叢碧橋 劉曉萍 陳嘉雯 李洪利 范欣,
1.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔科,濰坊 261000;2.濰坊醫(yī)學院口腔醫(yī)學院,濰坊 261053;3.濰坊醫(yī)學院醫(yī)學研究實驗中心,濰坊261053
口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcino‐ma,OSCC)可發(fā)生于舌前2/3、牙齦、硬腭、口底、嘴唇、頰黏膜等[1]。盡管采用多學科聯(lián)合診療可以改善患者的預后[2],但OSCC 患者的5 年生存率仍不理想,25%~50%OSCC 患者可能會發(fā)生局部復發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。2020 年有45 萬人因頭頸部鱗狀細胞癌而死亡,OSCC 占其中主要構(gòu)成[4]。因此,深入研究OSCC 的分子機制,發(fā)現(xiàn)新的治療靶點,可以為該疾病的治療帶來新的思路。
微小RNA(miRNA)是一類短的,不具有編碼能力的RNA[5],可以與靶向基因的3’-非翻譯區(qū)中的互補位點進行結(jié)合,誘導轉(zhuǎn)錄本的降解或翻譯抑制[6],在OSCC 的異常表達中起重要作用[7],其失調(diào)可通過調(diào)節(jié)相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導途徑來影響腫瘤的進展[8]。已有研究發(fā)現(xiàn),多種miRNA在OSCC中發(fā)揮作用,miR-663b 在子宮內(nèi)膜癌[9]、鼻咽癌[10]中發(fā)揮作用,但尚未有探討miR-663b 在OSCC 中的作用。
本研究通過生物信息學方法篩選OSCC相關(guān)的預后生物標志物,選擇上調(diào)的差異表達基因miR-663b 作為研究對象,并預測其靶基因為SH3BP2。探討miR-663b是否可以通過靶向SH3BP2影響OS‐CC 的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mes‐enchymal transition,EMT),為OSCC 的診療提供新的靶點。
1.1.1 獲取組織標本 收集2021 年1—12 月于濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院行手術(shù)切除且資料完整的患者24例,每位患者術(shù)前未接受放、化療,切取獲得的病理標本診斷均為OSCC。參與研究的患者男性13例,女性11例,年齡5~85歲,中位年齡62歲,獲取的新鮮組織標本立即放入?150 ℃冰箱保存?;颊呋蚱浼覍俸炇鹬橥鈺緦嶒炓勋@得醫(yī)院倫理委員會的批準。
1.1.2 其他材料獲取 人正??谇簧掀ぜ毎℉OEC 細胞株)(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院),HEK293T(美國典型培養(yǎng)物保藏中心),OSCC 細胞CAL27、HN30 和SCC-9(上海市口腔頜面部腫瘤組織樣本及生物信息數(shù)據(jù)庫專業(yè)技術(shù)服務平臺)。miR-663b 莖環(huán)結(jié)構(gòu)(上海生物工程有限公司),兔抗人SH3BP2 單克隆抗體、小鼠抗人β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體、上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)抗體(Abcam 公司,英國),pGL3-SH3BP2 3’UTR-WT(野生型)和pGL3-SH3BP2 3’UTR-MUT(突變型)雙熒光素酶報告基因載體、miR-663b 敲除質(zhì)粒(Anti-miR-663b)以及陰性對照質(zhì)粒Anti-NC(上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司),熒光素酶報告基因載體(普洛麥格公司,美國)。
使用基因表達數(shù)據(jù)庫(gene expression omni‐bus,GEO)中OSCC miRNA(GSE28100 和GSE-45238)與mRNA 表達數(shù)據(jù)集(GSE78060 和GSE-13601),使用R Studio 進行差異表達分析,以P<0.05且|logFC|>1作為篩選閾值。
MiRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和microRNA目標預測數(shù)據(jù)庫(microRNA Target Prediction Database,miRDB)預測與miR-663b存在互補序列的靶基因。人類蛋白質(zhì)表達圖譜(the human protein atlas,HPA)采用高度特異性的抗體,用免疫組化技術(shù)進行差異表達分析,為研究提供新的思路和幫助,查找SH3BP2 在OSCC 組織和正常組織中的表達情況?;虮磉_譜分析(gene expression profilling interactive analysis,GE‐PIA)在線網(wǎng)站下載SH3BP2 頭頸部鱗狀細胞癌患者生存曲線。
HN30、CAL27、SCC-9 均使用RPMI 1640 培養(yǎng)基,HOEC、HEK293T 細胞使用DMEM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),培養(yǎng)箱環(huán)境:5%CO2、37 ℃以及97%的濕度,2~3 d及時換液傳代。使用Lipo‐fectamine2000 進行轉(zhuǎn)染操作。將轉(zhuǎn)染后細胞進行分組:1)Anti-NC/HN30 組:轉(zhuǎn)入miR-663b 的對照質(zhì)粒;2)Anti-miR-663b/HN30 組:轉(zhuǎn)入miR-663b 的敲除質(zhì)粒;3)Anti-NC+Scr/HN30 組:轉(zhuǎn)入miR-663b 的對照質(zhì)粒和SH3BP2 空載對照質(zhì)粒;4)Anti-NC+SiSH3BP2/HN30 組:轉(zhuǎn)入miR-663b的對照質(zhì)粒和SH3BP2 敲低質(zhì)粒;5)Anti-miR-663b+SiSH3BP2/HN30 組:轉(zhuǎn)入miR-663b 的敲除質(zhì)粒和SH3BP2敲低質(zhì)粒。
細胞培育良好后,使用Trizol試劑從細胞中提取總RNA,合成cDNA 并稀釋,以cDNA 為模板進行qRT-PCR。miR-663b上游引物序列:5’-GGTGGCCCGGCCGTGC-3’,下游引物序列:5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’;莖環(huán)結(jié)構(gòu):GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCTCAG;采用U6 作為內(nèi)參,采用2?ΔΔCt分析的方法進行分析。每組實驗均重復3次。
遷移實驗:取含有4×104個細胞的懸液200 μL,小室不含Matrigel 基質(zhì)膠,將懸液添加到上室中,下室加入500 μL 胎牛血清。侵襲實驗:取含有4×104個細胞的懸液200 μL,小室添加Matrigel 基質(zhì)膠,將細胞懸液添加到上室中,下室加入500 μL胎牛血清。培養(yǎng)24 h,甲醇固定20 min,PBS清洗干凈后染色35 min,清洗晾干后,光學顯微鏡下隨機選取3個良好視野拍照,計數(shù)穿過小室細胞的平均值為結(jié)果。所有實驗均獨立重復3次。
分別將Anti-NC/HN30組和Anti-miR-663b/HN-30 組提取總蛋白質(zhì),檢測蛋白質(zhì)濃度,上樣后凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉1 h,4 ℃一抗過夜,洗膜,二抗常溫孵育1 h,洗膜,膠片曝光,分析灰度值??贵w配制如下:β-actin(1∶1 000)、SH-3BP2(1∶500)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cad‐herin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)。每組實驗均重復3次。
293T接種到24孔板,將miR-663b敲除質(zhì)粒及其對照分別與SH3BP2 的3’UTR 野生型(pGL3-SH3BP2 3’UTR-WT)和突變型(pGL3-SH3BP2 3’UTR-MUT)共轉(zhuǎn)染入細胞,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h,棄上清后PBS 清洗,加PLB 裂解15 min;收集裂解液,并與空載對照比較熒光素酶活性。每組實驗均重復3次。
所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進行分析,符合正態(tài)分布的計量資料使用均數(shù)±標準差表示。獨立樣本t檢驗進行兩組間均數(shù)比較;單因素方差分析用于多組間比較,所有實驗均相同條件重復3 次,P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。
在GSE28100 和GSE45238 數(shù)據(jù)集中,以P<0.05,|logFC|>1 作為篩選閾值,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSE-28100中有113個表達上調(diào)的miRNA,36個表達下調(diào)的miRNA;GSE45238 中有29 個表達上調(diào)的miRNA,51 個表達下調(diào)的miRNA,熱圖顯示部分差異表達miRNAs(圖1A)。在GSE28100 和GSE-45238 數(shù)據(jù)集上調(diào)的miRNAs 中有17 個交集miR‐NAs(圖1B),除miR-663b 及miR-33a 未有研究,其余均已有研究,選擇差異表達倍數(shù)更高的miR-663b 作為后續(xù)研究。通過對GSE28100 和GSE-45238 數(shù)據(jù)集分析后發(fā)現(xiàn),miR-663b 在OSCC 組織中的表達升高(P<0.05)(圖1C)。
圖1 GSE28100和GSE45238差異表達分析Fig 1 Differential expression analysis of GSE28100 and GSE45238
通過qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn),與癌旁正常組織比較,OSCC 組織中miR-663b 的表達升高(P<0.05)(圖2)。
圖2 miR-663b在OSCC組織和癌旁正常組織中的表達Fig 2 The expression of miR-663b in OSCC tissues and adja‐cent normal tissues
使用qRT-PCR 檢測miR-663b 在HN30、CAL-27、SCC-9 和HOEC 細胞中表達情況。結(jié)果顯示miR-663b在OSCC 細胞CAL-27、HN30、SCC-9中表達高于人HOEC 細胞,其中HN30表達最高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3A),因此選用HN30 作為后續(xù)研究。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后,qRT-PCR 實驗檢測HN30 中miR-663b 的表達水平。結(jié)果顯示,Anti-miR-663b/HN30 組中的miR-663b 表達明顯降低,Anti-NC/HN30 組的表達較高,2 組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3B),表明轉(zhuǎn)染成功。Transwell 遷移實驗結(jié)果顯示Anti-NC/HN30 組中穿過基底膜的細胞數(shù)量明顯多于Anti-miR-663b/HN30 組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3C)。Transwell 侵襲實驗檢測結(jié)果顯示Anti-NC/HN30 組中穿過基底膜的細胞數(shù)量多于Anti-miR-663b/HN30 組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3D)。以上實驗結(jié)果表明,當miR-663b 的表達降低時,OSCC細胞HN30的遷移和侵襲能力受到抑制。
圖3 qRT-PCR檢測miR-663b表達和Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染后HN30細胞的遷移和侵襲能力Fig 3 qRT-PCR detection of miR-663b expression and Transwell experiment to detect the migration and invasion ability of HN30 cells after transfection
采用Western blot實驗檢測Anti-NC/HN30組和Anti-miR-663b/HN30 組中E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin的蛋白質(zhì)表達水平。結(jié)果顯示與Anti-NC/HN30 組相比,Anti-miR-663b/HN30 組中相關(guān)標志物E-cadherin 表達上調(diào),而N-cadherin 和Vimentin的表達下調(diào)(P<0.05)(圖4)。結(jié)果表明,敲除miR-663b可抑制OSCC細胞HN30的EMT發(fā)生。
圖4 轉(zhuǎn)染miR-663b敲除質(zhì)粒后抑制OSCC細胞HN30的EMT發(fā)生Fig 4 Inhibition of EMT of OSCC HN30 after transfection of miR-663b interference plasmid
利用miRNA 靶基因預測網(wǎng)站(miRWalk 和miRDB)預測與miR-663b存在互補序列的靶基因分別為15 023個和333個。GSE78060和GSE13601兩個數(shù)據(jù)集中以P<0.05,|logFC|>1作為篩選閾值,下調(diào)差異表達miRNAs分別為1 710個和741個,在4組數(shù)據(jù)中取交集,SH3BP2既具有與miR-663b結(jié)合靶點又在OSCC中表達下調(diào)(圖5A)。GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示相較于低表達SH3BP2 的頭頸部鱗狀細胞癌患者,高表達SH3BP2 的頭頸部鱗狀細胞癌患者預后更好(圖5B)。觀察熒光素酶活性,miR-663b敲除質(zhì)粒與pGL3-SH3BP2 3’-UTR-WT共轉(zhuǎn)染后活性降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5C),miR-663b 與SH3BP2 靶向結(jié) 合。Western blot 結(jié)果顯示,SH3BP2在Anti-miR-663b/HN30組中的表達高于在Anti-NC/HN30 組中的表達(P<0.05)(圖5D),表明miR-663b可以影響SH3BP2的表達。利用Western blot 實驗檢測OSCC 組織和癌旁正常組織中的SH3BP2的表達情況,結(jié)果顯示,SH3BP2在正常組織中表達高于癌癥組織(P<0.05)(圖5E)。綜上所述,miR-663b與SH3BP2存在靶向結(jié)合關(guān)系。
圖5 SH3BP2是miR-663b的靶點Fig 5 SH3BP2 is the target of miR-663b
檢測Anti-NC+Scr/HN30、Anti-NC+SiSH3BP2/HN30和Anti-miR-663b+SiSH3BP2/HN30組中E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin 的蛋白質(zhì)表達水平。結(jié)果顯示與Anti-NC+Scr/HN30組和Anti-miR-663b+SiSH3BP2/HN30 相比,Anti-NC+SiSH3BP2/HN30組中E-cadherin 表達下調(diào),而N-cadherin 和Vimen‐tin的表達上調(diào)(圖6)。結(jié)果表明,miR-663-b可以靶向SH3BP2影響OSCC細胞HN30的EMT發(fā)生。
圖6 敲除miR-663b可以靶向SH3BP2抑制OSCC細胞HN30的EMT發(fā)生Fig 6 knockout of miR-663b can inhibit EMT of HN30 in OSCC by targeting SH3BP2
OSCC是頭頸部鱗狀細胞癌的主要類型,是一種轉(zhuǎn)移后生存率較低的惡性腫瘤[11]。為尋找新而有效的治療方法,本文通過差異表達分析等生物信息學方法展開研究,具有樣本數(shù)據(jù)量大、臨床和預后信息全面等優(yōu)點,本文還將生信與基礎(chǔ)實驗相結(jié)合,通過實驗驗證增加靶點可信度。
miRNA與靶向基因的3’-非翻譯區(qū)中的互補位點結(jié)合,從而發(fā)揮作用。Wang 等[10]研究發(fā)現(xiàn),miR-663b 通過直接靶向鼻咽癌中的SMAD 家庭成員7(SMAD family member 7,SMAD7)促進細胞增殖和上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,Shu 等[12]驗證,敲低miR-663b 可以通過調(diào)節(jié)腫瘤蛋白p73 的表達抑制骨肉瘤的細胞增殖并促進其凋亡。Du 等[13]發(fā)現(xiàn)血漿中的miR-497 和miR-663b 水平可能是膀胱癌的新生物標志物。本研究對miR-663b 在OSCC 中發(fā)揮的作用進行探討。通過microRNA 分析網(wǎng)站分析并檢測miR-663b 在OSCC 組織中的表達并選為目的基因,通過qRT-PCR實驗驗證,miR-663b在OSCC 細胞HN30 中表達較高(P<0.05),Transwell 實驗證實,轉(zhuǎn)染miR-663b 敲除質(zhì)粒可抑制OSCC 細胞HN30的遷移及侵襲能力,表明miR-663b在OS‐CC的遷移和侵襲中發(fā)揮作用。
EMT 是一種復雜且可逆的生物學過程,可以使上皮細胞變成間充質(zhì)細胞狀態(tài)的細胞,在腫瘤進展中的重要性已經(jīng)被證實[14]。E-cadherin 表達降低的同時,往往伴隨N-cadherin表達升高,即“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)化”,EMT 主要通過影響E-cadherin 介導的細胞間黏附和信號傳導的信號通路進行調(diào)控,E-cadherin 表達降低可抑制EMT[15-16]。在本研究中通過Western blot 實驗證明轉(zhuǎn)染miR-663b 敲除質(zhì)粒可使E-cadherin 表達上調(diào),而N-cadherin 和Vimen‐tin 的表達下調(diào),表明敲除miR-663b 可抑制OSCC細胞HN30的EMT發(fā)生。
SH3BP2 是一種信號轉(zhuǎn)導蛋白,主要在免疫細胞(包括T 細胞、B 細胞、巨噬細胞及破骨細胞)中表達[17],與多種疾病密切相關(guān),Kawahara 等[18]發(fā)現(xiàn)SH3BP2缺乏可改善小鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡,可為自身免疫性疾病的治療提供新的方法。SH3BP2與腫瘤的發(fā)展也有一定關(guān)系,Lin 等[19]證實敲低SH3BP2 可以促進小鼠腫瘤的形成。SH3BP2 與牙周病的發(fā)展有一定關(guān)系,Kittaka 等[20]發(fā)現(xiàn)SH3BP2是一種新型的牙周炎牙槽骨吸收調(diào)節(jié)劑。本研究發(fā)現(xiàn)miR-663b 在OSCC 中發(fā)揮原癌基因的作用與SH3BP2 有關(guān)。通過基因預測網(wǎng)站及基因芯片篩選出可以靶向miR-663b 并且在OSCC 中表達下調(diào)的SH3BP2,生存分析結(jié)果顯示,高表達SH3BP2 的頭頸部鱗狀細胞癌患者預后較好,雙熒光素酶實驗驗證miR-663b 與SH3BP2 存在靶向結(jié)合關(guān)系,Western blot 實驗則驗證了敲除miR-663b 可以靶向SH3BP2抑制OSCC細胞HN30的EMT發(fā)生。
綜上所述,miR-663b 在OSCC 組織呈高表達,敲除miR-663b會上調(diào)SH3BP2的表達并導致OSCC細胞遷移、侵襲和EMT的降低,在以后的發(fā)展中,為抑制OSCC侵襲和轉(zhuǎn)移,提供新的理論支持。
利益沖突聲明:作者聲明本文無利益沖突。