鄭志聰，麥彩園，王 斌

（1. 佛山市三水區(qū)婦幼保健院外科，廣東 佛山 528100 ；2.廣東省婦幼保健院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510010 ；3. 佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院外科，廣東 佛山 528100）

乳腺癌是女性群體中發(fā)病率最高的惡性腫瘤。每年有數(shù)以萬計的女性死于乳腺癌，且近年來此病的發(fā)病率逐年升高[1]，此病患者的發(fā)病年齡呈年輕化的趨勢[2]。有效治療乳腺癌是一個亟待解決的問題[3]。近年來在乳腺癌的治療方面不斷涌現(xiàn)出先進的治療方法，引入分子基因特征平臺管理乳腺癌有助于更有效地治療此病，降低此病患者的死亡率[4]。MicroRNA（miRNA）是一種非編碼RNA 分子，能與互補堿基配對，識別并直接調控靶基因，影響其翻譯，進一步實現(xiàn)轉錄后調控[5]。miRNA 能顯著促進細胞的正常生長，維持細胞的功能，miRNA 表達的變化與癌癥有著密切的關系[6]。目前已證實，miRNA 可抑制腫瘤[7]。降低miR-16-5p 可促進乳腺癌的生長[8]。NOD 樣受體蛋白1（nod like receptor proein 1，NLRP1）是最早被發(fā)現(xiàn)的炎性體，可通過對先天性和適應性免疫、細胞凋亡、分化的調節(jié)而在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮致病作用[9]。MiRNA-16-5p 可通過靶向NLRP1 來抑制白細胞介素-1β（IL-1β）、細胞介素-18（IL-18）的表達，從而改善缺氧復氧引起的BRL-3A 細胞焦亡[10]。基于以上背景，本文欲探討miR-16-5p 靶向調控NLRP1對抑制乳腺癌增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

紫外分光光度計、PCR 檢測系統(tǒng)、雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)、電泳儀、轉膜儀，以上儀器均由美國Progmega 公司生產(chǎn)。RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒、Trizol 液、引物、CCK-8 溶液，以上試劑均由中國愛必信生物科技有限公司生產(chǎn)。BCA 蛋白定量試劑盒、載體、培養(yǎng)液，以上試劑均由中國Takara 公司生產(chǎn)。Western-Blotting 的一、二抗體，由美國abcam 公司生產(chǎn)。質粒抽提試劑盒、miR 模擬物及對照物、NLRP1 過表達載體、Trizol 試劑，以上試劑均由中國鐸洋生物有限公司生產(chǎn)。

1.2 研究對象

1.2.1 病例信息 本研究收集廣東省婦幼保健院、佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院2018 年12 月至2021 年12 月期間經(jīng)手術切除的乳腺標本60 份，將其中30 份正常乳腺標本設為正常組，將其中30 份乳腺癌標本設為癌癥組。這60 份乳腺標本取自60 例患者，這些患者的年齡為50 ～52 歲，體重為50 ～52 kg。所有患者的年齡、體重差異不大。本研究的整個研究過程經(jīng)患者同意并經(jīng)廣東省婦幼保健院、佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院的醫(yī)學倫理委員會授權。

1.2.2 納入及排除標準 入組標準：納入病例的活動能力、民事行為能力均正常，無精神疾病及認知功能障礙；癌癥初發(fā)，未經(jīng)放化療、免疫治療等；癌癥組織經(jīng)病理學檢查被確診為乳腺癌組織，正常乳腺組織經(jīng)病理學檢查被確診為正常乳腺組織。排除標準：男性乳腺癌患者；合并有嚴重的慢性疾??；合并有內分泌疾病等代謝異常性疾病。

1.2.3 標本收集 術中將乳腺癌組織、正常乳腺組織（取癌灶遠端距癌灶3 cm 以上的正常乳腺組織）切除后，用專用的鑷子將所有組織取出，立即用焦碳酸二乙酯（DEPC）液對組織進行沖洗，并由專業(yè)人員放入冷藏管中，用液氮進行冷凍，然后在病理科收集臨床數(shù)據(jù)。

1.3 研究方法

收集經(jīng)手術切除的乳腺癌組織（癌癥組）、正常乳腺組織（正常組），提取細胞進行培養(yǎng)、傳代。采用逆轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）法檢測miR-16-5p、NLRP1 在正常組、癌癥組細胞中的表達，采用CCK-8 法檢測癌癥組細胞中miR-16-5p、NLRP1 的增殖情況，采用RT-qPCR 法檢測癌癥組細胞中miR-16-5p 過表達后miR-16-5p、NLRP1 的相對表達情況，采用蛋白免疫印跡（Western Blotting，WB）法檢測癌癥組細胞中miR-16-5p 過表達后NLRP1 的表達情況，采用雙熒光素酶報告基因實驗測定miR-16-5p 可能結合的靶位點NLRP1。

1.4 實驗步驟

1.4.1 細胞提取、培養(yǎng)、傳代 取樣品，解凍。去掉組織中的結締組織，剪碎，用1% 的胰酶消化，孵育30 min 后用移液管反復吹打，用70 μm 孔徑的細胞篩過濾，除掉大塊未消化的團塊。將得到的濾過液進行離心處理，取沉淀物，并用含10%滅活胎牛血清（FBS）、100 μ/mL 青霉素和100 μ/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基對沉淀物進行培養(yǎng)。將標本與DMEM 培養(yǎng)液混合后進行離心處理，去上清。重懸細胞，在懸液中緩慢注入Percoll 分離液，經(jīng)離心處理后吸取中層細胞，加入培養(yǎng)基。于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每2 d 或3 d 更換1 次培養(yǎng)液。在顯微鏡下觀察細胞。用胰酶對細胞進行消化，調節(jié)細胞濃度至2×105 個/mL，繼續(xù)在培養(yǎng)板內培養(yǎng)細胞，當細胞融合度達到90%時開始進行細胞傳代。

1.4.2 細胞轉染 miR-16-5p 模擬物（mimics）和相應的陰性對照（NC）的細胞密度均為5×105，將其鋪于六孔板上，融合度達到90% 后吸出，用PBS 緩沖液沖洗，更換為Opti-MEM 培養(yǎng)液，每孔加入3 mL，稀釋質粒至20 μm。將RNA 加入到轉染試劑中孵育，并置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 h，之后采用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，最后檢測其表達量。

1.4.3 RT-qPCR 根 據(jù)Trizol 液 說 明 書， 取 樣品， 在 含RNAiso Plus 液 的EP 管 中 混 合， 加 入氯仿，在4 ℃下進行離心處理，在上層水相中加入異丙醇，混合并進行離心處理。去上清液，加入乙醇。再去上清后加入無RNA 酶水，計算OD值。 參 照OneStep PrimeScript?miRNA cDNA 合成試劑盒的說明書，進行反轉錄，合成cDNA，然后 用SYBR Green I 熒 光 法 進 行PCR 檢 測（ 參 照SYBR GreenI 說 明 書）。miR-16-5p 引 物 序 列：F:5 ′ -TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3 ′，R:5 ′ -TGCGTGTCGTGGAGTC-3 ′ ；NLRP1 引物 序 列：F:5 ′ -TCTGAGTGATGAGATGAG-3 ′，R:5′ -GTGAGGATGTGCTATTAC-3′ ；U6 引 物 序列F:5 ′ -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ′，R:5 ′ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′ ；β-actin 引 物 序列F:5′ -TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′，R:5′ -TGATGTCACGCACGATTT-3′。2-ΔΔCT用于計算待測樣品的相對濃度。同樣的實驗重復3 次，取平均值（U6是miR-16-5p 的內參，β-actin 是NLRP1 的內參）。

1.4.4 細胞增殖檢測（CCK-8 法） 將第3 代細胞制備成細胞懸液并計數(shù)。在96 孔板中接種細胞懸液，每孔約接種100 μL，重復3 次。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)2 ～4 h（培養(yǎng)條件是：37℃，5%CO2），每孔各加入10 μL 的CCK-8 溶液，輕輕晃動培養(yǎng)板將其混勻。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育1 ～4 h。分別在0 h、24 h、48 h、72 h 時加入10 μL 的CCK-8試劑，在37℃下孵育120 min。最后用酶標儀讀取相應因子的OD 值。

1.4.5 WB 法檢測RIPA 蛋白的表達水平 根據(jù)目標蛋白的分子量，選擇合適濃度的SDS/PAGE 凝膠。電泳后，將蛋白質轉移到 PVDF 膜上，并采用正常免疫染色法進行染色。加入一抗（1:500 稀釋）和二抗（1:1000稀釋），分別在4℃下孵育過夜、37℃下孵育2 h，然后進行化學發(fā)光、增強、固定和拍照處理。每個實驗重復3 次后取平均值（內參為β-actin）。

1.4.6 雙熒光素酶報告基因實驗測定miR-16-5p 可能結合的靶位點NLRP1 利用targetscan 網(wǎng)站預測miR-16-5p 可能結合的靶位點NLRP1。構建WT質粒+miR-16-5p mimics+pRL-TK 質粒（野生型）、MT 質 粒+miR-16-5p mimics+pRL-TK 質 粒（ 突 變型）；WT 質 粒+negative control+pRL-TK 質 粒；MT質粒+negative control+pRL-TK 質粒。pGL3 啟動子載體注射NLRP1 的突變序列，將細胞接種到24 孔板上，并用海腎熒光素酶載體pRL-TK 共轉染，根據(jù)標準化轉染效率的差異行熒光素酶檢測。

1.5 統(tǒng)計學方法

用SPSS 20.0 軟件和GraphPad 7.0 軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，計量資料用±s表示，用t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-16-5p、NLRP1 在正常組、癌癥組細胞中的表達

miR-16-5p 的mRNA 在正常組細胞中的相對表達值為（3.76±0.21），在癌癥組細胞中的相對表達值為（1.35±0.12），組間相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。NLRP1 的mRNA 在正常組細胞中的相對表達值為（4.88±0.11），在癌癥組細胞中的相對表達值為（8.01±0.33），組間相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 癌癥組細胞miR-16-5p 過表達后miR-16-5p、NLRP1 的表達情況

將miR-16-5p 過 表 達 轉 染， 行RT-qPCR 實驗，提示模擬物過表達轉染后細胞miR-16-5p 的表達水平顯著上升，相對表達值由（3.66±0.23）上升至（7.10±0.98），二者相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；NLRP1 的表達水平顯著下降，相對表達值由（8.12±0.19）下降至（4.17±1.41），二者相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 miR-16-5p、NLRP1 過表達對癌癥組細胞增殖的影響

經(jīng)細胞增殖檢測（CCK-8 法）發(fā)現(xiàn)，在癌癥組細胞中過表達miR-16-5p 可減少細胞增殖（見圖1A），在癌癥組細胞中過表達NLRP1 可增加細胞增殖（見圖1B）。

圖1 miR-16-5p、NLRP1 過表達對癌癥組細胞增殖的影響

2.4 癌癥組細胞miR-16-5p 過表達后NLRP1 的表達情況

采用WB 法檢測癌癥組細胞中miR-16-5p 過表達后NLRP1 的表達發(fā)現(xiàn)，NLRP1 在miR-16-5p mimics 較miR-16-5p Control 明 顯 降 低（ 內 參 為β-actin，P＜0.05）。見圖2。

圖2 癌癥組細胞中miR-16-5p 過表達后NLRP1 的表達情況

2.5 miR-16-5p 可能結合的靶位點NLRP1

利用targetscan 網(wǎng)站預測發(fā)現(xiàn)，miR-16-5p 可能結合的靶位點為NLRP1。見圖3。通過熒光素酶報告基因實驗發(fā)現(xiàn)，miR-16-5p 可顯著抑制WT 質粒+miR-16-5p mimics+pRL-TK 質粒（野生型）的熒光素酶活性， 而不影響MT 質粒+miR-16-5p mimics+pRL-TK 質粒（突變型）的熒光報告基因活性（P＜0.05）。見圖4。

圖3 targetscan 網(wǎng)站預測miR-16-5p 可能結合的靶位點

圖4 熒光素酶報告基因實驗結果

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。近年來雖然乳腺癌患者的死亡率有所下降，其5 年生存率有所提高，但此病的發(fā)病率仍呈增高的趨勢[11]。針對乳腺癌的靶向治療是近年來乳腺癌治療中的研究熱點。乳腺癌中MicroRNA-16-5p 過表達后，可通過靶向血管內皮生長因子A（VEGFA）抑制腫瘤的增殖和侵襲，并引發(fā)腫瘤細胞凋亡[12]。miR-16-5p 是乳腺癌原發(fā)灶和轉移灶組織中穩(wěn)定表達的一種MicroRNA[13]。炎性小體是一種存在于細胞質內的多聚復合體，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白家族（NLRPs）是炎性小體最為經(jīng)典的一類[14]。在乳腺癌的發(fā)病機制中，NLRP1 可參與有絲分裂、突變、血管生成、細胞存活、免疫抑制和轉移[15]。已有研究證實，MiR-16-5p 可通過靶向NLRP1 來控制細胞焦亡[10]。有研究在人乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)NLRP1 呈高表達，且與淋巴結轉移、腫瘤淋巴結轉移階段及Ki-67 水平相關[16]。本研究的結果顯示，癌癥組細胞比正常組細胞miR-16-5p 的mRNA 相對表達值顯著下降（P＜0.05）；癌癥組細胞比正常組細胞NLRP1 的mRNA 相對表達值顯著上升（P＜0.05）；癌癥組細胞miR-16-5p 過表達后miR-16-5p 的表達水平顯著上升、NLRP1 的表達水平顯著下降（P＜0.05）。提示miR-16-5p 在乳腺癌中呈低表達，NLRP1 在乳腺癌中呈高表達。本研究的結果顯示，miR-16-5p 可顯著抑制WT 質粒+miR-16-5p mimics+pRL-TK 質粒（野生型）的熒光素酶活性，而不影響MT 質粒+miR-16-5p mimics+pRLTK 質粒（突變型）的熒光報告基因活性（P＜0.05）。進一步證明了miR-16-5p 與NLRP1 的靶向調控關系。

綜上所述，miR-16-5p 在乳腺癌中呈低表達，NLRP1 在乳腺癌中呈高表達。miR-16-5p 可靶向調控NLRP1 而抑制乳腺癌的增殖。本研究為臨床上治療乳腺癌提供了新的思路和用藥策略。