王倩，周改蓮，，郝二偉，黃盼，石運運

(廣西中醫(yī)藥大學1.藥學院；2.廣西中藥藥效研究重點實驗室；3.廣西農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530000)

黃精具有補氣養(yǎng)陰、潤肺、健脾、益腎的功效[1]。生黃精具麻味，對咽喉有刺激作用；黃精經(jīng)過蒸制之后，其補脾潤肺益腎功能增強，并可去除麻味。大量臨床觀察和現(xiàn)代研究表明蒸制黃精在補腎陰虛方面有較強的功效，腎陰虛疾病可以通過腸道為靶點來調(diào)節(jié)患者的腦腸肽水平，來達到治療便秘的效果[2]。那么腎陰虛是否可以使腸道內(nèi)的菌群失衡？給予黃精干預(yù)后腸道內(nèi)菌群是否有所改變？如有改變，黃精治療腎陰虛所涉及的代謝通路又是什么？基于以上問題，筆者開展了相關(guān)實驗研究。

1 材料與方法

1.1實驗試藥及動物 新鮮黃精，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥用植物教研室銀勝高副教授鑒定為滇黃精(PolygonatumkingianumColl. et Hems L.)的新鮮根莖。

cAMP試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：202006)、cGMP試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：202007)、Na+-K+-ATP酶試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：202007)、1，2-13C肉豆蔻酸(批號：MBBC6775，西格瑪生物技術(shù)有限公司)、甲氧胺鹽酸鹽(批號：BCBX0246，西格瑪生物技術(shù)有限公司)、吡啶(批號：SHBL8071，西格瑪生物技術(shù)有限公司)、BSTFA(1%TMCS)(批號：FN02011901，Sigma-Aldrich?)。

SPF級SD雄性大鼠(體質(zhì)量180～220 g)，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2019-0004。動物倫理審查編號：DW20200603-031，審查機構(gòu)：廣西中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理委員會。動物飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學SPF級動物房內(nèi)，環(huán)境溫度(24±1)℃，相對濕度70%～100%。實驗過程給予大鼠普通飼料，并自由飲用滅菌水，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。

1.2實驗設(shè)備 分析天平(北京賽多利斯天平有限公司，型號：Quintix224-1CN，感量：0.1 mg)，甩尾痛覺測試儀(美國IITC-上海玉研儀器公司，型號：33型)，全波長酶標儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，型號：Multiskan Sky]，氮吹儀(杭州瑞誠儀器有限公司，型號：ND100-1)，恒溫震蕩儀(上海一恒科學儀器有限公司，型號：DHG-9240A)。

1.3黃精炮制品的制備 取凈黃精，加入黃酒拌勻蒸透，燜潤后取出曬至六七成干，加蒸出液浸潤再蒸，重復操作幾次至黃精內(nèi)外均呈滋潤黑色，切厚片，干燥，即得黃精炮制品。

1.4黃精水提液的制備 取黃精炮制品 60 g，加純化水500 mL，煎煮50 min，倒出煎液，再加純化水500 mL，煎40 min，合并兩次煎液，濃縮至100 mL，得濃度為0.6 g·mL-1的藥液，用時將其稀釋成0.3 g·mL-1、0.15 g·mL-1。取生品黃精30 g，加純化水500 mL，同上蒸黃精提取步驟，合并濾液濃縮至200 mL得濃度為0.15 g·mL-1的藥液。以上所得藥液均置冰箱低溫保存。

1.5分組與給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，采用隨機數(shù)字表法進行分組，隨機分為(六味地黃丸組)陽性組、生藥組、對照組、模型組、炮制藥組(大、中、小三個劑量組)，共7組。每天上午除對照組給予0.9%氯化鈉溶液外，其他各組均灌胃甲狀腺片(上海長城藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：40 mg)混懸液[3]，每天下午對照組和模型組灌胃0.9%氯化鈉溶液，六味地黃丸組給予六味地黃丸混懸液，炮制組分別給予6.0，3.0，1.5 g·kg-1蒸黃精水提液，生藥組給予1.5 g·kg-1生黃精水提液，至模型組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)干枯無光澤，飲食量減少，便干，易激惹等腎陰虛癥狀為止[4]，共21 d。收集大鼠糞便，進行16S rDNA測序分析和糞便代謝組學分析。

1.6腸道菌群16S rDNA測序分析 對大鼠糞便進行DNA提取，再對細菌DNA進行PCR擴增，擴增區(qū)域為細菌16SV3+V4，引物名稱為338F、806R，V3上游引物序列為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′、V4下游引物序列為5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。采用Illiumina測序流程及方法進行測序，對原始數(shù)據(jù)進行拼接(FLASH，version 1.2.11)，將拼接得到的序列進行質(zhì)量過濾(Trimmomatic，version 0.33)，并去除嵌合體(UCHIME，version 8.1)，得到高質(zhì)量的Tags序列。

1.7代謝組學分析代謝差異物 稱取糞便樣品約50 mg，加入超純水0.5 mL，渦旋5 min，13 000 r·min-1(r=13.5 cm)離心10 min(17000×g)；取上清液約350 μL；再向糞便沉淀物中加入甲醇溶液，0.5 mL渦旋5 min，13 000 r·min-1離心10 min；吸取上清液，2次上清液合并混勻，13 000 r·min-1離心10 min；取混合上清液0.4 mL置于1，2-13C肉豆蔻酸(0.3 mg·mL-1)的Ep管中10 μL ，混勻，置于離心濃縮儀中揮干(45 ℃，15 kPa)；衍生化：加入甲氧胺吡啶溶液(10 mg·mL-1)60 μL，渦旋5 min，置于恒溫震蕩儀中震蕩1.5 h(30 ℃，3000 r·min-1，再加入BSTFA(1%TCMS)60 μL，渦旋5 min，震蕩1 h；4 ℃，13 000 r·min-1(r=13.5 cm)離心10 min，取上清液進樣分析約90 μL。

2 結(jié)果

2.1大鼠腸道菌群分析

2.1.1Alpha多樣性指數(shù)變化 Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少，Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，具體見表1。給藥前后大鼠腸道中的物種數(shù)量無明顯差異；但大劑量組可以明顯增加腸道中的物種豐富度。

表1 Alpha多樣性指數(shù) Tab.1 Alpha diversity index

2.1.2腸道菌群分析結(jié)果 在門分類水平上進行比較，與對照組相比，模型對照組可以顯著增加厚壁菌門的豐度(P<0.001)、顯著降低擬桿菌門的豐度(P<0.001)；與模型對照組比較，大、中、小劑量組及生藥組均可以顯著降低厚壁菌門的豐度(P<0.01或P<0.05)、顯著升高擬桿菌門的豐度(P<0.001或P<0.01)；在科分類水平上進行比較，與對照組相比，模型對照組可以顯著增加毛螺菌科的豐度(P<0.001)、顯著降低Muribaculaceae科(P<0.001)及普雷沃氏菌科(P<0.01)的豐度；與模型對照組比較，中、小劑量組及生藥組可以顯著降低毛螺菌科的豐度(P<0.05或P<0.001)，中劑量組可以顯著增加Muribaculaceae科的豐度(P<0.01)，大、中、小劑量組可以顯著增加普雷沃氏菌科的豐度(P<0.001或P<0.05)；在屬分類水平上進行比較，與對照組相比，模型對照組可以顯著降低Muribaculaceae屬(P<0.001)、Ruminococcaceae_UCG-005屬(P<0.05)、普雷沃氏菌屬(P<0.05)、擬普雷沃氏菌屬(P<0.05)的豐度，顯著增加乳酸菌屬(P<0.01)的豐度；與模型對照組比較，中劑量組可以顯著增加Muribaculaceae屬的豐度(P<0.01)，大劑量組可以顯著增加Ruminococcaceae_UCG-005屬的豐度(P<0.05)，大、中、小劑量組可以顯著增加普雷沃氏菌屬的豐度(P<0.01或P<0.05)，大、中、小劑量組及生藥組可以顯著增加擬普雷沃氏菌屬的豐度(P<0.01或P<0.05)，大劑量組可以顯著降低乳酸菌屬的豐度(P<0.05)。具體結(jié)果見表2。

表2 7組腸道菌群方差分析 Tab.2 Variance analysis of intestinal flora in seven groups

A.大劑量組；B.中劑量組；C.小劑量組；D.對照組；G.生藥組；M.模型對照組；Y.陽性組。圖1 7組的LEfSe分析 A.high dose group；B.medium dose group；C.low dose group；D.control group；G.crude drug group；M.model control group；Y.positive group.Fig.1 LEfSe analysis of seven groups

2.2代謝組學分析腎陰虛大鼠的代謝差異物

2.2.1黃精炮制前后對腎陰虛大鼠糞便代謝表型的影響(PCA) 將所有數(shù)據(jù)帶入軟件中擬合PCA模型，PCA模型R2X=0.629>0.5，表明模型可靠，見圖2。

圖2 7組PCA得分圖(R2X=0.629) Fig.2 Score chart of PCA of seven groups(R2X=0.629)

2.2.2黃精炮制前后對腎陰虛大鼠糞便差異代謝物的影響(OPLS-DA) 為了探尋大鼠代謝差異物及差異物變化趨勢，將分析對照組vs模型對照組、生藥組vs模型對照組、大劑量vs模型對照組、中劑量vs模型對照組、小劑量vs模型對照組中代謝物變化趨勢情況。模型中R2Y，Q2均大于0.5，說明其之間均存在顯著差異。通過VIP>1，P<0.05 篩選出代謝差異物。

通過OPLS-DA分析，對照組vs模型對照組篩選出45個代謝物，大劑量組vs模型對照組篩選出51個代謝物，中劑量組vs模型對照組篩選出44個代謝物，小劑量組vs模型對照組篩選出41個代謝物，生藥組vs模型對照組篩選出39個代謝物。對各組差異代謝物進行交集篩選，共有30種差異代謝物。與模型對照組相比，給藥組可以回調(diào)D-阿拉伯糖2、D-阿拉伯糖1、L-(-)-海藻糖、硬脂酸、(R)-十八烷酸-2，3-二羥丙酯、三硅氧烷、乳酸、丙酸等8種代謝物的水平，可以下調(diào)半乳糖苷、馬來酸、D-巖藻糖醇、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L-酪氨酸、2-羥基扁桃酸、D-木糖、正壬烷、2-羥基苯乙酸、尿嘧啶、十一烷、羥基乙酸、景天酮糖、1-五甲基二硅氧基十六烷、正十二烷、1，2-丁二醇、天門冬氨酸、D-(-)-乳酸、嘧啶、己酸、絲氨酸等22種代謝物的水平。

2.3代謝通路分析 為進一步挖掘腎陰虛模型的發(fā)生機制，將對照組與模型對照組之間篩選出來的48個代謝物全部導入MetaboAnalyst 5.0在線網(wǎng)站中進行通路富集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要涉及的代謝通路有8條，分別為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、甘油酯代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨酰tRNA生物合成、丙酮酸代謝、酪氨酸代謝及半胱氨酸和蛋氨酸代謝，具體見圖3(A)，其中2條代謝通路差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，分別為氨酰tRNA生物合成、丙酮酸代謝。

圖3 代謝通路概要圖 Fig.3 Metabolic pathway overview map

大劑量組與模型對照組之間共篩選到9條相關(guān)代謝通路，其中2條差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，分別為氨酰tRNA生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，見3(B)；中劑量組與模型對照組之間共篩選到10條相關(guān)代謝通路，其中2條差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，分別為氨酰tRNA生物合成、丙酮酸代謝，見圖3(C)；小劑量組與模型對照組之間共篩選到7條相關(guān)代謝通路，其中2條差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，分別為氨酰tRNA生物合成、丙酮酸代謝，見圖3(D)。

3 討論

3.1造模及指標的選擇 黃精蒸制后其顏色變黑，根據(jù)中醫(yī)理論“黑色入腎”及臨床療效，黃精蒸制后滋陰補腎的效果更好。腎陰虛通常會導致甲狀腺和腎上腺的損傷，同時會引起免疫功能的變化，表現(xiàn)為脾系數(shù)、胸腺系數(shù)減小。測定cAMP/cGMP比值是評價陰虛和陽虛癥候情況的常見方式，二者可視為中醫(yī)理論中陰陽互消互長的關(guān)系，同時陰虛內(nèi)熱的“熱”可能是Na+-K+-ATP酶活性過高的一種表現(xiàn)，其中cAMP的功能是以亢進興奮為主可視為陽，cGMP以抑制收斂為主可視為陰；陰虛內(nèi)熱的“熱”可能是Na-K-ATP酶活性過高的一種表現(xiàn)[5-6]。在腎陰虛模型中，筆者選用cAMP、cGMP、Na-K-ATP 酶為指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大劑量組能顯著增加Na-K-ATP酶的活性，大、中劑量組均能顯著降低cAMP含量，且大、中、小劑量均能顯著降低cAMP/cGMP比值，同時大劑量組與生品組存在顯著性差異，與實驗假設(shè)一致。根據(jù)中醫(yī)理論，腎主二便，大便干結(jié)主要是因為腎陰虛導致腎臟陰液不足，滋養(yǎng)和濡潤功能減弱的緣故；腎主藏精，精能化血，血充盈則毛榮盛，所以腎陰虛大鼠會出現(xiàn)脫發(fā)、毛發(fā)無光、須發(fā)早白的現(xiàn)象。本研究對實驗對象開展了一般行為學觀察(毛發(fā)飲水量大便干結(jié)肛溫體質(zhì)量痛閾值)、血漿cAMP、cGMP含量測定、Na+-K+-ATP酶活性的測定及臟器指數(shù)測定的工作，以輔助判斷腎陰虛模型造模成功。

3.2腎陰虛模型中菌群的判定 腎陰虛患者腸道內(nèi)菌群與正常人菌群有所不同，可以通過腸道為靶點來調(diào)節(jié)腎陰虛患者的腦腸肽水平[7]。腸道中兩個重要的細菌門為厚壁菌門和擬桿菌門，厚壁菌/擬桿菌(F/B)的比值在維持正常的腸道穩(wěn)態(tài)方面具有重要的影響；Muribaculaceae是擬桿菌門擬桿菌目分類下的一個菌，在多個研究中被認為是有益菌[8-9]；Prevotellaceae、Allprevotellaceae等菌均可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，對腸道屏障具有保護作用。本研究表明給藥組及陽性組均顯著增加了這幾種菌群的豐度，調(diào)節(jié)了腸道菌群的失調(diào)。本研究通過LEfSe分析可知(圖1)，腎陰虛大鼠腸道內(nèi)菌群增加主要表現(xiàn)在厚壁菌門下的毛螺菌科的Allobaculum菌和毛螺菌-NK4A136-group的富集，因此猜測腎陰虛的發(fā)生機制是大鼠腸道內(nèi)Allobaculum菌和毛螺菌-NK4A136-group的富集，從而可以推測出厚壁菌門和毛螺菌科豐度的降低可能為黃精治療腎陰虛的作用機制。

3.3代謝差異物及通路分析 乳酸是丙酮酸代謝通路中的代謝物，其含量與細胞厭氧呼吸有關(guān)。本實驗結(jié)果表明對照組、炮制組(大、中、小劑量組)和生藥組均可以升高乳酸含量，說明模型大鼠體內(nèi)出現(xiàn)了能量代謝紊亂；給予黃精干預(yù)治療后，使模型大鼠代謝紊亂在一定程度上達到平衡。天冬氨酸參與鳥氨酸循環(huán)，可以降低血液中氮和二氧化碳的量，增強肝臟功能，消除疲勞；本實驗中天冬氨酸參與氨酰tRNA生物合成，用以促進蛋白質(zhì)合成，當氨酰tRNA生物合成出現(xiàn)改變，可使蛋白質(zhì)代謝出現(xiàn)異常。因此推測腎陰虛模型的發(fā)生機制可能與能量代謝和蛋白質(zhì)代謝有關(guān)。