◎ 陳榮珍，農(nóng)真真，秦慶芳，武 源，林 華，劉永逸

（柳州市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究中心，廣西 柳州 545006）

近年來，柳州螺螄粉以其獨(dú)特的酸、辣、鮮、爽和燙的風(fēng)味，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，一度成為網(wǎng)紅食品[1]。柳州螺螄粉的湯料由螺螄、豬骨、雞骨及香辛調(diào)味料加水熬制而成，濃郁爽口、風(fēng)味獨(dú)特。柳州螺螄粉獨(dú)特的風(fēng)味來源除了濃郁的酸筍風(fēng)味，還有其湯料中特殊的呈鮮味氨基酸成分[2-3]。目前未見有關(guān)于柳州螺螄粉湯料中氨基酸檢測的研究報(bào)道。故此，測定其氨基酸含量，對分析螺螄粉鮮味來源具有重要意義。

氨基酸的分析方法主要有茚三酮衍生紫外分光光度法[4]、氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、離子色譜法[7]、毛細(xì)管電泳檢測紫外測定法[8]、衍生-電位傳感法[9]、氨基酸自動分析儀法[10-12]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 等[13-14]。氨基酸自動分析儀法操作簡單方便，測定結(jié)果準(zhǔn)確，是迄今氨基酸定性、定量分析中應(yīng)用最廣泛的方法之一。本研究建立了氨基酸自動分析儀測定柳州螺螄粉湯料中天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的分析方法，為探討其鮮味來源及營養(yǎng)價(jià)值提供參考，為柳州螺螄粉特異性鮮味物質(zhì)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

AMINO A300型全自動氨基酸分析儀（德國曼默博爾公司）；XP26型微量電子分析天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]；明澈-D24UV實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)[西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]；TTL-DCⅢ型氮吹儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑及標(biāo)準(zhǔn)溶液

天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸 （純度100%）和谷氨酸（純度99.5%）（中國食品藥品檢定研究院）；鹽酸（西隴科學(xué)股份有限公司）；苯酚（廣東光華科技股份有限公司）；三水乙酸鈉（西隴科學(xué)股份有限公司）；無水乙醇（湖南匯虹試劑有限公司）；甲酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；乙酸（廣東光華科技股份有限公司）；三氟乙酸（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；氫氧化鈉（西隴科學(xué)股份有限公司）；硼酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（西隴科學(xué)股份有限公司）；茚三酮衍生試劑R（德國曼默博爾公司）；茚三酮活化劑（德國曼默博爾公司）；反應(yīng)器清洗液W（德國曼默博爾公司）；自動進(jìn)樣器清洗液（德國曼默博爾 公司）。

1.3 樣品來源

樣品來源均為本實(shí)驗(yàn)室自購樣品，取其中湯料包。

1.4 儀器條件

色譜柱：陽離子交換柱；柱溫：40 ℃；檢測波長：440 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流動相配制見表1；儀器進(jìn)樣程序見表2。

表1 流動相配制表

表2 分析程序表

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸適量，用水溶解并稀釋制成濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再精密量取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用水稀釋并配制成濃度約為1 μg·mL-1、2 μg·mL-1、6 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1和60 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.6 試樣溶液的制備

稱取0.5 g樣品置于玻璃水解管內(nèi)，加入10 mL 6 mol·L-1鹽酸溶液，隨后加入3滴苯酚。將水解管放入冷凍劑中，冷凍5 min后，進(jìn)行15 min氮吹，在氮吹狀態(tài)下封口。將已封口的水解管置于110 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中水解22 h，水解完成后取出，冷卻至室溫。將水解液用濾紙過濾至50 mL容量瓶內(nèi)，用純水少量多次沖洗水解管，將水洗液移入同一50 mL容量瓶內(nèi)，并用純水定容，振蕩混勻。準(zhǔn)確吸取1.0 mL濾液移入氮吹管內(nèi)，50 ℃氮吹至干，殘?jiān)? mL純水溶解，再次用50 ℃氮吹干，目的是除酸完全。準(zhǔn)確量取2.0 mL pH 2.2的檸檬酸鈉緩沖溶液進(jìn)行復(fù)溶，渦旋1 min，混勻后過0.22 μm濾膜，裝進(jìn)樣小瓶，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系及檢出限試驗(yàn)

按照“1.5”項(xiàng)下方法制備混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照“1.4”項(xiàng)下方法上機(jī)測定，以目標(biāo)物濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。依據(jù)《氨基酸分析儀》（JJG 1064—2011）檢定規(guī)程中檢測限的測定方法，測定檢出限和定量限，以各氨基酸組分2倍基線噪聲與峰高的比值計(jì)算檢出限，定量限為3倍檢出限，結(jié)果見表3。

由表3可知，天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸在0～60 μg·mL-1線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999；當(dāng)取樣量為0.5 g，稀釋體積為100 mL時(shí)，檢出限為0.001 6～0.008 0 mg·g-1，定量限為0.004 9～ 0.024 0 mg·g-1，表明該方法線性關(guān)系良好，靈敏度高。

表3 線性方程及檢出限、定量限表

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取濃度為6 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及處理好待測樣品編號為1的樣品溶液，各重復(fù)進(jìn)樣6次，按樣品程序分析條件測定，測定完成后將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液及處理好待測樣品編號為1的樣品溶液置于4 ℃冰箱避光保存，保存7 d后，再次以相同程序測定，比較第1 d及第7 d各氨基酸的響應(yīng)，結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表（n=6）

由表4可知，第7 d混合對照品溶液及樣品溶液的峰面積與第1 d的峰面積差異較小，表明在4 ℃冰箱避光條件下，氨基酸混合對照品溶液及樣品溶液的穩(wěn)定性較好。

2.1.3 回收率及精密度試驗(yàn)

取編號為1的樣品各0.5 g共6份，按表5分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按照“1.6”項(xiàng)下方法制備加標(biāo)回收試樣液，按照“1.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表5。

由表5可知，天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的加標(biāo)回收率為95.80%～104.5%， 精密度為0.16%～4.80%，符合GB/T 27417—2017方法回收率偏差要求，表明方法的精密度和準(zhǔn)確性 較好。

2.2 樣品測定及結(jié)果

稱取自購樣品30批次，按照“1.6”項(xiàng)下方法制備試樣液，按照“1.4”項(xiàng)下方法測定樣品中6種氨基酸含量，結(jié)果見表6。從表6可以看出，不同批次樣品均檢測出天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及谷氨酸，表明柳州螺螄粉湯料均含有天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及谷氨酸 6種呈鮮味氨基酸，是螺螄粉鮮味的主要來源。不同生產(chǎn)廠家不同批次的樣品氨基酸檢測結(jié)果差異明顯，但天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的含量和均大于1 mg·g-1，谷氨酸的含量除試樣17外均小于80 mg·g-1。為保持柳州螺螄粉的天然風(fēng)味及健康飲食需求，6種呈鮮味氨基酸含量檢測結(jié)果可為柳州螺螄粉湯料鮮味特異性指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)參考。

表5 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果表（n=6）

表6 樣品中各氨基酸測定結(jié)果表（單位：mg·g-1）（n=2）

3 結(jié)論與討論

3.1 流動相對分離度的影響

氨基酸分析儀是通過不同pH流動相對各種氨基酸進(jìn)行分離，通過氨基酸與茚三酮在一定溫度下反應(yīng)顯色，在440 nm處測定。當(dāng)流動相A的pH為2.78時(shí)，天冬氨酸（Asp）和蘇氨酸（Thr）的分離度為1.12，分離效果差。根據(jù)分析進(jìn)樣程序可知，天冬氨酸和蘇氨酸是在流動相A段出峰，故將流動相A的pH調(diào)高為2.93，天冬氨酸（Asp）和蘇氨酸（Thr）的分離度為1.52，分離效果較好。

3.2 樣品酸水解后除酸情況對保留時(shí)間的影響

以標(biāo)準(zhǔn)溶液各單標(biāo)保留時(shí)間定位，天冬氨酸保留時(shí)間為15.623 min，當(dāng)樣品水解后僅取樣液進(jìn)行一次氮吹，天冬氨酸保留時(shí)間為16.597 min。當(dāng)樣品水解后，取樣液進(jìn)行一次氮吹，用水復(fù)溶后進(jìn)行二次氮吹，再用2.0 mL pH 2.2檸檬酸鈉緩沖溶液復(fù)溶上機(jī)，天冬氨酸出峰時(shí)間為15.600 min。由于使用酸水解樣品，發(fā)現(xiàn)若樣品除酸不完全，天冬氨酸保留時(shí)間產(chǎn)生漂移，樣品天冬氨酸保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液不一致；但樣品水解后重復(fù)氮吹操作保證除酸完全，樣品天冬氨酸保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液一致。

3.3 結(jié)論

本研究建立了氨基酸自動分析儀測定柳州螺螄粉湯料中天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的分析方法，樣品處理操作簡單方便，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，檢出限、定量限、精密度、穩(wěn)定性及回收率均滿足分析的要求，適用于柳州螺螄粉湯料中6種氨基酸的同時(shí)測定，對柳州螺螄粉特異性鮮味物質(zhì)研究提供技術(shù)支持，對柳州螺螄粉營養(yǎng)物質(zhì)研究提供參考。