楊奇濤，汪玉馨，吳殷囡，劉洋，孟長(zhǎng)虹，譚力，陸益紅，史清水（1.中國(guó)藥科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，南京 11198；.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 10019；3.徐州醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇 徐州 1004）

北柴胡作為常用的大宗藥材，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣之功效，其藥效成分以柴胡皂苷為主，還有少量其他成分，而在較多的柴胡皂苷同分異構(gòu)體中，柴胡皂苷A、D 的含量相對(duì)較高[1]。目前《中國(guó)藥典》一部中普遍用單一或幾個(gè)化學(xué)成分來(lái)對(duì)藥材、飲片及其制劑進(jìn)行定性和定量，這種方法忽略了中藥多組分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的特點(diǎn)，利用單一或幾個(gè)成分進(jìn)行評(píng)價(jià)和控制，不能正確衡量中藥的質(zhì)量與藥效，只有充分利用現(xiàn)代色譜、光譜、質(zhì)譜手段，特別是液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，才能實(shí)現(xiàn)在單次分析中對(duì)多個(gè)微量及痕量成分，包括同分異構(gòu)體的定性和定量分析[2-5]。

因此本研究利用HPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)對(duì)北柴胡水提液的有效成分群進(jìn)行表征，首先通過(guò)對(duì)各化合物進(jìn)行鑒定并獲得精確分子量以及充分的碰撞解離碎片信息，并對(duì)其二級(jí)裂解規(guī)律進(jìn)行了分析，從而鑒定出北柴胡水提液中的主要化學(xué)成分，為柴胡以及其相關(guān)制劑標(biāo)準(zhǔn)的制訂和體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。前期課題組曾對(duì)柴胡及其制劑正柴胡顆粒對(duì)對(duì)乙酰氨基酚（APAP）所致急性肝損傷的作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)柴胡預(yù)給藥具有減毒作用[6-8]，故利用APAP 誘導(dǎo)的LO2 肝細(xì)胞損傷模型對(duì)北柴胡水提液中主要活性成分進(jìn)行篩選與比較，以期能夠較為全面地評(píng)價(jià)北柴胡各單體成分的藥效及毒性。

1 材料與儀器

1.1 材料

北柴胡生藥飲片（由南通精華藥業(yè)有限公司提供并鑒定為傘形科植物柴胡Bupleurum chinensisDC.的干燥根）；柴胡皂苷A（純度≥98%，批號(hào)：MUST-17120313）、柴胡皂苷B1（純度≥99%，批號(hào)：MUST-18010302）、柴胡皂苷B2（純度≥99%，批號(hào)：MUST-18032104）、柴胡皂苷B3（純度≥98%，批號(hào)：MUST-18060116）、柴胡皂苷B4（純度≥97%，批號(hào)：MUST-17110117）、柴胡皂苷C（純度≥98%，批號(hào)：MUST-18031402）、柴胡皂苷D（純度≥99%，批號(hào)：MUST-17111510）、柴胡皂苷F（純度≥98%，批號(hào)：MUST-18031806）、柴胡皂苷G（純度≥98%，批號(hào)：MUST-18072216）、柴胡皂苷H（純度≥98%，批號(hào)：MUST-18040205）、柴胡皂苷I（純度≥97%，批號(hào)：MUST-18072205）、山柰苷（純度≥99%，批號(hào)：MUST-18042701）、黃芩苷（純度≥98%，批號(hào)：MUST-18010408）（對(duì)照品，成都曼斯特生物科技有限公司）；對(duì)乙酰氨基酚[純度≥99%，批號(hào)：G1816129，阿拉丁試劑（上海）有限公司]。

人源化非腫瘤肝細(xì)胞LO2（中國(guó)科學(xué)上海院細(xì)胞研究所）；DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：8119007）、胎牛血清（批號(hào)：1828728）、青霉素-鏈霉素溶液（含10 000 單位·mL－1青霉素和10 000 μg·mL－1鏈霉素，批號(hào)：1970741）（美國(guó)GIBCO 公司）；0.25%胰酶消化液（美國(guó)HyClone 公司，批號(hào)：J180013）；二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Solarbio 生化試劑公司，批號(hào)：MKBP4399V）；MTT 試劑（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：1213C0338）；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純，德國(guó)默克公司）；其他試劑為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均由Millipore 超純水儀制備。

1.2 儀器

AB SCIEX Triple TOF 5600 組合式高分辨質(zhì)譜儀，包括四元泵溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器（上海愛(ài)博才思分析儀器貿(mào)易有限公司）；MassLynxTM 質(zhì)譜工作站（Waters 公司）；真空離心濃縮揮干儀（美國(guó)Thermo 公司）；L-550 臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘潭離心機(jī)有限公司）；Beckman Coulter Allegra 64R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；生物安全柜（Thermo 1300series A2，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；5%CO2箱培養(yǎng)箱（德國(guó)Memmert 公司）；倒置顯微鏡（OLYMPUS IX53）、光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS BX41）（日本奧林巴斯株式會(huì)社）；高壓蒸汽滅菌器（Panasonic MLS-3781L，日本松下電器株式會(huì)社）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Countstar BioMed，上海睿鈺生物科技有限公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Molecular Devices）；超純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）。

2 方法

2.1 HPLC-Q-TOF-MS/MS 法分析北柴胡水提液有效成分

2.1.1 北柴胡水提液制備 稱取適量北柴胡生藥飲片，浸泡30 min，首次加10 倍水煎煮90 min，第二次加8.5 倍水煎煮90 min，將所得藥汁水提醇沉24 h 后過(guò)濾，合并濾液，并濃縮至1000 mL，每1 mL 北柴胡水提液中含生藥3.8 g，本提取液由南通精華藥業(yè)公司協(xié)助制備。

2.1.2 樣品前處理 精取北柴胡水提液1 mL，加甲醇9 mL，混勻，4000 r·min－1離心10 min。取上清液，揮干后加50%甲醇1 mL 復(fù)溶，13 000 r·min－1離心10 min，取上清液進(jìn)行HPLC-QTOF-MS/MS 分析。

2.1.3 色譜條件 色譜柱Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）； 柱溫35 ℃；流速0.2 mL·min－1；流動(dòng)相由水（含0.05%甲酸，A）和乙腈（B）組成，梯度洗脫條件見(jiàn)表1；進(jìn)樣量2 μL。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution

2.1.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式；噴霧電壓：－4500 V，離子源溫度：550℃，碰撞能量（CE）：－30℃；霧化氣（GS1）：45 psi，輔助氣（GS2）：55 psi，氣簾氣（CUR）：40 psi；為獲得更多定性信息，采用全掃描模式，掃描范圍為MS1：m/z150 ～1350，MS2：m/z100 ～1300。

2.1.5 數(shù)據(jù)分析 將HPLC-Q-TOF-MS/MS 所得結(jié)果用PeakView 2.1 軟件處理并分析。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LO2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2.2 APAP 損傷模型構(gòu)建 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的LO2 細(xì)胞用0.25%胰酶消化液、離心后重懸。根據(jù)實(shí)測(cè)細(xì)胞濃度，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成1×105個(gè)·mL－1的細(xì)胞懸浮液備用。

取96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加1×105個(gè)·mL－1的細(xì)胞懸浮液100 μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液上清液，每孔加100 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 h 后，更換為含APAP 0、0.5、1、2、2.5 mg·mL－1的無(wú)血清培養(yǎng)基，處理24 h，光學(xué)倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。每孔加MTT（5 mg·mL－1）10 μL，培養(yǎng)4 h 后棄上清液，加入100 μL DMSO 作用5 min 后，震蕩10 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后以空白孔調(diào)零，在自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)處讀取各孔吸光度值（OD值），計(jì)算APAP 的IC50值。

2.2.3 北柴胡水提液13 種主要成分的預(yù)保護(hù)作用篩選 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、模型組（APAP，1.2 mg·L－1）、預(yù)給藥組（柴胡各主要成分對(duì)照品，給藥濃度為0.4 mg·L－1與2.0 mg·L－1，該濃度由前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得）。取96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加1×105個(gè)·mL－1的細(xì)胞懸浮液100 μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，空白對(duì)照組與模型組更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組更換為含藥無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 h 后，除空白對(duì)照組外，其余各組均加入APAP 造模處理24 h，光學(xué)倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。每孔加MTT（5 mg·mL－1）10μL，培養(yǎng)4 h 后棄上清液，加入100 μL DMSO 作用5 min 后，震蕩10 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后以空白孔調(diào)零，在自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)處讀取各孔吸光度值，計(jì)算LO2 細(xì)胞存活率。

3 結(jié)果

3.1 北柴胡水提液化學(xué)成分鑒定

在負(fù)離子模式下，北柴胡化學(xué)成分的特征離子主要為[M-H]－、[M+HCOO]－，通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜采集，得到了各化合物的母離子精確分子量信息，并根據(jù)該信息及軟件預(yù)測(cè)功能，推測(cè)出可能的化學(xué)元素組成。通過(guò)查閱文獻(xiàn)并結(jié)合二級(jí)碎片信息，對(duì)主要化學(xué)成分進(jìn)行推測(cè)，通過(guò)對(duì)照品的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)，對(duì)北柴胡水提液中相應(yīng)豐度較高的化合物進(jìn)行確證。北柴胡水提液總離子流圖譜見(jiàn)圖1，鑒定出的北柴胡水提液中13 種化學(xué)成分結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2，13 種化學(xué)成分提取離子流圖譜見(jiàn)圖3，表2中列出了北柴胡水提液中13 種化學(xué)成分的保留時(shí)間、化學(xué)式等信息。

圖3 北柴胡水提物中13 種化合物在負(fù)離子模式下的EIC 色譜圖Fig 3 EIC chromatogram of the 13 chemical constituents in the aqueous extract of Bupleurum chinensis DC.in negative ion mode（ESI－）

表2 HPLC-Q-TOF-MS/MS 分析的北柴胡水提物中13 種化學(xué)成分鑒定的質(zhì)譜數(shù)據(jù)Tab 2 Mass spectral data of compounds in the aqueous extract of Bupleurum chinensis DC.by HPLC-Q-TOF-MS/MS

圖1 負(fù)離子模式下北柴胡水提物的TIC 色譜圖（ESI－）Fig 1 TIC chromatogram of the aqueous extract of Bupleurum chinensis DC.in negative ion mode（ESI－）

圖2 北柴胡水提物中13 種化學(xué)成分的準(zhǔn)確鑒定結(jié)構(gòu)Fig 2 Accurate identification of structures of the 13 chemical constituents in the aqueous extract of Bupleurum chinensis DC.

3.2 LO2 肝細(xì)胞急性損傷模型IC50 值測(cè)定

APAP 誘導(dǎo)LO2 細(xì)胞建立的損傷模型因穩(wěn)定性好、造模時(shí)間短在急性肝損傷相關(guān)研究中得到越來(lái)越多的應(yīng)用，而對(duì)于保肝護(hù)肝作用的研究來(lái)說(shuō)造模劑量至關(guān)重要，因此通過(guò)MTT 法測(cè)定不同濃度APAP 對(duì)LO2 細(xì)胞的效應(yīng)值（見(jiàn)圖4），將各濃度響應(yīng)值轉(zhuǎn)換成細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，用GraphPad Prism 5 軟件計(jì)算出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)到50%（IC50）時(shí)APAP 的質(zhì)量濃度為1.2 mg·mL－1。

圖4 APAP 誘導(dǎo)的LO2 細(xì)胞中IC50 的測(cè)定Fig 4 IC50 in LO2 cells induced by APAP

3.3 北柴胡水提液中肝損傷保護(hù)作用篩選

通過(guò)北柴胡水提液中13種化學(xué)成分預(yù)給藥后，以1.5 mg·mL－1濃度（略大于50%抑制率時(shí)的劑量）的APAP 進(jìn)行LO2 細(xì)胞急性肝損傷誘導(dǎo)，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)13 種化學(xué)成分的預(yù)保護(hù)作用差異較大，選取其中保護(hù)作用較大的8 種化學(xué)成分分為高、低劑量組預(yù)給藥，進(jìn)一步考察其對(duì)APAP所致肝損傷的保護(hù)作用，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知高低劑量組結(jié)果差異不大，柴胡皂苷F 與黃芩苷與給藥后細(xì)胞存活率與模型組相比提高約1.5 倍，可能存在潛在的肝損傷預(yù)保護(hù)作用。剩余5 種化學(xué)成分低劑量給藥對(duì)APAP 所致肝損傷的保護(hù)作用結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在該劑量下預(yù)給藥后與模型組的細(xì)胞存活率比值小余1 或約為1（見(jiàn)表3）。

表3 北柴胡水提物中13 種化學(xué)成分對(duì)肝損傷的預(yù)保護(hù)作用Tab 3 Pre-protective effect of 13 chemical constituents in the aqueous extract of Bupleurum chinensis DC

4 討論

中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)并不是單一的化合物，而是指其中發(fā)揮作用的化學(xué)成分（群）[9]。由于中藥化學(xué)成分復(fù)雜多變，同一藥材因其基原、部位、炮制、提取方式的差異，化學(xué)成分種類及其含量均有可能千差萬(wàn)別，因此中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究也就成為了中藥現(xiàn)代化的重點(diǎn)和難點(diǎn)[10]。由于中藥基質(zhì)復(fù)雜，許多成分濃度較低、對(duì)照品缺乏、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，因此中藥化學(xué)成分的鑒定是一個(gè)繁瑣而又耗時(shí)的工作。目前在復(fù)雜基質(zhì)及未知化合物結(jié)構(gòu)鑒定方面應(yīng)用較多的是液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）及核磁共振技術(shù)（NMR），但由于NMR 對(duì)化合物結(jié)構(gòu)、濃度均要求較高[11]，無(wú)法滿足復(fù)雜基質(zhì)中多組分特別是微量、痕量化合物的鑒定，因此在中藥復(fù)方、單體化學(xué)成分及體內(nèi)代謝物鑒定和分析中，質(zhì)譜技術(shù)尤其是高分辨質(zhì)譜（Q-TOF、ITTOF）應(yīng)用更為廣泛。Q-TOF 及IT-TOF 掃描速度快、質(zhì)量范圍寬、全掃描模式下靈敏度高，并可提供大量母離子及子離子精確分子量信息，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中化合物的定性、定量[12-14]。

本文利用高分辨飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（Q-TOFMS/MS），對(duì)北柴胡水提液中的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，根據(jù)收集到的母離子的精確分子量信息，利用PeakView 2.1 對(duì)化學(xué)式進(jìn)行預(yù)測(cè)，并根據(jù)特征碎片離子信息、查閱文獻(xiàn)以及PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果，對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測(cè)。但由于北柴胡水提液中以柴胡皂苷為主，且其多為同分異構(gòu)體，特征碎片離子相似，故通過(guò)借助對(duì)照品溶液，根據(jù)化合物色譜保留時(shí)間對(duì)多個(gè)成分一一確證，最終確證了13 個(gè)化合物。

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究也是中藥安全性和有效性的關(guān)鍵，如何對(duì)原方中的有效成分進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別和科學(xué)評(píng)價(jià)至關(guān)重要，通過(guò)識(shí)別、篩選、驗(yàn)證環(huán)節(jié)，將體內(nèi)外成分與藥理效應(yīng)相結(jié)合，才能更好地找到體內(nèi)活性成分[15]。目前對(duì)于柴胡各成分究竟是保肝還是傷肝這一問(wèn)題，結(jié)論還比較模糊。有研究認(rèn)為柴胡皂苷D 可通過(guò)抑制肝細(xì)胞中的PDGF-βR/p38MAPK 信號(hào)通路，使LO2 細(xì)胞線粒體受損從而激活下游凋亡通路，同時(shí)激活細(xì)胞膜上的fas 受體及 caspase-8，將凋亡信號(hào)傳遞至線粒體，加速細(xì)胞凋亡[16]；或者通過(guò)降低細(xì)胞超氧化物歧化酶活性，破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[17]。也有研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D-黃芩苷配伍可使體內(nèi)TLR4-NFκB 信號(hào)通路下調(diào)，降低炎癥，從而保護(hù)CCl4損傷的LO2 細(xì)胞[18]。可見(jiàn)，僅在柴胡皂苷D 這一單體與LO2 肝細(xì)胞關(guān)系上的研究結(jié)果就存在爭(zhēng)議。而LO2 細(xì)胞是目前用于保肝藥物篩選的常用細(xì)胞模型，很多中藥單體或提取物以該細(xì)胞為模型研究保肝作用[19-21]。因此本研究建立APAP 誘導(dǎo)LO2 細(xì)胞急性肝損傷模型對(duì)北柴胡水提液主要化學(xué)成分群活性進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷F 及黃芩苷預(yù)給藥后，細(xì)胞存活率提高約1.5 倍，具有潛在肝損傷預(yù)保護(hù)作用。但體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，北柴胡水提液中化學(xué)成分復(fù)雜，各成分活性也具有雙向性，考慮柴胡藥效作用的發(fā)揮與體內(nèi)吸收、代謝、排泄過(guò)程密切相關(guān)，是多個(gè)成分及其代謝產(chǎn)物綜合作用的結(jié)果，因此對(duì)其藥效及毒性的評(píng)價(jià)還是應(yīng)以整體為單位，以全面闡明其代謝通路及效應(yīng)機(jī)制。