提示這種組織是較不典型增生更早的食管鱗癌癌前病變。了解這種組織與真正食管正常上皮間在基因水平上的差別，無疑是發(fā)現(xiàn)食管鱗癌早期基因的一條捷徑。本研究通過SSH 技術(shù)成果構(gòu)建了食管鱗癌、癌化區(qū)域與正常食管黏膜的消減雜交cDNA 文庫。通過對差異基因和cDNA 片段進行篩選，選擇CRNN 對其進行mRNA 臨床驗證，通過實驗，完成了預期目標。然而，在食管鱗狀細胞癌早期基因生物學效應及功能的研究方面，仍有大量工作要做，在實驗完整性上還存在不足，將在后期工作中進一步深入研究。