黃 霞，張光前，朱貴平

（宜賓市敘州區(qū)食品檢驗檢測中心，四川宜賓 644699）

畜禽養(yǎng)殖中常用各類抗生素作為畜禽疾病常用藥，有些藥物間隔期還未到期就上市銷售，長久食用會產(chǎn)生抗藥性，危害消費者的身體健康。硝基咪唑類抗生素是畜禽飼料中常用的抗原蟲感染及抗菌藥，具有促生長作用，可與其他抗生素聯(lián)合用于治療厭氧菌感染[1-6]。

目前測定硝基咪唑類藥物的方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質譜法和高效液相色譜串聯(lián)質譜法[7-10]等。其中色譜檢測因為定型能力弱，易檢出假陽性。而氣相色譜串聯(lián)質譜法適用面窄，且其處理復雜。高效液相色譜串聯(lián)質譜法選擇特征離子掃描，抗干擾能力強，且檢出靈敏度高，具有檢出使用范圍廣等優(yōu)點，廣泛應用于各類獸藥殘留的檢測中。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲硝唑標準品（中國藥品生物制品檢定所）；羥基甲硝唑標準品（WITEGA 99.4%）；二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、甲酸及丙酮均為色譜純（山東大禹）；氯化鈉為分析純（成都科?。粚嶒炗盟疄槌兯ㄊ婊钊?。

AB4500Q 液質聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源和大氣壓化學源 美國AB 公司)；CP225D 電子天平（賽多利斯）；LD4-2C 離心機（北京京立離心機有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的配制

精密稱取待測組分甲硝唑及其代謝產(chǎn)物羥基甲硝唑標準品各10.0 mg，甲醇溶解為1 000 μg/mL 標準儲備液。分別精密吸取甲硝唑、羥基甲硝唑標準儲備液0.010 mL 于同一個100 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到1 000 ng/mL 混合標準中間液。分別精密吸取0.010 mL、0.020 mL、0.050 mL、0.100 mL和0.500 mL 于進樣瓶中，陰性樣品提取液定容至1.00 mL，得到濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 和500 ng/mL 混合標準工作液。

1.2.2 樣品前處理方法

準確稱取均勻樣品約10.0 g 于50 mL 離心管中，加入5 g 硅藻土與樣品充分混勻后在加入2.5 mL 飽和氯化鈉水溶液，20 mL 甲醇+丙酮（3+1）。充分振蕩混勻，超聲30 min，離心，取上清液于蒸發(fā)皿中(重復提取一次）。將兩次提取的上清液60 ℃電熱板蒸干只剩水相，將水相全部轉移至另一50 mL 離心管中，加入氯化鈉飽和溶液5 mL，10 mL 乙酸乙酯，無水硫酸鈉3 g，離心，取有機相于25 mL比色管中（重復提取一次），60 ℃氮吹至近干，用1.0 mL 甲醇溶解，上機。

1.2.3 色譜檢測條件

色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；進樣體積：5 μL；流速：1.0 mL/min；流動相：0.1%甲酸/水（A）和甲醇（B）；梯度洗脫程序：0 ～5.0 min，95%～5%A，5.1 ～10.0 min，5%A；10.1 ～15.0 min，95%A。

1.2.4 質譜檢測條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；采集模式：多 反 應 離 子 監(jiān) 測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；掃描模式：正離子掃描；離子源溫度：600 ℃；電噴霧電壓：5 500 V；氣簾氣壓力：35 psi；噴霧氣壓力：60 psi；輔助氣壓力：70 psi；其余質譜條件如表1 所示。

表1 待測組分質譜條件

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

樣品中加入硅藻土能更好地提取待測組分。硅藻土主要有3 個作用：粒間偶極作用；絮凝作用，能將待測組分形成絮凝物；吸附作用。這3 點都能促使待測組分更好地從動物組織中分離，吸附于硅藻土上。飽和食鹽水則能更好地將動物組織分散開，使待測組分更易析出。

文獻[6,8,10-12]中常用乙腈、酸性乙腈（含0.1%甲酸）、甲醇+丙酮（3+1）、二氯甲烷來作為萃取溶劑，提取動物組織中的獸藥殘留。本試驗對這4 種提取溶劑的提取效果做了單因素實驗。結果表明，當加標量為1 μg/kg 時，4 種萃取劑的回收率都較低，為40%～55%，當加標量為5 μg/kg、20 μg/kg 時，乙腈、酸性乙腈（含0.1%甲酸）回收率在45%～60%，回收率較低。二氯甲烷回收率在70%～80%。甲醇+丙酮（3+1）回收率在75%～85%，回收率最高?？紤]到甲醇+丙酮（3+1）的毒性較乙腈和二氯甲烷低，且回收率較高，故選擇甲醇+丙酮（3+1）為提取溶劑。提取溶液再經(jīng)乙酸乙酯液液分配，能有效去除樣品中的雜質，減少基質干擾。

文獻中[6,8,10,12]還提到用凝膠滲透色譜，固相萃取小柱進行凈化。凝膠滲透色譜溶劑用量大，儀器價格貴，未采用。采用C18固相萃取小柱凈化，甲硝唑和羥基甲硝唑的回收率都較低，為50%～65%。在小柱凈化的過程中，有一部分待測組分被C18顆粒吸附，未被洗脫，造成回收率偏低。

本實驗采用液質聯(lián)用的多反應離子監(jiān)測模式進行采集，離子碎片的選擇性高，能有效降低樣品中的雜質干擾。因此，本實驗通過乙酸乙酯液液萃取后，直接氮吹甲醇定容上機，能滿足檢測需要。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

將1.0 μg/mL 待測化合物的標準溶液在正離子模式下進行母離子全掃描，確定待測組分的母離子，再分別以待測化合物母離子，對其子離子進行全掃描，選擇兩個響應值較高，干擾較小的特征子離子作為子離子[11]。一般將響應值最高的作為定量離子，次之的作為定性離子（離子對見表1）。

將母離子的去簇電壓（DP）設置為60 V，掃描5 ～180 V 的碰撞能量（CE），選擇響應值最高的CE 值（具體值見表1），確定響應值最高時的CE 值后將DP 范圍設置為5 ～300 V 掃描，得到響應值最高的DP 值（具體值見表1）。建立MRM 方法。

2.3 流動相的優(yōu)化

流動相對化合物的出峰時間、峰形、響應值有直接影響。甲硝唑和羥基甲硝唑均為正離子采集模式，故采用含有0.1%甲酸的水溶液作為水相，酸性環(huán)境下，物質更容易電離成帶正電荷的母離子。本實驗比較了乙腈甲酸水與甲醇甲酸水的兩種流動相對待測組分峰形的影響，實驗表明，兩者均有較好的峰形，且響應值差異較小。考慮到乙腈價格是甲醇的三倍以及乙腈毒性較甲醇更強，因此采用甲醇作為流動相。

2.4 線性范圍、檢出限及定量限

本實驗以待測組分的濃度和色譜峰面積作為X、Y軸繪制線性回歸方程。本實驗標準曲線線性范圍為10 ～500 ng/mL，甲硝唑、羥基甲硝唑的相關系數(shù)R2均大于0.999 9，通過向陰性豬肉樣品中添加1 μg/kg待測組分，測定信噪比為3（S/N=3）時方法的檢出限，信噪比為10（S/N=10）時方法的定量限。線性方程、線性相關系數(shù)、檢出限及定量限，見表2，標準曲線見圖1 和圖2。

表2 回歸方程、檢出限、定量限

圖1 甲硝唑定量離子標準曲線

圖2 羥基甲硝唑定量離子標準曲線

2.5 方法回收率、精密度

選用陰性鮮豬肉樣品，分別在1 μg/kg、5 μg/kg、20 μg/kg 低中高3 個加標水平對待測組分進行加標回收，高中低3 個濃度各測定6 次，結果見表3。5 μg/kg加標回收色譜圖、陰性樣品的色譜圖見圖3、圖4。由此說明該方法的回收率基本滿足檢測需要。

圖3 5 μg/kg 加標回收色譜圖

圖4 陰性樣品色譜圖

表3 回收率和相對標準偏差

2.6 實際樣品分析

采用本方法對12 批鮮豬肉中的甲硝唑及羥基甲硝唑進行測定。每批樣品從稱樣到檢測完畢只需1 h。與傳統(tǒng)固相萃取、凝膠滲透色譜法相比，樣品分析時間縮減，且成本降低。實際檢測結果顯示，12 批鮮豬肉中的甲硝唑及羥基甲硝唑均未檢出[13]。

3 結論

本實驗通過對前處理和儀器檢測條件的優(yōu)化，基本滿足檢測需要。但是在含量較低時，回收率還有較大提高空間。如果能采用內(nèi)標法定量，消除前處理中的損失及儀器檢測時的基質效應，能有效提高方法的準確性，特別是樣品含量較低時的定量準確性。