杜文佳 晏麗 李延宏

1.蘭州大學第二醫(yī)院/甘肅省骨關(guān)節(jié)病重點實驗室，甘肅 蘭州730030；2.蘭州現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學院，甘肅 蘭州730000

下腰痛（low back pain，LBP）是世界范圍內(nèi)重要的醫(yī)學問題，給社會和患者造成了巨大的經(jīng)濟負擔［1］。據(jù)相關(guān)研究表明，超過80%的成年人在生命中的某個階段會遭受LBP［2］。其中，約10%的腰痛患者會發(fā)展為慢性殘疾［3］。LBP 的病因是多方面的，包括遺傳原因，生活方式和老化［4-7］。盡管LBP 的病因很復雜，但椎間盤退變（intervertebral disc deqeneration，IDD）被認為是主要原因［8］。正常椎間盤（IVD）是由髓核（NP）、纖維環(huán)（AF）和軟骨終板（CEP）組成的無血管纖維軟骨墊［9］。NP 組織通過產(chǎn)生細胞外基質(zhì)（ECM）在維持IVD 完整性方面發(fā)揮重要作用。越來越多的研究表明，異常的NP 細胞功能在IDD 的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用［10，11］?，F(xiàn)有證據(jù)表明，IDD 的發(fā)生與多種因素相關(guān)，包括身體損傷、遺傳易感性、微環(huán)境變化和炎癥［12，13］。目前對于IDD 的治療主要側(cè)重于藥物治療和手術(shù)，暫時緩解疼痛癥狀。然而，這些治療并沒有完全解決IDD［14］。因此，應從分子層面開展針對IDD 的分子靶向治療，從根本上預防IDD或恢復IVD 功能［15］。既往研究表明，許多編碼基因在IDD 中存在差異表達，其中一些已被證明在IDD中起重要作用［16］。

作為基因表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，miRNA 是一種內(nèi)源性基因編碼的小型非編碼RNA，通過與靶mRNA 分子的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）結(jié)合來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后的表達［17］。通常，初級miRNA 在細胞核中產(chǎn)生，并通過Dicer 酶在細胞質(zhì)中進一步加工為成熟的miRNA。在摻入RNA 誘導的沉默復合物（RISC）后，它們可以靶向抑制多個mRNA 的翻譯，從而調(diào)節(jié)大約30%的人類蛋白質(zhì)編碼基因和多個細胞內(nèi)過程，包括細胞增殖、凋亡和細胞因子釋放［18］。此外，已知miRNA 與其他內(nèi)源性RNA（如長鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA 和mRNA）相互作用，在體外診斷細胞中形成廣泛的基因調(diào)控網(wǎng)絡［19］。這激發(fā)了人們對miRNA 在IDD 中的作用以及作為新型生物標志物和治療劑的潛力的興趣。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，如今基因芯片技術(shù)和生物信息學方法已被廣泛用于鑒定疾病潛在的生物學標志物。本研究使用生物信息學方法分析IDD 相關(guān)的高通量基因芯片（GSE56081 和GSE116726），以鑒定差異表達基因（DEGs）和差異表達miRNA（DE-miRNAs），并分析了與椎間盤退變相關(guān)的通路。

1 材料和方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)的獲取 原始數(shù)據(jù)集GSE56081 和GSE116726 從GEO（Gene Expression Omnibus，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）數(shù)據(jù)庫下載。GSE56081 數(shù)據(jù)集基于Agilent 基因芯片GPL15314 平臺（Agilent033010 Probe Name version），總共包括10 個樣本，5 個來自IDD患者的髓核（NP）樣本和5 個來自正常的NP 樣本，GSE116726 數(shù)據(jù)集基于Agilent 基因芯片GPL20712平臺（Agilent-070156 Human miRNA［miRNA version］），總共包括6 個樣本，3 個來自IDD 患者的髓核（NP）樣本和3 個來自正常的NP 樣本。

1.2 數(shù)據(jù)預處理和鑒別DEGs 使用R 軟件的limma包對芯片數(shù)據(jù)進行差異表達分析，limma 包是一個非常流行的統(tǒng)計計算和統(tǒng)計映射工具［20］。分別從GSE 56081 和GSE116726 芯片數(shù)據(jù)中提取了mRNA 數(shù)據(jù)和miRNA 數(shù)據(jù)，并對它們進行基因注釋。然后使用Limma 數(shù)據(jù)包進行DEGs 和DE-miRNAs 的表達分析。差異表達的篩選標準為：P＜0.05，|log fold-change|＞2。

1.3 功能富集分析 為了識別DEGs 中的生物學功能并了解基因的重要性，通過GO 分析進行驗證，其中包括以下類別：BP_Fat（生物學過程）；CC_Fat（細胞成分）；和MF_Fat（分子功能）。KEGG（The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes；http：//www.genome.jp/kegg）數(shù)據(jù)庫是由基因組，酶促途徑和生物化學組成的在線數(shù)據(jù)庫的集合［21］。WebGestalt（WEB-based Gene SeT Ana-Lysis Toolkit，http：//www.webgestalt.org）是一款基于網(wǎng)絡的功能豐富的分析工具，分析結(jié)果支持12 種生物和來自各種數(shù)據(jù)庫和技術(shù)平臺的324 個基因標識符以及來自公共數(shù)據(jù)庫的150937 個功能類別［22］。并采用WebGestalt 對上調(diào)DEGs 和下調(diào)DEGs 分別進行GO分析。KOBAS3.0（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3）是一款用于基因/蛋白質(zhì)功能注釋和基因集富集的網(wǎng)頁分析工具，分析結(jié)果提供了5944 種物種的KEGG 途徑信息以及71 種物種的基因GO 注釋［23］。本研究利用KOBAS3.0 對上調(diào)DEGs 和下調(diào)DEGs 進行KEGG分析。P＜0.05 被認為篩選的GO 術(shù)語和KEGG 途徑具有統(tǒng)計學差異。

1.4 構(gòu)建miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡 miRTarBase是一個經(jīng)過實驗驗證的miRNA-靶標相互作用數(shù)據(jù)庫［24］。本研究分別將上調(diào)和下調(diào)的DE-miRNAs 通過查詢miRTarBase 數(shù)據(jù)庫，獲取置信度相對可靠的靶基因。隨后將上調(diào)DE-miRNAs 的靶基因與下調(diào)的DEGs取交集，下調(diào)DE-miRNAs 的靶基因與上調(diào)的DEGs 取交集，分別構(gòu)建出miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡，并且由Cytoscape 軟件進行可視化處理（版本3.2.0）［25］。

2 結(jié)果

2.1 篩選出DEGs 在GSE56081 的椎間盤樣本中總共鑒定了523 個DEGs，其中存在3 上調(diào)DEGs74 個，下調(diào)DEGs149 個（見圖1A-1B）。熱圖中，紅色代表上調(diào)的基因，藍色代表下調(diào)的基因；火山圖中紅色代表上調(diào)基因，藍色代表下調(diào)基因。

2.2 GO 富集分析 為了了解變性和非變性椎間盤樣本中DEGs 的生物學作用，對上調(diào)和下調(diào)的DEGs 分別進行了GO 富集分析。上調(diào)和下調(diào)的DEGs 涉及的生物進程均包括生物調(diào)節(jié)、代謝過程、對刺激的反應、多細胞生物過程、細胞通訊、定位等。上調(diào)和下調(diào)的DEGs 分子功能均參與蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、核酸結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、水解酶活性、結(jié)構(gòu)分子活性等（見圖1C）。上調(diào)和下調(diào)的DEGs 細胞成分（CC）均涉及細胞膜、細胞核、內(nèi)膜系統(tǒng)、含蛋白質(zhì)復合物、細胞外基質(zhì)、細胞投射、細胞骨架等（見圖1D）。

圖1 GSE56081 椎間盤樣本中鑒定DEGs 和GO 富集分析上調(diào)和下調(diào)的DEGs

2.3 KEGG 富集分析 通過KOBAS3.0 軟件系統(tǒng)對KEGG 通路分析后，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)DEGs 參與的信號通路包括人T 細胞白血病病毒1 型感染、松弛素信號通路、瘧疾、代謝途徑、TGF-β 信號通路、人乳頭瘤病毒感染、泛素介導的蛋白質(zhì)水解、雌激素信號通路等通路；下調(diào)DEGs 的KEGG 途徑：包括蛋白質(zhì)消化吸收、阿米巴病、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號轉(zhuǎn)導、類風濕性關(guān)節(jié)炎、IL-17 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、NOD 樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用等通路。

2.4 篩選出DE-miRNAs 對GSE116726 的椎間盤髓核樣本中的DE-miRNAs 進行鑒定，從GSE116726 的椎間盤髓核樣本中共鑒定出858 個DE-miRNAs，其中上調(diào)的DE-miRNAs 有362 個，下調(diào)的DE-miRNAs 有496 個。

2.5 構(gòu)建miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系 DE-miRNAs 通過miRTarBase 數(shù)據(jù)庫預測了靶基因，通過韋恩圖將靶基因與DEGs 取交集。與上調(diào)miRNA 的靶基因有交集的DEGs 共11 個，與下調(diào)miRNA 的靶基因有交集的DEGs 共有12 個。通過Cytoscape 軟件可視化后，本研究分別得到了上調(diào)DE-miRNAs 與下調(diào)DEGs 和下調(diào)DE-miRNAs 與上調(diào)DEGs 組成的miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系（見圖2）。

圖2 miRTarBase 數(shù)據(jù)庫預測了靶基因與DEGs 取交集

3 討論

椎間盤位于椎骨之間，由髓核、纖維環(huán)和軟骨終板組成。因其獨特的解剖結(jié)構(gòu)、力學特性和有限的血液供應，在生活習慣、職業(yè)和外傷的影響下，椎間盤易發(fā)生變性［26-28］。隨著椎間盤的退變，許多脊柱退行性疾?。i椎病、腰椎間盤突出癥、腰椎滑脫、腰椎管狹窄）亦隨之而來［29-31］。目前，機械應力，年齡，創(chuàng)傷和遺傳因素被普遍認為是導致IDD 的重要原因［32-33］。

盡管目前對椎間盤退變的發(fā)病機制和病因尚不十分清楚，但隨著科學技術(shù)不斷進步和基因組學研究技術(shù)的成熟，生物信息學方法的出現(xiàn)將加速了人類疾病機理的研究進展，并極大地促進疾病發(fā)病機制研究的突破［34-35］。本研究通過對變性椎間盤樣本和對照樣本之間的基因芯片進行比較分析，分別確定了374 個上調(diào)DEGs 和149 個下調(diào)DEGs；362 個上調(diào)DE-miRNAs和496 個下調(diào)DE-miRNAs，確定了4 條信號通路，并且鑒定出32 對miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系。

根據(jù)GO 分析結(jié)果，上調(diào)和下調(diào)的DEGs 主要集中在生物調(diào)節(jié)、代謝過程、刺激反應、多細胞生物過程等生物學過程中。而KEGG 富集顯示，上調(diào)DEGs 與IDD可能相關(guān)的通路包括TNF 信號通路、TGF-β 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、雌激素信號通路等。而下調(diào)的DEGs 的KEGG 富集結(jié)果表明，下調(diào)的DEGS 與IDD 可能相關(guān)的途徑包括IL-17信號通路、AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路、NFkappa B 信號通路等。眾所周知，細胞外基質(zhì)（ECM）降解是椎間盤退變的重要特征之一。TNF 信號通路已在許多情況下顯示出可以引起ECM 變性的改變。有研究表明，TNF-α 可抑制多種膠原蛋白類型（聚集蛋白聚糖，纖維調(diào)節(jié)蛋白）從而改變了椎間盤的生物力學，最終導致IDD 的發(fā)生［36-37］。TGF-β 信號通路在IDD 過程中起著重要作用。抑制ECM 降解和增加ECM 合成可以激活TGF-β 信號通路，進而促進細胞增殖和抑制細胞死亡以及減輕炎癥反應，對椎間盤具有保護作用。但是，TGF-β 信號轉(zhuǎn)導的過度激活亦可能會導致IDD 的發(fā)生［38］。雌激素信號通路在椎間盤退變過程中有著重要意義。雌激素信號傳導途徑遍布人體組織，并參與許多病理過程。相關(guān)研究表明，17-β-雌二醇可以通過激活雌激素β 受體來促進纖維環(huán)細胞的增殖［39］。隨著年齡的增長，雌激素的分泌將逐漸減少，這會導致雌激素信號通路的激活，隨之炎癥因子的表達和基質(zhì)的降解增加，從而加速IDD 的進程［40］。PI3K-Akt 信號通路可能對人髓核具有保護作用［19］。PI3K-Akt 途徑的激活，可通過增加ECM 含量減少細胞凋亡和自噬來預防IDD。已有的研究表明，激活PI3K-Akt 途徑可以抑制IL-1β 介導的NP 細胞凋亡從而抑制IDD 的發(fā)生［41-42］。

本研究一共鑒別出了32 對miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系。在下調(diào)miRNA 和上調(diào)mRNA 的調(diào)控關(guān)系中，HMBOX1 受到hsa-miR-93-5p 和hsa-miR-373-3p 調(diào)控，而hsa-miR-93-5p 同時調(diào)控ANKN 和LZIC，hsamiR-373-3p 同時調(diào)控KREMEN1 和CCND2。在上調(diào)miRNA 和下調(diào)mRNA 的調(diào)控關(guān)系中，LOCR 同時受hsa-miR-107，hsa-miR-196b-5p，hsa-miR-27b-3p，hsa-miR-30b-5p 和hsa-miR-30c-5p 五個miRNA 調(diào)控，值得進一步深入研究，LOCR 目前報道主要與勞氏眼腦腎綜合征有關(guān)［43］；ATG9A 同時受hsa-miR-15a-5p 和hsa-miR-497-5p 調(diào)控；SBNO1 和SYNJ1 同時受hsa-miR-15b-5p 調(diào)控。構(gòu)成miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系的miRNA 和mRNA 多報道與癌癥進程有關(guān)，鮮有報道與IDD 有關(guān)，這或許為研究IDD 提供了新的思路和研究方向。

綜上所述，本研究通過生物信息學方法對IDD 相關(guān)通路和基因進行分析，鑒別了523 個DEGs 和858個人DE-miRNAs。對DEGs 進行GO 和KEGG 的富集分析，進一步發(fā)現(xiàn)細胞外基質(zhì)，TNF 信號通路，TGF-β 信號通路，雌激素信號通路和PI3K-Akt 信號通路在IDD過程中起了重要作用。此外，還構(gòu)建了32 對miRNAmRNA 調(diào)控關(guān)系，其潛在的機制值得我們進一步研究?？傊?，本研究鑒別了IDD 相關(guān)的信號通路和可信的miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系，為后續(xù)的研究提供了新的理論基礎(chǔ)和方向。