馬穎超，董維沖，吳瑕，楊秀嶺（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 050000）

黏菌素（又稱(chēng)多黏菌素E）是一種含多種組分的陽(yáng)離子多肽類(lèi)抗菌藥物，于1950年從大腸埃希菌中分離得到，其結(jié)構(gòu)是脂肪酸鏈通過(guò)酰胺鍵與陽(yáng)離子十肽環(huán)連接。黏菌素主要成分為多黏菌素E1（C53H100N16O13）和多黏菌素E2（C52H98N16O13），兩者區(qū)別僅是脂肪酸側(cè)鏈相差一個(gè)甲基，多黏菌素E1為6-甲基辛酸，多黏菌素E2為6-甲基庚酸[1]，這兩種成分占黏菌素總含量的85%以上[2]，決定其主要血藥濃度和臨床抗菌活性[3]。硫酸黏菌素，原名硫酸抗敵素，又稱(chēng)硫酸多黏菌素E，是1966年我國(guó)自主研發(fā)的抗菌藥物。硫酸黏菌素與多黏菌素E 甲磺酸鹽不同，無(wú)需轉(zhuǎn)化，直接殺菌。因市場(chǎng)用量少，曾經(jīng)停產(chǎn)。近年來(lái)，由于臨床耐藥菌的廣泛出現(xiàn)，硫酸黏菌素對(duì)多重耐藥及泛耐藥革蘭氏陰性桿菌特別是銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌有強(qiáng)大的抗菌活性，被作為治療這些多重耐藥菌感染的最后一道防線，于2018年重新上市，用于危重患者嚴(yán)重感染的治療[4]。但由于其上市較早，未經(jīng)歷過(guò)現(xiàn)代藥物開(kāi)發(fā)程序，早期的藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)、毒理學(xué)等資料非常有限，缺少指導(dǎo)臨床使用的相關(guān)信息。其治療窗窄，不良反應(yīng)發(fā)生率高[5-6]，尤其在重癥感染患者中，臨床個(gè)體差異大，需要進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)[7]，以便實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥。本文建立一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測(cè)定人血漿中硫酸黏菌素主要成分多黏菌素E1和多黏菌素E2的濃度，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

LC-20C 高效液相色譜儀（日本島津），API4000＋三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（Applied Biosystem，美國(guó)），離心機(jī)（德國(guó)ABBOTT），渦旋混合器（XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠），低溫冰箱（MDF-U2086S，日本三洋），冷藏柜（YC-180，澳柯瑪），電子分析天平（CPA225D，德國(guó)Sartorius）。

1.2 試藥

硫酸黏菌素對(duì)照品（含量：95.1%，批號(hào)：833621）、內(nèi)標(biāo)硫酸多黏菌素B（含量：88.1%，批號(hào)：174224）（德國(guó)Dr Ehrenstorfer 公司）；人血漿（河北省血液中心）；甲酸（色譜純，上海Aladdin）；乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher 公司）；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）。流動(dòng)相A：水（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B：乙腈（含0.1%甲酸），梯度洗脫（0 ～1 min，95%A；1～5 min，25%A；5～7 min，5%A；7 ～9 min，95%A）；流速：0.8 mL·min－1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），多重反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）正離子模式，噴霧電壓（IS）：5500 V，離子源溫度（TEM）：550℃，氣簾氣壓力（CUR）：10 psi，霧化器壓力（GAS1）：55 psi，輔助氣壓力（GAS2）：55 psi，碰撞氣壓力（CAD）：4 psi。多黏菌素E1、多黏菌素E2和內(nèi)標(biāo)多黏菌素B 的定量離子對(duì)分別為m/z585.7 →101.2、m/z578.8 → 101.2 和m/z602.7 → 241.4，去簇電壓（DP）分別為61 V、59 V 和68 V，碰撞電壓（CE）分別為47 V、49 V 和33 V。

2.3 對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱(chēng)取硫酸黏菌素、硫酸多黏菌素B 對(duì)照品各20 mg，分別置于10 mL 量瓶中，用20%甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為2 mg·mL－1的硫酸黏菌素儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密量取硫酸黏菌素儲(chǔ)備液適量，以20%甲醇逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg·mL－1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液和質(zhì)量濃度為1、10、80 μg·mL－1的質(zhì)控工作液，用20%甲醇稀釋內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液為40 μg·mL－1作為內(nèi)標(biāo)工作液，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血漿樣品處理

取血漿200 μL，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)工作液（40 μg·mL－1），渦旋混勻后加入400 μL 甲醇-5%三氯乙酸（50∶50，V/V），渦旋2 min，10 900 r·min－1離心5 min，取上清液200 μL 進(jìn)樣。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專(zhuān)屬性 取人空白血漿、人空白血漿＋硫酸黏菌素對(duì)照品儲(chǔ)備液（5 μg·mL－1）＋內(nèi)標(biāo)工作液（40 μg·mL－1）、臨床患者用藥后血漿樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理分析。結(jié)果多黏菌素E1、多黏菌素E2和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為5.64、5.54和5.68 min。峰形良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)在待測(cè)物保留時(shí)間處無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 硫酸黏菌素的HPLC-MS/MS 色譜圖Fig 1 HPLC-MS/MS chromatogram of colistin sulfate

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限 將“2.3”項(xiàng)下配制好的硫酸黏菌素系列標(biāo)準(zhǔn)工作液分別加入到空白血漿中制備成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，以多黏菌素E1和多黏菌素E2總濃度為橫坐標(biāo)，多黏菌素E1和多黏菌素E2總峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，以加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，得硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝1.851x－0.059（r＝0.9982），在0.1 ～10 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。定量限（LOQ）為0.1 μg·mL－1。

2.5.3 精密度與準(zhǔn)確度 取“2.3”項(xiàng)下硫酸黏菌素系列質(zhì)控工作液，分別加入到空白血漿中制得低（0.1 μg·mL－1）、中（1 μg·mL－1）、高（8 μg·mL－1）質(zhì)控工作液，按“2.4” 項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度平行做5 份，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算日內(nèi)和日間精密度、準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(n ＝5)Tab 1 Precision and accuracy tests (n ＝5)

2.5.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取“2.5.3”項(xiàng)下3個(gè)濃度的質(zhì)控工作液，按“2.4” 項(xiàng)下方法處理，作為樣品A；取空白血漿進(jìn)行預(yù)處理后的上清液，加入系列質(zhì)控工作液，制得低、中、高質(zhì)控工作液，作為樣品B；另配制同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為樣品C，每個(gè)質(zhì)控濃度各5 份。將3 組樣品同法進(jìn)行HPLCMS/MS 分析，用樣品A 的峰面積與樣品C 的峰面積比計(jì)算提取回收率，樣品B 的峰面積與樣品C的峰面積比計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果(n ＝5)Tab 2 Extraction recovery and matrix effect (n ＝5)

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 制備低、中、高3 種質(zhì)量濃度硫酸黏菌素質(zhì)控血漿樣品，考察分別經(jīng)過(guò)室溫放置6 h 和24 h，自動(dòng)進(jìn)樣器15℃放置24 h，－20℃凍融循環(huán)3 次，－70℃冰箱放置30 d，按“2.4” 項(xiàng)下方法處理后測(cè)定血漿樣品的穩(wěn)定性，得到硫酸黏菌素濃度的RSD均在±15%，穩(wěn)定性符合相關(guān)要求，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n ＝5)Tab 3 Stability test (n ＝5)

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

用本研究所建方法檢測(cè)10 例患者硫酸黏菌素血藥谷濃度，平均年齡為（53.20±24.36）歲，給藥劑量按照說(shuō)明書(shū)規(guī)定靜脈滴注每次50 萬(wàn)IU，每12 h 給藥一次，其中3 例患者給予首劑加倍。硫酸黏菌素谷濃度應(yīng)在穩(wěn)態(tài)下進(jìn)行測(cè)定，其半衰期在腎功能正常的患者中為6 h，根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)理論，需經(jīng)過(guò)4 ～5 個(gè)半衰期達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度，故可在用藥2 ～3 d 達(dá)穩(wěn)態(tài)后取血測(cè)定，最終選定第7 劑給藥前30 min 采集血樣，測(cè)定硫酸黏菌素穩(wěn)態(tài)谷濃度，結(jié)果中最大濃度為1.44 μg·mL－1，最小濃度為0.25 μg·mL－1。同時(shí)抽取了其中兩例患者第7 劑給藥后15 ～30 min 血樣，測(cè)定硫酸黏菌素峰濃度，分別為1.96 μg·mL－1和1.79 μg·mL－1，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 10 例患者硫酸黏菌素峰谷濃度測(cè)定結(jié)果Tab 4 Cmax and Cmin of colistin sulfate in 10 patients

3 討論

3.1 硫酸黏菌素臨床應(yīng)用困惑

硫酸黏菌素曾因其腎毒性和神經(jīng)毒性遭到臨床棄用，僅應(yīng)用于獸藥中。但隨著多重耐藥菌感染在臨床逐漸增多，在新藥開(kāi)發(fā)有限的前提下，硫酸黏菌素又被重新應(yīng)用于臨床[8]。但由于硫酸黏菌素未經(jīng)歷過(guò)現(xiàn)代藥物開(kāi)發(fā)程序，缺乏合理應(yīng)用所需要的藥理學(xué)信息，目前對(duì)各類(lèi)患者特別是重癥患者，其給藥方案并沒(méi)有得到循證醫(yī)學(xué)的證實(shí)[9]；并且目前應(yīng)用較少，經(jīng)驗(yàn)不足，臨床醫(yī)師對(duì)硫酸黏菌素的使用存在很大困惑。一方面很多臨床醫(yī)師不完全清楚硫酸黏菌素的給藥劑量，原因是各藥企所生產(chǎn)的多黏菌素E 有著不同的標(biāo)簽和不同的給藥方案，有些為國(guó)際單位，有些標(biāo)有“多黏菌素E 基礎(chǔ)活性”的標(biāo)簽。這種在標(biāo)簽以及每日推薦劑量上的不一致，造成臨床醫(yī)師對(duì)多黏菌素E 的兩種常用劑型黏菌素甲磺酸鹽和硫酸黏菌素的使用劑量產(chǎn)生混亂，對(duì)硫酸黏菌素的臨床使用有著非常大的影響。另一方面，近年來(lái)很多研究指出硫酸黏菌素的腎毒性發(fā)生率和嚴(yán)重程度遠(yuǎn)低于早期臨床觀察結(jié)果，僅在聯(lián)用其他腎毒性藥物或劑量過(guò)高時(shí)可增加腎功能損害發(fā)生的可能性[10-12]。文獻(xiàn)報(bào)道，硫酸黏菌素導(dǎo)致的腎功能損害是可逆的，停藥后數(shù)周至數(shù)月內(nèi)可恢復(fù)[13]。盡管如此，在使用硫酸黏菌素時(shí)仍需密切監(jiān)測(cè)腎功能且避免聯(lián)用有腎毒性的藥物。藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)分析可明晰藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄，從而指導(dǎo)臨床用藥劑量和給藥方式，降低不良反應(yīng)發(fā)生率，因此，當(dāng)硫酸黏菌素被重新應(yīng)用于臨床后，對(duì)其進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)研究顯得越發(fā)重要。

3.2 硫酸黏菌素血藥濃度分析方法選擇

現(xiàn)有的多黏菌素E 血藥濃度分析方法有微生物法、免疫法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法[14]和高效液相色譜法（HPLC）[15]。微生物法樣本耗時(shí)多且缺乏特異性，免疫法免疫原制備復(fù)雜，分析成本高，薄層色譜法和毛細(xì)管電泳法重復(fù)性差，不具有普遍性[1]。由于多黏菌素E 最大吸收波長(zhǎng)為210 nm，有末端吸收，此波長(zhǎng)處流動(dòng)相中的有機(jī)相會(huì)有一定吸收，因此對(duì)檢測(cè)器靈敏度和流動(dòng)相要求苛刻。紫外檢測(cè)器會(huì)造成基線漂移，數(shù)據(jù)不可信。熒光檢測(cè)器雖然專(zhuān)屬性和靈敏度高，但由于多黏菌素E 沒(méi)有原生熒光，需要進(jìn)行提取和衍生化，操作繁瑣[16]。本文采用LC-MS/MS 法測(cè)定人血漿中硫酸黏菌素的濃度，靈敏度高，準(zhǔn)確度好，符合《中國(guó)藥典》生物樣本檢測(cè)方法的要求。

文獻(xiàn)[14-16]中對(duì)多黏菌素E 樣品前處理大多采用固相萃取法，但該技術(shù)操作繁瑣，不利于大量生物樣品的檢測(cè)，且固相萃取板價(jià)格昂貴。本研究采用蛋白沉淀樣品的前處理方式，簡(jiǎn)化了血漿預(yù)處理過(guò)程，節(jié)約了成本，適用于臨床大量樣本分析。在方法學(xué)優(yōu)化過(guò)程中考察了多種流動(dòng)相，包括水-甲醇、水-乙腈、水（含0.01%甲酸）-乙腈（含0.01%甲酸）、水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）、水（含0.5%甲酸）-乙腈（含0.5%甲酸）、水（含1%乙酸）-乙腈（含1%乙酸），最終選擇本文流動(dòng)相。通過(guò)加入0.1%甲酸使得多黏菌素E1和多黏菌素E2色譜峰峰形良好，響應(yīng)值得到改善。在洗脫方法研究中，選擇梯度洗脫，首先采用較低比例的有機(jī)相沖洗，讓極性物質(zhì)先流出色譜柱，保證了極性物質(zhì)和藥物先后流出，避免了基質(zhì)效應(yīng)的干擾，并通過(guò)調(diào)整初始有機(jī)相比例得到了較為合適的保留時(shí)間和峰形，提高了檢測(cè)靈敏度。在內(nèi)標(biāo)選擇中，選擇與黏菌素結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相似的多黏菌素B，保證完全分離的同時(shí)，又可以獲得相似的回收率、離子化效率和色譜保留行為，并且無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾和基質(zhì)效應(yīng)干擾。

3.3 硫酸黏菌素血藥濃度檢測(cè)結(jié)果分析

多黏菌素E 血藥濃度的高低與抗菌效果、腎毒性緊密相關(guān)，重癥患者體內(nèi)多黏菌素E 藥動(dòng)學(xué)變化大，血藥濃度監(jiān)測(cè)不僅能保證治療效果，也能降低腎臟損害的風(fēng)險(xiǎn)。2019年多黏菌素國(guó)際共識(shí)中建議[17]，多黏菌素E 的推薦靶值為穩(wěn)態(tài)時(shí)24 h 血漿藥時(shí)曲線下面積（AUCss，24h）達(dá)到50 mg·h·L－1，即穩(wěn)態(tài)平均血藥濃度（Css，avg）維持在2 μg·mL－1。該濃度被認(rèn)為是能耐受的最高暴露量，高于此濃度將增加急性腎損傷的發(fā)生率和嚴(yán)重性。通過(guò)本研究方法檢測(cè)10 例患者硫酸黏菌素血藥谷濃度在0.25 ～1.44 μg·mL－1，谷濃度差異較大。其中5 號(hào)和8 號(hào)患者平均穩(wěn)態(tài)血藥濃度低于指南要求，患者硫酸黏菌素給藥劑量為50 萬(wàn)IU q12h，符合說(shuō)明書(shū)規(guī)定，且患者腎功能正常，但平均穩(wěn)態(tài)血藥濃度不能達(dá)標(biāo)，推測(cè)給藥劑量可能偏低，但由于本研究峰濃度樣本量較少，該結(jié)論尚需更多峰谷濃度測(cè)定來(lái)證實(shí)。另外，1 號(hào)和2 號(hào)患者采用首劑加倍給藥方案，其谷濃度分別為1.44 μg·mL－1和1.25 μg·mL－1，明顯高于未采用首劑加倍的患者。計(jì)算患者肌酐清除率，1、2 號(hào)患者均存在腎功能不全，硫酸黏菌素主要經(jīng)腎排泄，用藥后8 h 內(nèi)尿中排出用藥量的40%，腎功能不全者，藥物易在體內(nèi)蓄積，故血藥谷濃度升高是首劑加倍和腎功能不全兩者同時(shí)導(dǎo)致的。但與同樣腎功能不全、未采用首劑加倍的3、4、5 號(hào)患者相比，谷濃度也明顯升高，說(shuō)明首劑加倍可提高硫酸黏菌素的血藥濃度。

綜上，硫酸黏菌素體內(nèi)個(gè)體差異較大，患者腎功能情況可影響藥物排泄，說(shuō)明書(shū)規(guī)定50 萬(wàn)IU q12h 的給藥方案可能存在劑量不足，需采用首劑加倍的給藥方案來(lái)增加血藥濃度，提高臨床療效。但由于本研究納入病例數(shù)和取血點(diǎn)有限，其他影響硫酸黏菌素體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的因素尚需更大樣本量、更全面的臨床研究證實(shí)，本研究所建方法為進(jìn)一步研究硫酸黏菌素藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)性質(zhì)提供了參考。