華瑞，王琦，張愉，付國(guó)強(qiáng)，姚家久*（.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院急診科，西安 70038；.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院內(nèi)分泌科，西安 70038）

急性心肌梗死具有發(fā)病快，致死、致殘率高等特點(diǎn)[1]，是急診中常見(jiàn)的危重癥，目前主要采用溶栓療法及其他心外科技術(shù)降低患者的病死率，而心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion，MI/R）損傷是心肌梗死的治療中十分常見(jiàn)的并發(fā)癥，中斷的血流突然恢復(fù)后會(huì)產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)（如心律失常、微循環(huán)障礙以及部分心肌細(xì)胞損傷進(jìn)行性加重等[2-3]），仍然影響心臟功能，并給存活的患者帶來(lái)其他傷害。因此尋找安全、有效、可行的方法減少M(fèi)I/R 損傷的發(fā)生，對(duì)于提高急性心肌梗死患者的預(yù)后和生活質(zhì)量具有重大的社會(huì)價(jià)值，也成為心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。大量數(shù)據(jù)表明，氧化應(yīng)激是MI/R 損傷發(fā)生的重要機(jī)制之一[4-6]，具有抗氧化作用的藥物對(duì)預(yù)防MI/R 損傷效果良好。香茅醛（citronellal，3，7-二甲基-6-辛烯醛）是從植物檸檬香茅中提煉出來(lái)的一種無(wú)環(huán)單萜醛[7]，能顯著清除自由基，具有抗菌、抗驚厥、抗抑郁等作用[8]。香茅醛油可減少角叉菜膠誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞遷移并抑制髓過(guò)氧化物酶的釋放[9]。香茅醛和香葉醇（另一種單萜醇）均可通過(guò)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶來(lái)抑制 NO的產(chǎn)生，減少類固醇的釋放[10]，阻滯炎癥過(guò)程。香茅醛還可以降低高脂飲食誘發(fā)的氧化應(yīng)激，夠預(yù)防內(nèi)皮功能障礙并抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[11]。關(guān)于香茅醛在MI/R 損傷中的作用及其機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道，考慮其具有揮發(fā)性香氣，可應(yīng)用于芳香療法，并且屬于天然物質(zhì)、安全性高，因此有望成為心血管急重癥治療中預(yù)防并發(fā)癥的新型手段，本研究旨在探索香茅醛對(duì)MI/R 損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年SD 雄性大鼠（SPF 級(jí)）50 只，體質(zhì)量為200 ～250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有大鼠在溫度、濕度適宜的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)分為5 組，分別為假手術(shù)組，模型組，香茅醛低、中、高（50、100、150 mg·kg－1）劑量組，每組10 只。

1.2 試藥

香茅醛（CAS106-23-0，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，使用時(shí)用乙醇溶解）。血清乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、組織丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素氧化酶1（HO-1）（Abcam公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（博奧森生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備與處理

將大鼠給予異氟烷吸入麻醉，呈仰臥位固定，連接心電監(jiān)護(hù)儀并作氣管插管，連接于小動(dòng)物呼吸機(jī)（頻率為5 次·min－1，潮氣量為10 mL·kg－1，呼吸比為1∶2）。沿胸骨左緣打開(kāi)胸腔，暴露心臟冠狀動(dòng)脈左前降支，在左心耳下方1 ～2 mm 處進(jìn)針穿線，并將硅膠管沿絲線穿入至血管下，待血壓、呼吸穩(wěn)定后，輕輕結(jié)扎30 min，心電圖顯示ST 段抬高后，松開(kāi)絲線恢復(fù)血流，持續(xù)120 min。假手術(shù)組只穿線，不結(jié)扎。參考文獻(xiàn)[11]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，香茅醛低、中、高給藥組分別以50、100、150 mg·kg－1的劑量于造模前1 周進(jìn)行灌胃，每日1 次，連續(xù)7 d，假手術(shù)組和模型組灌胃等量含5%乙醇的生理鹽水。

2.2 組織病理學(xué)檢測(cè)

將各組心肌組織用10%中性福爾馬林固定過(guò)夜，脫水、石蠟包埋后切片，HE 染色，梯度脫水，封片，于20 倍光鏡顯微鏡下觀察。

2.3 心臟功能測(cè)定

分離大鼠右頸總動(dòng)脈，將含0.1%肝素鈉的導(dǎo)管緩緩插入左心室，利用Power Lab 生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠左心室血流動(dòng)力學(xué)的變化，評(píng)估心臟收縮及舒張功能。觀察指標(biāo)包括左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末期壓（LVEDP）、左心室等容期壓力最大變化速率（±dP/dtmax）。

2.4 心肌損傷標(biāo)志酶測(cè)定

復(fù)灌結(jié)束時(shí)，收集動(dòng)脈血液至非抗凝管中，在4000 r·min－1、4℃條件下離心10 min，取上清液。按試劑盒操作步驟測(cè)定血清中LDH、CK-MB 活性。

2.5 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

低溫環(huán)境下將心肌組織研磨成勻漿，以化學(xué)比色法檢測(cè)組織勻漿液中SOD、CAT 以及GSHPx 活性，硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA 含量，具體操作均遵循相關(guān)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.6 蛋白表達(dá)檢測(cè)

取50 mg 大鼠心肌組織，使用RIPA 裂解液冰浴中裂解組織提取總蛋白，并采用BCA 法檢測(cè)各組蛋白濃度。經(jīng)12.5%SDS-PAGE 膠電泳分離蛋白樣品后，采用半干轉(zhuǎn)裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，將膜用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉1 h，用TBST 洗凈殘余封閉液，分別加入Nrf2、HO-1 和GAPDH 的一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜4 次，每次10 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再次洗膜4 次后用ECL 顯色液進(jìn)行顯色，用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀拍攝圖像并進(jìn)行分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Graphpad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以表示。多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA），運(yùn)用Dunnett’st檢驗(yàn)比較兩組之間的差異，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 香茅醛對(duì)大鼠MI/R 后心肌組織形態(tài)的影響

HE 染色后觀察大鼠心肌組織，結(jié)果如圖1所示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整、排列有序；模型組大鼠存在明顯心肌纖維斷裂情況，伴隨大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分細(xì)胞壞死、細(xì)胞質(zhì)空泡化以及細(xì)胞外間隙增大等病理改變；香茅醛低劑量（50 mg·kg－1）組呈小灶性壞死，心肌細(xì)胞排列稀疏，橫紋模糊，心肌間質(zhì)中度腫脹，出現(xiàn)部分炎細(xì)胞浸潤(rùn)；香茅醛中劑量（100 mg·kg－1）組心肌組織橫紋不清晰，心肌間質(zhì)輕度腫脹，可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；香茅醛高劑量（150 mg·kg－1）組心肌細(xì)胞排列相對(duì)整齊，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，水腫減輕，形態(tài)較正常。結(jié)果提示，香茅醛能顯著改善心肌組織病理?yè)p傷（見(jiàn)圖1）。

圖1 香茅醛對(duì)大鼠MI/R 后心肌組織形態(tài)的影響（×20）Fig 1 Effect of citronellal on the morphology of tmyocardial tissue in rats after MI/R（×20）

3.2 香茅醛對(duì)大鼠MI/R 后心臟功能的影響

如表1 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVSP 和＋dP/dtmax下降，LVEDP 和－dP/dtmax上升（P＜0.05），提示模型組大鼠心臟舒張功能和收縮功能明顯受損；與模型組比較，香茅醛中、高劑量組LVSP 升高，香茅醛高劑量組＋dP/dtmax升高，香茅醛高劑量組LVEDP 和－dP/dtmax顯著降低（P＜0.05），提示香茅醛預(yù)處理有改善MI/RI 后心肌收縮及舒張功能的作用。

表1 香茅醛對(duì)大鼠MI/R 后室血流動(dòng)力學(xué)的影響 (x±s，n ＝10)Tab 1 Effect of citronellal on the hemodynamics in rats after MI/R (x ±s，n ＝10)

3.3 香茅醛對(duì)大鼠MI/R 后心肌損傷標(biāo)志酶的影響

如表2 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清LDH、CK-MB 活性均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，香茅醛各劑量組血清LDH、CK-MB 的活性均降低（P＜0.05），提示香茅醛能減輕心肌細(xì)胞膜的損傷，降低心肌酶的漏出。

表2 香茅醛對(duì)大鼠MI/R 后血清LDH、CK-MB 的影響(x±s，n ＝10)Tab 2 Effect of citronellal on the levels of LDH and CK-MB in rats after MI/R (x±s，n ＝10)

3.4 香茅醛對(duì)大鼠MI/R 后氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

如表3 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織MDA 水平顯著升高，而SOD、CAT 和GSH-Px 活性均顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，香茅醛中、高劑量組大鼠心肌組織MDA水平顯著降低，而SOD、CAT 和GSH-Px 水平均顯著升高（P＜0.05），提示香茅醛可以提高心肌組織的抗氧化能力。

表3 香茅醛對(duì)大鼠MI/R 后心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 (x±s，n ＝10)Tab 3 Effect of citronellal on the oxidative stress indicators in rats after MI/R (x ±s，n ＝10)

3.5 香茅醛對(duì)大鼠MI/R 后抗氧化信號(hào)分子的影響

如圖2 所示，與假手術(shù)組比較，MI/R 模型組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白水平應(yīng)激性略有升高；與模型組比較，香茅醛中、高劑量組Nrf2 和HO-1 蛋白水平升高（P＜0.05）。

圖2 香茅醛對(duì)大鼠MI/R 后抗氧化信號(hào)的影響Fig 2 Effect of citronellal on the antioxidant signaling after MI/R

4 討論

MI/R 損傷常伴隨出現(xiàn)心律失常、心臟功能紊亂，心肌損傷標(biāo)志酶活性升高，心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基產(chǎn)生等改變，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死等不可逆的心肌損傷[3]。研究表明，香茅醛具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)功能[12-13]，在糖尿病心肌病與動(dòng)脈粥樣硬化的大鼠模型中都被證明能夠抑制氧化應(yīng)激，減少心肌損傷，改善血管內(nèi)皮功能障礙[11，14]。

MI/R 損傷程度與心臟功能密切相關(guān)，血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)LVSP、LVEDP、±dP/dtmax是反應(yīng)心臟收縮和舒張功能的重要指標(biāo)[15]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示香茅醛可減少因缺血再灌注引起的心肌收縮與舒張功能障礙，尤其以改善心舒期功能為主。LDH對(duì)于機(jī)體能量代謝非常重要，主要催化乳酸脫氫后生成丙酮酸，在心肌組織中含量最高[16]。肌酸激酶（CK）與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)輸、肌肉收縮和ATP再生直接相關(guān)，催化肌酸和ATP 之間的轉(zhuǎn)磷酸化反應(yīng)[17]，在臨床診斷中經(jīng)常測(cè)定血清中其同工酶CK-MB 水平以反映肌肉萎縮或心肌梗死等病變。通過(guò)測(cè)定LDH 與CK-MB 活性可判斷心肌細(xì)胞的損傷程度，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示香茅醛能降低再灌注時(shí)血清中LDH 與CK-MB 的活性，進(jìn)一步提示香茅醛很可能通過(guò)改善能量代謝而降低心肌細(xì)胞損傷。

研究表明，增強(qiáng)抗氧化能力可逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激造成的心肌細(xì)胞與血管內(nèi)皮組織的損傷，從而延緩或阻止MI/R 損傷的發(fā)生和發(fā)展[18-20]。通過(guò)檢測(cè)組織中細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)主要終產(chǎn)物MDA 的水平可直接反映其氧化程度，MI/R 等損傷因素誘發(fā)產(chǎn)生的大量超氧陰離子自由基會(huì)被SOD 轉(zhuǎn)化為H2O2，繼而H2O2在CAT 與GSH-Px 的作用下被催化生成H2O 和O2，從而減少氧化應(yīng)激誘發(fā)的自由基連鎖損傷，達(dá)到保護(hù)心肌的效果[21-22]。本實(shí)驗(yàn)中香茅醛可明顯降低MDA 含量，并升高SOD、CAT及GSH-Px 水平，提示香茅醛可增強(qiáng)心肌組織的抗氧化能力，減少M(fèi)I/R 誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)心肌的保護(hù)作用。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)，會(huì)應(yīng)激性地啟動(dòng)以Nrf2 為核心的內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，而天然存在的抗氧化物質(zhì)（如酚類化合物）也會(huì)通過(guò)重要的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 促進(jìn)抗氧化反應(yīng)元件（ARE）的活化[23-24]，參與多種抗氧化酶基因如HO-1、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）的調(diào)控，從而發(fā)揮抗氧化作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生MI/R 時(shí)，Nrf2 與其下游HO-1 蛋白會(huì)應(yīng)激性升高，給予中、高劑量的香茅醛干預(yù)后，兩種抗氧化關(guān)鍵蛋白均顯著升高，說(shuō)明香茅醛可能通過(guò)Nrf2/HO-1 途徑發(fā)揮抗氧化作用。

綜上，香茅醛對(duì)MI/R 損傷有明顯的保護(hù)作用。這種保護(hù)作用可能與香茅醛改善缺血/再灌注后心肌收縮與舒張功能，增強(qiáng)清除氧自由基能力，降低過(guò)氧化物的生成，減少氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，但其詳細(xì)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。