李爽，黃晶，叢志新，谷福根（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110）

左乙拉西坦（levetiracetam）是一種新型廣譜抗癲癇藥物，臨床主要用于難治性癲癇的添加治療[1]。與其他抗癲癇藥物相比，左乙拉西坦具有選擇性高、不良反應(yīng)少、耐受性好等特點(diǎn)[2-3]。左乙拉西坦上市劑型有片劑、口服溶液、注射液等?？诜苿┪掌鹦л^慢，注射劑使用不便，且上述兩種給藥途徑均因血腦屏障的存在以及該藥物極性大等原因，導(dǎo)致進(jìn)入腦組織內(nèi)藥量少，其臨床療效受到一定程度影響[4]。鼻腔給藥具有吸收快、生物利用度高、給藥方便以及腦靶向性遞藥等特點(diǎn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物治療中已顯示良好的臨床應(yīng)用前景[5-6]。因此，本文在前期完成左乙拉西坦的pH 敏感鼻用凝膠劑的處方優(yōu)化[7]及其在動(dòng)物體內(nèi)生物利用度研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察該藥物鼻用新制劑在大鼠腦組織內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)并初步評(píng)價(jià)其腦靶向性，旨在為今后研究開(kāi)發(fā)左乙拉西坦鼻腔給藥新制劑提供重要理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；VORTEX-5 旋渦混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；KQ5200E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；H1750R 高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；Arioso UP 900超純水器（韓國(guó)Human 公司）。

1.2 試藥

左乙拉西坦對(duì)照品（湖北威德利化學(xué)科技有限公司，純度：99.0%，批號(hào)：WDL180212）；左乙拉西坦pH 敏感鼻用凝膠（自制，批號(hào)：20200709，濃度為1.0%）；甲硝唑?qū)φ掌罚▋?nèi)標(biāo)，北京索萊寶科技有限公司，純度：98%，編號(hào)：SM8460）；生理鹽水（石家莊四藥有限公司，批號(hào)：1808073402）；乙酸乙酯（分析純，天津新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)科茂化學(xué)試劑有限公司）；乙腈、甲醇均為色譜純，水均為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD 大鼠，體質(zhì)量200 ～250 g [內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蒙）2016-0001]。

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜條件[8]

色譜柱：InertSustainC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；保護(hù)柱：Wonda Sil C18（10 mm×4 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（11∶89，V/V）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm，進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 腦樣品處理[9]

按質(zhì)量與體積之比1∶3 加入生理鹽水，在冰水浴條件下，將大鼠全腦進(jìn)行勻漿，勻漿液以11 000 r·min－1離心5 min，取上清液100 μL 置于EP 管中，分別加入甲醇40 μL，7 μg·mL－1甲硝唑水溶液20 μL，旋渦混合30 s，再加入乙酸乙酯1000 μL，旋渦混合3 min，以11 000 r·min－1離心3 min，取上清液于另一EP 管中，45 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00 μL 流動(dòng)相復(fù)溶，再以11 000 r·min－1離心3 min，取上清液進(jìn)樣。

2.3 專(zhuān)屬性考察

分別取空白腦勻漿，空白腦勻漿加左乙拉西坦對(duì)照品，左乙拉西坦經(jīng)鼻腔與灌胃給藥30 min 后腦勻漿樣品各100 μL。按“2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，在該色譜條件下，左乙拉西坦保留時(shí)間為7.2 min，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為8.6 min，兩者分離良好，且無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 左乙拉西坦在大鼠腦勻漿中HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatograms of levetiracetam in the rat cerebral tissues

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

精密稱(chēng)取左乙拉西坦對(duì)照品約5.0 mg，加水制得100 μg·mL－1的左乙拉西坦儲(chǔ)備液。再用水稀釋?zhuān)謩e配制為1.2、2.4、4.8、6.0、12.0、24.0、36.0 μg·mL－1的系列對(duì)照品溶液。取大鼠空白腦勻漿100 μL，分別加入上述對(duì)照品溶液20 μL，制得質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 μg·mL－1的系列腦勻漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定。以左乙拉西坦的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，藥物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)，作線(xiàn)性回歸，求得回歸方程為：Y＝0.2868X＋0.021，r＝0.9995，表明左乙拉西坦在0.2 ～6.0 μg·mL－1內(nèi)與峰面積比呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 精密度考察

取空白腦勻漿100 μL，同法配制0.4、1.0、4.0 μg·mL－1的左乙拉西坦腦勻漿質(zhì)控樣品，各5 份，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，日內(nèi)重復(fù)測(cè)定5 次，連續(xù)測(cè)定5 d，結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度的日內(nèi)RSD分別為2.0%、1.0%、1.7%，日間RSD分別為1.1%、2.1%、1.4%，表明該方法精密度良好。

2.6 回收率的考察

配制質(zhì)量濃度分別為0.4、1.0、4.0 μg·mL－1的左乙拉西坦腦勻漿質(zhì)控樣品，各5 份，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算方法的相對(duì)回收率和提取回收率，結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度的相對(duì)回收率分別為（91.96±0.02）%、（96.44±0.03）%、（106.54±0.01）%，RSD分別為2.2%、3.4%、0.89%，提取回收率分別為（97.12±0.02）%、（94.37±0.03）%、（89.38±0.02）%，RSD分別為1.9%、3.1%、2.7%，滿(mǎn)足生物樣品分析要求。

2.7 檢測(cè)限和定量限

將藥物濃度逐步遞減，制備系列不同濃度左乙拉西坦腦勻漿樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以信噪比S/N＝3 作為檢測(cè)限，S/N＝10 作為定量限。結(jié)果該方法檢測(cè)限為0.2 μg·mL－1，定量限為0.8 μg·mL－1。

2.8 樣品穩(wěn)定性考察

配制質(zhì)量濃度分別為0.4、1.0、4.0 μg·mL－1的左乙拉西坦腦勻漿樣品，分別在室溫下放置24 h，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后在進(jìn)樣室放置24 h，凍-融循環(huán)3 次，－20℃冷凍放置5 d，考察樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果腦勻漿樣品在上述不同條件下放置，各濃度樣品的RSD均＜5%，表明該藥物腦勻漿樣品具有較好的穩(wěn)定性。

2.9 大鼠腦組織中藥動(dòng)學(xué)研究

取SD 大鼠56 只，隨機(jī)均分為鼻腔給藥組與灌胃給藥組，灌胃給藥組實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。灌胃給藥組給予0.1%左乙拉西坦溶液（臨用前蒸餾水配制），劑量為10.0 mg·kg－1。鼻腔給藥組給藥方法見(jiàn)文獻(xiàn)[5]，劑量為1.0 mg·kg－1。兩組均分別于給藥5、15、30 min，1.0、2.0、4.0、6.0 h 后將動(dòng)物斷頭處死，分離全腦組織，依照“2.2”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定。

根據(jù)動(dòng)物腦組織質(zhì)量和勻漿時(shí)所加生理鹽水體積，將大鼠腦勻漿中藥物質(zhì)量濃度單位μg·mL－1換算成μg·g－1后，計(jì)算均值并繪制腦組織藥物濃度-時(shí)間曲線(xiàn)圖。根據(jù)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)，直接讀取左乙拉西坦在腦組織中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)tmax與Cmax值，AUC0～t采用梯形面積法計(jì)算，AUCt～∞采用公式：AUCt～∞＝Ct/ke，進(jìn)行計(jì)算，式中，Ct為最后一個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)所測(cè)腦組織中藥物濃度，ke為消除速率常數(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖2，求得左乙拉西坦在腦組織中的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。可見(jiàn)，左乙拉西坦的pH 敏感鼻用凝膠經(jīng)鼻腔給藥后，藥物進(jìn)入大鼠腦組織中的速度很快，其tmax約為30 min，遠(yuǎn)小于灌胃途徑的1.25 h。參照血中藥物相對(duì)生物利用度（Fr）計(jì)算方法[10]，以左乙拉西坦溶液灌胃給藥為參比，求得該藥物pH敏感鼻用凝膠劑在腦組織中的Fr為476.83%。

圖2 左乙拉西坦鼻腔和灌胃給藥后在大鼠腦組織中平均藥物濃度-時(shí)間曲線(xiàn)（n ＝4）Fig 2 Mean drug concentration-time curves in brain tissues after the nasal and intragastric administration of levetiracetam to rats（n ＝4）

表1 左乙拉西坦鼻用凝膠劑及其溶液在大鼠腦組織中的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(x±s，n ＝4)Tab 1 Main pharmacokinetic parameters in the brain tissues after the administration of levetiracetam nasal gel and solution in rats (x ±s，n＝4)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本文首次嘗試建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度較高的動(dòng)物腦組織中藥物濃度的HPLC 測(cè)定方法。在色譜條件摸索中，作者曾使用柱長(zhǎng)僅為150 mm 的Wondasil C18反相柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物及內(nèi)標(biāo)峰形較差，并有內(nèi)源性物質(zhì)干擾，后更換柱長(zhǎng)為250 mm 的InertSustain C18反相柱，結(jié)果藥物及內(nèi)標(biāo)峰形明顯改善，也消除了內(nèi)源性物質(zhì)干擾，究其原因，可能與色譜柱過(guò)短導(dǎo)致各成分分離時(shí)間不足以及不同廠(chǎng)家柱內(nèi)填料存在差異有關(guān)。此外，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，曾使用磷酸鹽緩沖液（pH 4.0）-乙腈（93∶7）作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)藥物峰形較差，并有內(nèi)源性物質(zhì)干擾，后換乙腈-水（11∶89）為流動(dòng)相，結(jié)果藥物及內(nèi)標(biāo)峰形良好，保留時(shí)間適宜，也無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾測(cè)定。此外，在內(nèi)標(biāo)篩選中，作者曾選擇鹽酸小檗堿、氫溴酸西酞普蘭、鹽酸多奈哌齊以及甲硝唑作為內(nèi)標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前3 種候選內(nèi)標(biāo)物與藥物峰幾乎重疊，經(jīng)多次調(diào)整流動(dòng)相組成比例，兩者仍無(wú)法達(dá)到基線(xiàn)分離，而當(dāng)用甲硝唑作為內(nèi)標(biāo)時(shí)，可實(shí)現(xiàn)與藥物峰的完全分離，且其峰形良好，保留時(shí)間適宜，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。因此，本文最后選擇甲硝唑作為內(nèi)標(biāo)。在大鼠腦勻漿的前處理過(guò)程中，曾采用甲基叔丁基醚、乙醚、二氯甲烷、甲醇、乙腈等作為萃取劑或蛋白沉淀劑，結(jié)果均不理想，后參考文獻(xiàn)[11]換用乙酸乙酯為萃取劑，提取回收率較理想。

3.2 給藥劑量的選擇

左乙拉西坦臨床單次口服劑量一般為500 mg，按體表面積換算為大鼠灌胃給藥劑量為45 mg·kg－1，文獻(xiàn)[4]中左乙拉西坦經(jīng)小鼠鼻腔給藥劑量為25 mg·kg－1，換算為大鼠鼻腔給藥劑量為18 mg·kg－1，本研究中灌胃給藥劑量10 mg·kg－1，僅約為理論折算劑量的1/5，鼻腔給藥劑量為1.0 mg·kg－1，為文獻(xiàn)報(bào)道劑量的1/20。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鼻腔給藥與灌胃給藥劑量相同時(shí)，腦組織樣品中左乙拉西坦的濃度遠(yuǎn)超標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)濃度的上限，測(cè)定前需要對(duì)樣品進(jìn)行稀釋處理，為了使兩種給藥途徑腦樣品中藥物濃度盡量采用同一標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)定量，研究中將鼻腔給藥劑量減少至灌胃劑量的1/10。

3.3 腦靶向性評(píng)價(jià)

左乙拉西坦只有進(jìn)入腦組織內(nèi)才能發(fā)揮治療癲癇的作用，口服與注射途徑給藥，藥物均必須由血液循環(huán)透過(guò)血腦屏障才能入腦。親脂性的藥物，更易透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)，而親水性藥物不易透過(guò)血腦屏障[12]。由于左乙拉西坦屬于親水性藥物，極性大，導(dǎo)致其不易透過(guò)血腦屏障，故上述途徑給藥后，入腦速度慢且藥量少。本研究發(fā)現(xiàn)，左乙拉西坦的pH 敏感鼻用凝膠經(jīng)鼻腔給藥后，藥物在大鼠腦組織中的tmax顯著小于灌胃給藥，表明其入腦速度快于灌胃給藥。采用腦組織中藥物生物利用度指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)鼻腔給藥制劑的腦靶向性早有報(bào)道[13]，本文中左乙拉西坦鼻用凝膠在腦組織中的Fr高達(dá)476.83%，表明該制劑具有腦靶向性[14]，此結(jié)果也與文獻(xiàn)報(bào)道[4]一致。鑒于左乙拉西坦在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)具有呈線(xiàn)性特性[15-16]，且本研究鼻用給藥劑量?jī)H為灌胃給藥1/10 時(shí)，但鼻腔給藥后測(cè)得藥物在腦中的Cmax、AUC0～t以及AUC0～∞約為灌胃給藥途徑的1/2，因此，預(yù)測(cè)給藥劑量相同時(shí)，pH 敏感鼻用凝膠經(jīng)鼻腔給藥腦組織中藥物的Cmax、AUC0～t以及AUC0～∞值將遠(yuǎn)大于灌胃給藥。表明左乙拉西坦鼻用制劑具有明顯腦靶向性，其主要機(jī)制可能為：一方面該制劑給藥后，在鼻腔可快速形成不可流動(dòng)的半固體凝膠形式，在鼻腔滯留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，藥物在體內(nèi)生物利用度改善，血腦屏障兩側(cè)藥物濃度梯度增大，導(dǎo)致藥物由血循環(huán)透過(guò)血腦屏障入腦藥量增加[17-18]；另一方面，鼻腔給藥后，部分藥物可繞開(kāi)血腦屏障，在鼻腔嗅區(qū)沿嗅神經(jīng)-嗅球通路直接入腦，即腦靶向遞送藥物[19]。綜上所述，本文中左乙拉西坦pH 敏感鼻用凝膠劑具有給藥方便、入腦速度快、腦靶向性強(qiáng)等特點(diǎn)，預(yù)期有良好的臨床應(yīng)用前景。