趙淼，包永睿，2，3，王帥，2，3，李天嬌，2，3，孟憲生，2，3*（.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 6600；2.遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 6600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 6600）

微流控芯片（microfluidic chip）是以分析化學(xué)為基礎(chǔ)，微機械和納米技術(shù)為依托，并隨著生物化學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程發(fā)展而興起的一門交叉學(xué)科[1]。相較于傳統(tǒng)實驗室操作，微流控技術(shù)具有微型化、樣品消耗少、分析速度快、易于集成等優(yōu)點[2]，其設(shè)計原則為將流體在微觀領(lǐng)域的物理和化學(xué)特性發(fā)揮最大化，實現(xiàn)流體與微小物體的操控，從而完成分析測試過程。微流控技術(shù)通過與生物技術(shù)和電子設(shè)備相結(jié)合，可以在芯片中構(gòu)建一種與體內(nèi)環(huán)境相似的微環(huán)境，并能對芯片中的實驗實現(xiàn)全程監(jiān)測和實時控制。目前微流控技術(shù)廣泛應(yīng)用于細胞培養(yǎng)、高通量藥物篩選、生物化學(xué)分析檢測以及臨床診治[3-4]等領(lǐng)域。

1 微流控芯片技術(shù)研究

微流控芯片又稱芯片實驗室（lab on a chip），是一種可在微米尺度下精確操控流體的新技術(shù)，具有微型化和高通量的特點，并兼具可單元組合和功能集成的優(yōu)勢[5-7]。其最基本的結(jié)構(gòu)特征是微米級的微通道系統(tǒng)，因此需要相配的制作材料、加工工藝以及結(jié)構(gòu)單元。

1.1 微流控芯片的制作材料

在微流控芯片制作過程中，首先要考慮芯片材料的選取。芯片材料選擇上的主要考量因素為材料的氣密性、導(dǎo)電性、散熱性、透光性、溶劑耐受性、化學(xué)和生物相容性等。常用于制作微流控芯片的材料有單晶硅、玻璃和有機聚合物，如聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）、聚碳酸酯（polycarbonate，PC）以及水凝膠等，不同材料制備微流控芯片的優(yōu)缺點見表1。早期的微流控芯片由玻璃和硅制作而成，優(yōu)點在于高溫下的化學(xué)穩(wěn)定性、高強度和導(dǎo)熱特性，可以在表面加工實現(xiàn)精確的納米級圖案結(jié)構(gòu)[8-9]。例如硅材料廣泛應(yīng)用于三維培養(yǎng)結(jié)構(gòu)中的微反應(yīng)器和細胞培養(yǎng)腔室；玻璃的機械強度較高，是制作PCR 芯片的主要材料。硅彈性體PDMS 因成本低廉、制作快捷、設(shè)備門檻低，目前已成為制作微流控芯片的首選材料[10]，且其氣體透過性良好，有利于細胞培養(yǎng)中的氣體交換[11]，疏水表面也更容易被細胞黏附[12]，因此多用于細胞培養(yǎng)、藥物篩選及制作生化分析器件[13]。熱塑性材料因具有良好惰性、溶劑耐受性且加工成本低等特點，在商業(yè)化產(chǎn)品中被大量使用，常見的熱塑性材料有PMMA、PC、聚苯乙烯、聚氯乙烯及全氟代聚合物。PMMA 具有良好的熱加工、光學(xué)性能和生物兼容性，在細胞培養(yǎng)等生命科學(xué)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用[14-15]。水凝膠材料包括人工合成高分子聚合物[如聚丙烯酰胺（PAAM）、聚乙二醇（PEG）等]以及天然水凝膠（瓊脂糖凝膠、海藻酸鈉凝膠、明膠等），因其具有高通透性、高含水量的特性，常用于在體外模擬體內(nèi)的血管結(jié)構(gòu)[16]以及構(gòu)建細胞共培養(yǎng)微環(huán)境等。

表1 微流控芯片制作材料的優(yōu)缺點Tab 1 Advantages and disadvantages of microfluidic chip materials

1.2 微流控芯片的制作方法

微流控芯片上微通道的加工有多種方法，玻璃類芯片多采用光刻法和蝕刻法，高分子聚合物芯片所采用的制作技術(shù)包括熱壓法、模塑法、注塑法、LIGA 法（集合光刻、電鑄和塑鑄）和軟刻蝕法[17]。其中最常用的制作方法是模塑法，主要是通過光刻膠得到模具并在模具上固化液態(tài)高聚物得到具有微結(jié)構(gòu)芯片的方法，其方法步驟見圖1。實驗室常采用環(huán)氧SU-8 負膠或正膠作為模具，高分子聚合物PDMS 芯片上的微結(jié)構(gòu)則通過模具轉(zhuǎn)移[18]。模塑法與傳統(tǒng)的刻蝕、濺射工藝相比，操作簡單，形成芯片方便快捷，且設(shè)備要求低，是實驗室制作芯片的最佳方法[19]。

圖1 PDMS 微流控芯片制作示意圖Fig 1 Schematic diagram of making PDMS microfluidic chip

鍵合是芯片制作中的重要環(huán)節(jié)，微流體通道的封合可采用等離子氧化封接法、陽極鍵合法、紫外照射法、有機溶劑黏結(jié)法和交聯(lián)劑調(diào)節(jié)法[20]。由于PDMS 是依靠分子間作用力實現(xiàn)的鍵合，壓力較大時容易出現(xiàn)漏液現(xiàn)象，所以PDMS與玻璃芯片的封接需為永久性。利用等離子氧化處理PDMS 基片和蓋板表面，再將兩者復(fù)合在一起，可以使芯片實現(xiàn)不可逆封接并使封接更為牢固持久。Li 等[21]制作了一種PDMS-玻璃微流控芯片，將澆筑后的PDMS 與表面平整干凈的玻璃通過等離子的方法鍵合在一起，避免了傳統(tǒng)玻璃芯片加工時的繁瑣，無需刻蝕玻璃。

1.3 微流控芯片結(jié)構(gòu)單元的集成

1.3.1 微泵微閥驅(qū)動控制系統(tǒng) 在細胞水平微流控芯片上，借助于微型泵和微閥的流體驅(qū)動技術(shù)是實現(xiàn)微流體控制的前提和基礎(chǔ)，微泵主要包括機械微泵和非機械微泵。機械泵是利用自身機械部件運動或壓力作用來驅(qū)動微流體的機械動力驅(qū)動方式，如氣動微泵、壓電微泵、流動注射泵、電磁微泵、離心力驅(qū)動[22]等；非機械泵是主要靠外場效應(yīng)實現(xiàn)微流體驅(qū)動，其系統(tǒng)本身沒有活動的機械部件，包括重力驅(qū)動、電滲驅(qū)動[23]等。目前絕大部分芯片系統(tǒng)都采用注射泵、蠕動泵等外接流體泵裝置來引入試樣，對流體的控制精確且穩(wěn)定，可以執(zhí)行復(fù)雜的程序化操作。

微泵為流體系統(tǒng)提供了動力，微閥則負責(zé)控制流體的通斷和流動方向，根據(jù)是否有動力驅(qū)動機構(gòu)分為有源閥和無源閥[24]。無源閥不需要外部動力制動，利用流體本身方向和壓力的變化實現(xiàn)微閥狀態(tài)的改變，例如舌狀閥、隔膜閥及擴散閥。有源閥需要依靠壓電、靜電、電磁、熱氣動等機械力進行開合，目前由PDMS 材料制作的氣動軟薄膜微閥因制動性強，密閉性好，易與其他微流控器件形成集成化最為常用[25]。Unger 等[26]提出了一種采用三層軟光刻技術(shù)制作的氣動PDMS微閥，上層是帶有微通道結(jié)構(gòu)的PDMS 芯片，作為氣體制動的控制通道；中層為帶有通道結(jié)構(gòu)的PDMS 薄膜，作為液體流動通道，下層為玻璃襯底。這種經(jīng)典氣動微閥易于用計算機程序進行控制，便于操作步驟的自動化和芯片功能的集成化，將幾個微閥串聯(lián)起來，按照前后順序進行開閉，即可驅(qū)動流體通道內(nèi)的液體流動，完成蠕動泵的功能，微閥微泵結(jié)構(gòu)見圖2。

1.3.2 濃度梯度生成器 研究表明，細胞因子的濃度與腫瘤細胞的侵襲遷移之間存在著密切的關(guān)聯(lián)[27]，傳統(tǒng)的藥物濃度梯度實驗主要在孔板中進行，利用自動化的液體轉(zhuǎn)移分配機械臂完成對液體的多步操控和試劑運輸，并使用多孔板掃描儀或者自動化顯微鏡掃描拍攝技術(shù)對細胞的生存情況進行檢測[28]，但由于設(shè)備價格高昂，不宜普遍使用。隨著微流控技術(shù)的深入研究與廣泛應(yīng)用，基于微流體控制原理的濃度梯度技術(shù)得到大力發(fā)展，比較主流的微流控濃度梯度生成器主要有對流擴散類、基質(zhì)黏復(fù)類、時間演化類、流阻類、并流類等。Jeon 等[29]在微流控芯片上設(shè)計并制作了如“圣誕樹”結(jié)構(gòu)的溶液濃度梯度生成器，它是由多股液流經(jīng)過多次的匯合、分流最終形成較為精確的濃度梯度，并且此類構(gòu)造可以將分析區(qū)域與梯度生成區(qū)域進行更加精細的空間劃分，使梯度環(huán)境更加穩(wěn)定[30]。在芯片中制造濃度梯度用于細胞研究的優(yōu)勢有：通過改變通道構(gòu)型設(shè)計、流體進樣流量比、初始濃度設(shè)置以及組合順序，可以獲得一系列復(fù)雜的濃度梯度[31-32]，簡化操作過程，減少了細胞和試劑消耗量，使其在研究腫瘤轉(zhuǎn)移、高通量篩選中發(fā)揮重大作用，濃度梯度生成器結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 微閥微泵及濃度梯度發(fā)生器結(jié)構(gòu)示意圖Fig 2 Microvalve micropumps and concentration gradient generator

2 微流控芯片在腫瘤研究中的應(yīng)用

微流控技術(shù)憑借著分析速度快捷、樣品消耗量小、裝置便攜化自動化等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于細胞培養(yǎng)、癌癥研究、藥物篩選、藥物吸收和藥物代謝、臨床診斷、組織工程[33-34]等領(lǐng)域。

2.1 細胞研究

細胞培養(yǎng)是細胞生物學(xué)研究的基石，通過在體外空間模擬體內(nèi)微環(huán)境，配以無菌環(huán)境、營養(yǎng)條件、適當(dāng)溫度和pH 值等條件培養(yǎng)細胞，使之生長繁殖并維持結(jié)構(gòu)功能。由于細胞體積微小、種類繁多，且影響因素復(fù)雜（如溫度、氧氣濃度、生物因子濃度、細胞間相互作用、細胞基質(zhì)間相互作用等），使細胞識別、代謝物檢測等細胞研究受到較多限制。微流控芯片因其獨特的優(yōu)勢，例如微米級通道與細胞大小相適應(yīng)，為操縱少數(shù)或單個細胞創(chuàng)造條件；集成性強，可以將細胞遷移、捕獲等多操作單元集成在一張芯片上，同時也滿足了高通量分析需要[35]，從而逐漸應(yīng)用于細胞培養(yǎng)、細胞分化、細胞遷移、藥物代謝[36-37]等多個細胞研究領(lǐng)域當(dāng)中。

根據(jù)培養(yǎng)方式的不同，微流控芯片內(nèi)細胞培養(yǎng)可分為二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)。二維培養(yǎng)一般用于觀察哺乳動物細胞，包含懸浮培養(yǎng)和單層細胞培養(yǎng)兩種形式，其優(yōu)點在于操作簡單，易通入培養(yǎng)液且不容易造成通路堵塞，便于進行觀察等[38]。但其局限性是模擬細胞體內(nèi)生長環(huán)境能力較差，不能重現(xiàn)細胞與胞外基質(zhì)、鄰近細胞、溶解因子和機械力的相互作用[39]。與二維培養(yǎng)方式相比，三維培養(yǎng)通過長期培養(yǎng)細胞來促進細胞聚集和組織形成，并通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因蛋白表達、增殖、分化，從而模擬器官和組織內(nèi)的細胞外基質(zhì)環(huán)境。三維培養(yǎng)一般是利用水凝膠或膠原蛋白構(gòu)建支架結(jié)構(gòu)，為細胞提供三維的機械力支持，使細胞在三維情況下對外部環(huán)境與刺激做出反應(yīng)，從而得到更真實可靠的體外模型[40]。

細胞間相互作用在維持生物體的生長功能方面十分重要，微流控芯片技術(shù)因其便于實現(xiàn)多種細胞的精確共培養(yǎng)從而被廣泛開發(fā)并應(yīng)用于細胞-細胞相互作用的研究中。目前基于微流控芯片的細胞共培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤轉(zhuǎn)移及分析[41]、抗癌藥物篩選、毒性檢測[42]等領(lǐng)域，隨著該技術(shù)的發(fā)展，多種細胞共培養(yǎng)芯片模型相繼出現(xiàn)，在血管系統(tǒng)和腫瘤研究中得到廣泛應(yīng)用，利用3D 結(jié)構(gòu)和插入膜結(jié)構(gòu)培養(yǎng)上皮細胞、成纖維細胞用于血管生成、腫瘤效應(yīng)等研究領(lǐng)域；通過微閥、微通道結(jié)構(gòu)培養(yǎng)腫瘤細胞系和免疫細胞用于上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和炎癥反應(yīng)等研究[43]。

2.2 藥物篩選

藥物篩選是從天然或合成的有機化合物中篩選出高效的先導(dǎo)化合物[44]，并對其進行活性和藥理作用的檢測，是新藥研發(fā)的最初過程和關(guān)鍵步驟。由于藥物分子庫的逐步擴大和藥物作用靶點的急劇增加，傳統(tǒng)的藥物篩選因儀器設(shè)備龐大且價格昂貴限制了應(yīng)用。微流控芯片具有微米級結(jié)構(gòu)和高表面積，其流動模式、傳質(zhì)擴散適用于細胞培養(yǎng)，且具有大規(guī)模集有微閥的濃度梯度篩選平臺，給新藥研發(fā)領(lǐng)域帶來了新的生機。

根據(jù)微流體操控模式的不同，可將微流控藥物篩選系統(tǒng)分為灌流模式、液滴模式和微陣列模式[45]。灌流模式培養(yǎng)通過控制流體連續(xù)流過微通道，可以保持培養(yǎng)基穩(wěn)定的輸入培養(yǎng)區(qū)域，并及時帶走細胞代謝產(chǎn)生的廢物，為細胞培養(yǎng)提供一個與體內(nèi)生理環(huán)境相似的細胞生長環(huán)境[46]。其優(yōu)勢在于操作方便，且適用于光學(xué)檢測、電化學(xué)檢測、質(zhì)譜檢測等多種檢測方式。Zhang 等[47]通過建立高密度排列的微通道，在不同的集成單元內(nèi)接種密度不一的乳腺癌細胞，利用微閥控制液流灌注，根據(jù)藥物篩選的需要向芯片內(nèi)通入不同類型或不同濃度的藥物，并根據(jù)腫瘤細胞的遷移速度和比例對藥效進行定量分析，實現(xiàn)高通量藥物篩選。

液滴模式是近年來在芯片上發(fā)展起來的精準操作少量、小體積液體的技術(shù)，通常是在芯片中通入兩種互不相溶的液體，一種作為連續(xù)相，一種作為分散相，在流動過程中連續(xù)相對分散相進行剪切，分散相以液滴的形態(tài)存在于連續(xù)相中，彼此獨立，易精確控制[48]。比起灌流模式，液滴模式所需樣品量極微，試劑消耗少；每個液滴可以作為獨立的反應(yīng)器，加速試劑混合充分；形成封閉體系，保持液滴內(nèi)部條件穩(wěn)定，避免交叉污染等問題，因此該技術(shù)廣泛應(yīng)用于藥物篩選、細胞操控和單細胞分析等研究領(lǐng)域[49]。為了更好地再現(xiàn)體內(nèi)腫瘤微環(huán)境中各類細胞的相互作用，多種基于三維細胞培養(yǎng)的液滴微流控系統(tǒng)應(yīng)運而生[50]。Sabhachandani 等[51]利用海藻酸鈉凝膠得到含有人乳腺癌細胞和成纖維細胞的腫瘤三維球狀體，模擬了各自獨立的腫瘤微環(huán)境，基于這一液滴陣列，該共培養(yǎng)腫瘤球體對姜黃素和紫杉醇兩種抗癌藥物進行了細胞毒性檢測和分析?；谖㈥嚵心Ｊ降乃幮ШY選系統(tǒng)是指在能夠適應(yīng)細胞培養(yǎng)的載體上，構(gòu)建高密度細胞液滴陣列，并對細胞液滴陣列進行操控和分析[52]。顯示出了高通量、低消耗的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于細胞捕獲和細胞分選等。

2.3 藥物分析

微流控技術(shù)對生物樣品的連續(xù)處理與實時監(jiān)測使其在蛋白質(zhì)和氨基酸分析、腫瘤標志物及癌癥研究等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有著重要的應(yīng)用。蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者和生命現(xiàn)象的體現(xiàn)者，蛋白質(zhì)磷酸化可以闡明腫瘤相關(guān)信號通路，也可以作為藥物作用的靶標[53]。目前蛋白質(zhì)檢測技術(shù)主要有高效液相色譜、質(zhì)譜以及酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法等免疫測定法[54]。這些方法都存在一定的局限性，液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用等檢測方法設(shè)備依賴性較高；免疫測定法的靈敏度較低?；谖⒘骺匦酒牡鞍踪|(zhì)免疫分析技術(shù)具有高靈敏檢測、即時診斷[55]、規(guī)模集成的優(yōu)勢，可以使樣品預(yù)處理、分離和檢測等各種單元技術(shù)在微流控芯片上得以實現(xiàn)，因而在分子質(zhì)量測定、氨基酸序列分析、免疫檢測及腫瘤細胞篩選等多個研究領(lǐng)域中得以廣泛應(yīng)用。Lyons 等[56]將特異性抗體（如上皮細胞黏附因子）固定于微流控通道表面，利用熒光反射技術(shù)實現(xiàn)對分析物分子的無標記連續(xù)檢測，通過受體與親和蛋白結(jié)合從而篩選分離出腫瘤細胞，該研究表明人體轉(zhuǎn)鐵蛋白受體CD71 可以篩選出許多不能被特異性抗體捕獲的癌癥亞型。

2.4 仿生研究

隨著微流控芯片加工和流體控制技術(shù)的日益精湛，以及組織工程、生物材料等前沿技術(shù)的發(fā)展，仿生微流控器官芯片逐漸成為一個新興研究領(lǐng)域。器官芯片憑借其方便靈敏、可操作性強、高通量等優(yōu)勢，成為目前適用于進行腫瘤生物學(xué)研究的新平臺[57-58]。通過在微型芯片上建立能夠模擬人體器官主要功能的仿生系統(tǒng)，并加入高通量檢測功能，從而使其成為一種高效、可控、能在細胞層次上深刻闡釋疾病機制的研究工具。這種技術(shù)比起傳統(tǒng)的耗時長、不可量化的動物模型更適用于藥物篩選、藥物安全性分析、理化微環(huán)境研究等[59]。目前國內(nèi)外學(xué)者構(gòu)建了具備關(guān)鍵生理結(jié)構(gòu)及功能的仿生芯片，如仿生肝、仿生肺、仿生腎[60-62]等，并應(yīng)用于腫瘤學(xué)基礎(chǔ)研究。通過模擬器官的組織結(jié)構(gòu)與機能，可以高效快速地進行生理機制研究、藥理毒理評價以及代謝過程的動態(tài)監(jiān)測。Kong 等[63]以微流控芯片為平臺構(gòu)建了腫瘤肺、肝、骨等多器官轉(zhuǎn)移模型，在芯片模型上考察了肺、肝、骨、骨骼肌等原代細胞誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移，結(jié)果表明腫瘤細胞趨向于轉(zhuǎn)移至仿生肺、肝、骨等單元，而很少轉(zhuǎn)移至仿生骨骼肌單元。通過仿生芯片模型有助于明確影響腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素，以及篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。

3 展望

微流控芯片因其能將微型、可控的操作單元靈活組合并規(guī)模集成的特征以及可以實現(xiàn)高通量多通道平行測試的能力，越來越多地應(yīng)用于細胞培養(yǎng)、細胞分選等生物學(xué)研究和疾病診斷、藥物篩選、食品安全等領(lǐng)域?；谖⒘骺匦酒募毎囵B(yǎng)技術(shù)能夠模擬人體微環(huán)境進行復(fù)雜的代謝和調(diào)控，在揭示多細胞生物生理和病理過程中具有重要意義。多學(xué)科、多方法結(jié)合、多單元集成使微流控細胞培養(yǎng)技術(shù)從簡單的多細胞模型逐步向類器官的方向發(fā)展，在系統(tǒng)級別上模擬多器官的相互作用和生理反應(yīng)等生物醫(yī)學(xué)方面取得了極大的研究進展，并可通過進一步改進及加強，將新藥發(fā)掘與篩選與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，基于芯片平臺大量篩選對腫瘤細胞有特異性、非特異性抑制作用的藥物，并對其作用機制進行闡明，在疾病分析、發(fā)病機制研究、藥物篩選以及臨床治療等方面有著良好的應(yīng)用前景。

雖然微流控技術(shù)已取得了飛速的發(fā)展和顯著的進步，但仍然有很大的發(fā)展空間。一方面，目前大多數(shù)基于芯片技術(shù)的細胞生物學(xué)是對傳統(tǒng)細胞研究方法的更新與改進，相比微流控技術(shù)相對較高的制作要求，生物學(xué)家更傾向于選擇已成熟且有效的傳統(tǒng)技術(shù)。因此微流控需要有更好的生物學(xué)兼容性，加強多學(xué)科人員間的合作；力求在一些研究領(lǐng)域發(fā)揮微流控技術(shù)的獨特優(yōu)勢，比如設(shè)備要求較低的即時診斷、生物樣品的快速檢測以及生理相關(guān)性體外模型的構(gòu)建等，從而加速其在主流細胞研究中的應(yīng)用[64-65]。另一方面，微流控細胞水平高通量藥物篩選尚未達到商品化和通用化的程度，多數(shù)系統(tǒng)還難以在超微量和高通量水平下，完成從細胞陣列的形成、培養(yǎng)到加藥和檢測等全過程操作的自動化[28]。怎樣實現(xiàn)細胞的精準量取與分配以及自動快速的高通量篩選結(jié)果檢測，是下一步在實現(xiàn)微流控藥物篩選系統(tǒng)實用化中需要思考的問題。

總之，隨著芯片制作技術(shù)的不斷成熟和各種新型材料的不斷開發(fā)，微流控技術(shù)已經(jīng)成為細胞生物學(xué)研究和細胞分析中非常有力的工具。其未來發(fā)展會更傾向于集成化和體內(nèi)環(huán)境模擬的真實化，結(jié)合材料、化學(xué)、電子工程等不同學(xué)科優(yōu)勢，在單個芯片上構(gòu)成具有多功能集成體系、多復(fù)合體系的微全分析系統(tǒng)，并著力于發(fā)展細胞的三維共培養(yǎng)技術(shù)，從而在微流控芯片內(nèi)部更好的模擬腫瘤微環(huán)境。微流控技術(shù)將不斷為細胞研究帶來革新，進而實現(xiàn)在生物探索、疾病研究、藥物篩選、臨床治療等方面的實際應(yīng)用。