華若辰，拓文靜，宋自娟，劉建書，盧聞*（.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，西安 7006；.陜西省功能食品工程技術(shù)研究中心，西安 70054）

中藥提取是中成藥及中藥相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)的重要工藝環(huán)節(jié)，優(yōu)良的中藥提取工藝可以降低成本，減少對(duì)環(huán)境的污染，提高提取效率。目前對(duì)于中藥提取工藝的研究多采用正交[1-3]或均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)[4]，設(shè)置料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等考察因素和水平，以浸膏得率和指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，評(píng)價(jià)和篩選提取工藝[5-6]。然而，中藥來(lái)源廣泛、組成復(fù)雜，容易造成產(chǎn)品執(zhí)行生產(chǎn)時(shí)出現(xiàn)較大偏差，質(zhì)量波動(dòng)大，因此，建立較為全面的綜合評(píng)價(jià)方法非常有必要。沙棘銀花顆粒是由金銀花、沙棘、甘草3種藥食同源藥材組成的中藥組方。本文以提取溶劑種類、用量和提取時(shí)間為考察因素，結(jié)合HPLC 特征圖譜定性分析、相似度分析、聚類分析及指標(biāo)成分定量分析，建立一種沙棘銀花顆粒提取工藝及過(guò)程研究的綜合評(píng)價(jià)方法。

1 試藥

維采寧-2（批號(hào)：HR1254W1）、異綠原酸B（批號(hào)：H1021136198）、芹糖甘草苷（批號(hào)：HR12311W2）（寶雞市辰光生物科技有限公司，純度均為98%）；槲皮素（批號(hào)：100081-200907，純度：97.5%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甘草、金銀花、沙棘均購(gòu)自北京同仁堂（西安小寨店，經(jīng)西安交通大學(xué)藥學(xué)院牛曉峰教授鑒定為正品）。色譜甲醇（美國(guó)TEDIA 試劑公司）；試驗(yàn)用水為超純蒸餾水（優(yōu)普超純水機(jī)制備）；其他分析純?cè)噭┡c試藥購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

取維采寧-2、芹糖甘草苷、異綠原酸B 和槲皮素對(duì)照品，精密稱定，甲醇溶解并制成維采寧-2、異綠原酸B 和槲皮素質(zhì)量濃度均為100.0 μg·mL－1、芹糖甘草苷質(zhì)量濃度為1.00 mg·mL－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量置100 mL 量瓶中，甲醇稀釋、定容，制得含維采寧-2 為2.0 μg·mL－1、異綠原酸B為3.0 μg·mL－1、槲皮素為1.0 μg·mL－1、芹糖甘草苷為40.0 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

金銀花、甘草、沙棘經(jīng)粉碎后，稱定金銀花粗粉7.0 g、沙棘粗粉6.0 g、甘草粗粉3.0 g，置圓底燒瓶中，加入提取溶劑，稱定質(zhì)量，回流提?。ㄌ崛∪軇┓N類、用量及提取時(shí)間見(jiàn)表1）?；亓鹘Y(jié)束放至室溫，稱定質(zhì)量，新鮮提取溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，減壓回收溶劑。濃縮至干，稱定所得干膏質(zhì)量。按如下公式計(jì)算浸膏得率：

表1 提取工藝參數(shù)Tab 1 Extraction process parameters

浸膏得率（%）＝浸膏量/生藥投入量×100%

粉碎所得干膏，取適量，精密稱定，置量瓶中，甲醇超聲溶解，室溫定容，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

應(yīng)用LC-2030C 3D 高效液相色譜儀（SHIMADZU，Japan）和LC Solution 色譜工作站進(jìn)行HPLC分析。色譜柱：Diamonsil C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）（美國(guó)Welch 公司）；流動(dòng)相：0.02%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（見(jiàn)表2）；流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：維采寧-2 為339 nm，芹糖甘草苷為276 nm，異綠原酸B 為327 nm，槲皮素為304 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution program

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批（S2）供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.5%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.4%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（S2）供試品粉末6份，精密稱定，甲醇溶解定容，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2.1%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.7%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批（S2）供試品溶液，分別于0、4、8、12 和24 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2.2%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.9%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 HPLC 特征圖譜建立

取各工藝所得樣品（S1 ～S7），按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。將所得色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012A，以S1 為參照?qǐng)D譜，中位數(shù)法生成7 組樣品的對(duì)照特征圖譜，通過(guò)多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，確定20 個(gè)共有峰，HPLC 特征圖譜疊加圖見(jiàn)圖1。以共有峰2 為參照峰，計(jì)算20 個(gè)共有峰的相對(duì)保留值，相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.7%，而共有峰的相對(duì)峰面積RSD值波動(dòng)較大，除參照峰2 外，跨度在11.5%～214.5%，可見(jiàn)峰面積受提取工藝影響較大。

圖1 7 種工藝提取物HPLC 特征圖譜疊加圖（248 nm）Fig 1 HPLC characteristic chromatogram of extraction products from 7 extraction processes（248 nm）

2.6 相似度評(píng)價(jià)

利用指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件[7]進(jìn)行相似度分析，結(jié)果表明，7 種工藝整體相似度高于0.80，其中醇提工藝S1 與S2 相似度大于0.99，水提工藝S3 ～S7 相似度均大于0.98，見(jiàn)表3。

表3 7 種工藝提取物相似度Tab 3 Similarity of 7 extraction processes

2.7 聚類分析

采用系統(tǒng)聚類分析法[8]對(duì)7 種工藝的色譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，以保留時(shí)間為7.84 min 的2 號(hào)峰為參照峰，計(jì)算20 組共有峰的相對(duì)峰面積（見(jiàn)表4）。將20 組相對(duì)峰面積導(dǎo)入SPSS 23 軟件，采用組間連接法，以歐式距離作為測(cè)度，得到水平方向上的聚類分析譜系圖（見(jiàn)圖2），觀察7 種工藝之間的差異。聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)分類距離為25 時(shí)，醇提工藝（S1、S2）和水提工藝（S3、S4、S5、S6、S7）分別聚為一類；當(dāng)分類距離小于20 時(shí)，水提工藝中的S7 單獨(dú)為一小類，S3、S4、S5、S6 為另一小類。

表4 7 種工藝提取物HPLC 特征圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Tab 4 Relative area of HPLC characteristic chromatogram common peaks of 7 extraction processes

圖2 7 種工藝聚類分析譜系圖Fig 2 Cluster analysis diagram of fingerprint for 7 extraction processes

2.8 指標(biāo)成分含量測(cè)定

定量分析了7 種工藝提取的浸膏得率和3 味藥材中指標(biāo)成分（維采寧-2、芹糖甘草苷、異綠原酸B 和槲皮素）含量（見(jiàn)圖3），根據(jù)浸膏中指標(biāo)成分含量計(jì)算生藥中的指標(biāo)成分含量，見(jiàn)表5。S4 ～S6 浸膏得率相近且較高；S1、S3 和S7 的浸膏得率相近且次之于S4 ～S6；S2 浸膏得率最低。以生藥量為基準(zhǔn)的指標(biāo)成分含量比較，維采寧-2 以工藝S4 得率最高，S2 最低；芹糖甘草苷以工藝S1 得率最高，S7 最低；異綠原酸B 以工藝S4 得率最高，S1 最低；槲皮素含量以工藝S2 最高，S6 最低。綜上分析可知，工藝S4 所得提取浸膏中維采寧-2 和異綠原酸B 成分含量為7 種工藝中最高；所得芹糖甘草苷和槲皮素含量?jī)H次于工藝S1 和S2，但均高于工藝S3 以及S5 ～S7。

表5 浸膏得率及指標(biāo)成分含量Tab 5 Extraction yield and principal component content

圖3 指標(biāo)成分HPLC 圖Fig 3 HPLC fingerprint of principal components

3 討論

中藥指紋圖譜是一種國(guó)內(nèi)外廣泛接受的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，可以作為現(xiàn)代中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的核心技術(shù)和基石[9-10]。隨著《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》的推行實(shí)施，以及分析儀器和技術(shù)的不斷更新，中藥指紋圖譜技術(shù)已應(yīng)用到中藥材及中藥產(chǎn)品的生產(chǎn)、加工、貯存和流通各環(huán)節(jié)的質(zhì)量監(jiān)控[11-12]。然而，單一的指紋圖譜分析在中藥質(zhì)量監(jiān)控上顯得不足，應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)結(jié)合指標(biāo)成分定量的評(píng)價(jià)方法逐漸成為主流[13-14]。近年來(lái)，指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別的分析方法作為新的評(píng)價(jià)方法已應(yīng)用到中藥質(zhì)量監(jiān)控[15-16]。基于此，本文采用HPLC 特征圖譜定性分析和指標(biāo)成分定量分析，結(jié)合模式識(shí)別，對(duì)沙棘銀花顆粒提取工藝進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

本文采用梯度洗脫程序和二極管陣列檢測(cè)進(jìn)行HPLC 圖譜的共有峰識(shí)別和指標(biāo)成分定量分析，運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)分析7 種工藝所得沙棘銀花浸膏的特征圖譜，并確定了20個(gè)共有峰。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行相似度及聚類分析，結(jié)果水提、醇提工藝分別聚為一類，可知提取溶劑是工藝差異的主要影響因素；而在水提工藝中，S3、S4、S5 和S6 的共有峰相對(duì)峰面積較為接近。綜合浸膏得率和指標(biāo)成分定量分析可知，工藝S4在7 種工藝中有相對(duì)高的成分轉(zhuǎn)移率，即12 倍量水為提取溶劑，提取時(shí)間為2 h。

進(jìn)一步分析考察因素的影響，不同提取溶劑工藝S1、S2 和S3（75%乙醇、95%乙醇和水），S1和S2 有較高相似度，而指標(biāo)成分維采寧-2 和芹糖甘草苷以S1 轉(zhuǎn)移率為高，指標(biāo)成分異綠原酸B 以S3 轉(zhuǎn)移率為高，槲皮素以S2 轉(zhuǎn)移率為高；不同提取溶劑用量工藝S3、S7 和S5（8、12 和15 倍量），三者的相似度較高，指標(biāo)成分維采寧-2、芹糖甘草苷和異綠原酸B 轉(zhuǎn)移率以S5 為高；不同提取時(shí)間工藝S7、S4 和S6（1 h、2 h 和3 h），三者同樣有較高的相似度，4 種指標(biāo)成分以S4 轉(zhuǎn)移率為高。

綜上，本文以基本的提取工藝參數(shù)為考察，應(yīng)用HPLC 特征圖譜定性分析結(jié)合相似度、聚類分析和指標(biāo)成分定量分析，對(duì)沙棘銀花顆粒提取工藝進(jìn)行了多指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)，可為指紋圖譜技術(shù)在中藥產(chǎn)品各環(huán)節(jié)的拓展應(yīng)用提供參考。