溫金華（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院GCP，南昌 330006）

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，全球有一半以上的肝癌發(fā)生在我國，病死率在惡性腫瘤中居第二位。盡管肝癌的診療技術(shù)已取得很大進(jìn)展，但仍有大約80%的病例發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期，且多數(shù)合并肝硬化，并伴有肝功能異常，無法接受根治性手術(shù)治療[1]。作為肝癌綜合治療的重要手段，藥物治療在臨床上發(fā)揮著不可代替的作用，其中分子靶向治療藥物由于具有高選擇性、高敏感性及高效性的特點(diǎn)，逐漸成為肝癌傳統(tǒng)治療外一種重要的治療手段，如多靶點(diǎn)激酶抑制劑（TKIs，包括索拉非尼、尼洛替尼、凡德他尼、卡奈替尼等）[2]。其中，索拉非尼作為晚期肝癌的有效治療用藥，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤血管生成的作用，可顯著延長晚期肝細(xì)胞癌（HCC）患者的生存時(shí)間[3-4]。索拉非尼作用的靶器官是肝臟，由于病理狀態(tài)下，肝臟的功能及藥物在其中的分布均可能發(fā)生變化，從而影響藥物的藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)特性。本文研究索拉非尼在肝癌細(xì)胞（HepG2）與正常肝細(xì)胞（LO2）中的攝取動(dòng)力學(xué)特性，從而比較HepG2 與LO2 細(xì)胞對(duì)藥物的攝取變化，這對(duì)病理狀態(tài)下探索索拉非尼的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性具有一定的臨床意義。

1 材料

高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津shimadzu 20AT）；Discovery 色譜柱ODS C18column （150 mm×4.6 mm，5 μm）； 保護(hù)柱為Agilent ODS C18column （12.5 mm×4.6 mm，5 μm）；DHG-9070 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；MIKRO 22R 高速離心機(jī)（德國Hettich）。3111 型二氧化碳培養(yǎng)箱、細(xì)胞培養(yǎng)皿（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；ECLIPSE Ti-S倒置相差顯微鏡（日本Nikon 公司）；SpectraMax Plus 384 全波長酶標(biāo)儀（美國MD）；TDZ4-WS低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（湖南湘儀）。

HepG2 與LO2 細(xì)胞（杭州赫貝公司）；HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco DMEM basic）；LO2 細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco RPMI Medium 1640）；胎牛血清（FBS，Gibco 公司，貨號(hào)10099-141）；索拉菲尼對(duì)照品[純度＞99%，中科華檢（北京）科技有限公司]；甲醇、乙腈（色譜純，SIGMA-ALORICH）；三氟乙酸（分析純，杭州米克化工有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2 細(xì)胞株培養(yǎng)條件：含10% FBS 和1×青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基；LO2 細(xì)胞株培養(yǎng)條件：含10% FBS 和1×青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基。將HepG2 或LO2 細(xì)胞在對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞處理

取正常培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)期的兩種細(xì)胞株，用0.25%Typsin 消化，1000 r·min－1離心5 min，計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)，鋪6 孔板，每種細(xì)胞4 個(gè)孔，每孔均加入5×105個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中靜置2 d。吸取培養(yǎng)液，加入10 μL 濃度分別為0.25×10－3、0.5×10－3、0.75×10－3、1.0×10－3、1.25×10－3、2.0×10－3mmol·L－1的索拉非尼，培養(yǎng)液終濃度達(dá)到5、10、15、20、25、40 μmol·L－1，加入至對(duì)應(yīng)的HepG2 及LO2 細(xì)胞中，10 min 后處理細(xì)胞，吸去含藥培養(yǎng)基，1×PBS 洗3 遍后，加入0.5 mL 無菌水于－80 ℃冰箱反復(fù)凍溶3 次，收集細(xì)胞裂解液，用于索拉非尼濃度檢測。采用同樣的方法，加入索拉非尼使其培養(yǎng)液終濃度為10 μmol·L－1，經(jīng)過5、10、20、40 min 孵育后處理細(xì)胞，用于藥物濃度檢測。

2.3 樣品的處理與制備

從超低溫冰箱中取出不同處理組細(xì)胞裂解液樣本，溶解后準(zhǔn)確吸取0.2 mL 于5 mL 具塞離心管中，準(zhǔn)確加入2 mL 乙酸乙酯，振蕩10 s，于4℃環(huán)境下5000 r·min－1離心5 min。取有機(jī)相于尖底玻璃管中，剩余細(xì)胞裂解液殘?jiān)? mL乙酸乙酯重復(fù)萃取一次，離心后合并兩次有機(jī)相，于50 ℃水浴中氮?dú)饬鞔蹈桑瑲堅(jiān)?.1 mL甲醇復(fù)溶，超聲15 s，漩渦混勻1 min，18 000 r·min－1離心5 min，取上清液20 μL 進(jìn)高效液相色譜系統(tǒng)分析。

2.4 細(xì)胞總蛋白提取

將各組細(xì)胞樣品收集到1.5 mL EP 管中，每管中加入200 μL Western blot 及IP 裂解液[使用前加入苯甲基磺酰氟（PMSF），終濃度1 mmol·L－1]，混勻后4℃裂解30 min，同溫條件12 000 r·min－1離心處理樣品，分別取上清液儲(chǔ)存。BCA 法測定蛋白濃度：將0.5 mg·mL－1標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白按0、1、2、4、8、12、16、20 μL 加到96 孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20 μL。樣品用對(duì)照品稀釋液稀釋一定濃度后加20 μL 到96 孔板中。按50 倍體積BCA 試劑A 加1 倍體積BCA 試劑B（50∶1）配制適量BCA 工作液，充分混勻，各孔加入200 μL BCA 工作液，37℃放置30 min。測定562 nm 處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白濃度。

2.5 色譜條件

色譜柱：Discovery 色譜柱ODS C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫35 ℃，流動(dòng)相為乙腈-水-0.1%三氟乙酸＝45∶35∶20（V/V），流速1.0 mL·min－1，檢測波長266 nm，進(jìn)樣量20 μL。采用該條件進(jìn)行了索拉非尼HPLC 檢測方法的精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性等方法學(xué)考察，結(jié)果均符合要求。

2.6 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)米氏方程：V＝Vmax[S]/（Km＋[S]）計(jì)算攝取動(dòng)力學(xué)參數(shù)，V（pmol·mg protein－1·min－1）為攝取速率，Vmax為最大攝取速率，Km為米氏常數(shù)，[S]為底物濃度。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及索拉非尼細(xì)胞裂解液中濃度檢測方法

按培養(yǎng)條件完成HepG2 與LO2 的細(xì)胞培養(yǎng)（見圖1），成功建立了索拉非尼的液相色譜檢測方法（見圖2），在本試驗(yàn)提取方法和色譜條件下，索拉非尼在0.5 ～10.0 μg·mL－1吸光度線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝3.172×104X－2.966×103（r＝0.9999）。方法學(xué)驗(yàn)證顯示精密度、準(zhǔn)確度和不同條件下的穩(wěn)定性均達(dá)到相關(guān)要求（見表1 和表2）。

表1 索拉非尼檢測方法的精密度與準(zhǔn)確度(n ＝5)Tab 1 Precision and accuracy of sorafenib (n ＝5)

表2 索拉非尼檢測方法的穩(wěn)定性考察(n ＝5，%)Tab 2 Stability of sorafenib (n ＝5，%)

圖1 HepG2 與LO2 細(xì)胞貼壁圖Fig 1 Attachment diagram of HepG2 and LO2 cells

圖2 索拉非尼色譜圖Fig 2 Chromatogram of sorafenib

3.2 索拉非尼的攝取動(dòng)力學(xué)

HepG2 細(xì)胞對(duì)索拉非尼的攝取隨著索拉非尼濃度的增加而增加，在濃度為20 μmol·L－1時(shí)攝取趨于飽和；而LO2 細(xì)胞對(duì)索拉非尼的攝取亦隨著索拉非尼濃度的增加而增加，在濃度為15μmol·L－1時(shí)攝取趨于飽和；但與LO2 細(xì)胞相比較，HepG2 細(xì)胞對(duì)索拉非尼的攝取量明顯增加（見圖3）。當(dāng)加入10 μmol·L－1的索拉非尼，HepG2 與LO2 細(xì)胞對(duì)索拉非尼的攝取隨著時(shí)間的增加而增加，均在20 min 時(shí)趨于飽和。HepG2 細(xì)胞的Vmax為（684.14±78.19）pmol·mg protein－1·min－1，Km為（93.3±17.56）μmol·L－1；LO2 細(xì)胞的Vmax為（335.61±69.73）pmol·mg protein－1·min－1，Km為（135.68±29.34）μmol·L－1； 結(jié)果顯示HepG2 細(xì)胞對(duì)索拉非尼的攝取速率明顯高于LO2細(xì)胞的攝取速率（見圖4）。

圖3 索拉非尼（5 ～40 μmol·L－1）在HepG2（A）與LO2（B）細(xì)胞中的攝取Fig 3 Uptake of sorafenib （5 ～40 μmol·L－ 1）in HepG2（A）and LO2（B）cells

圖4 索拉非尼（10 μmol·L－1）在HepG2（A）與LO2（B）細(xì)胞中孵育（5 ～40 min）后的攝取Fig 4 Uptake of sorafenib （10 μmol·L－1）after the incubation（5 ～40 min）in HepG2（A）and LO2（B）

4 討論

索拉非尼是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的治療HCC 的一線小分子靶向藥物，為多靶點(diǎn)激酶抑制劑，可通過抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血小板衍生生長因子（PDGF）受體酪氨酸激酶的活性，從而抑制腫瘤血管生成和增殖[5]。目前針對(duì)索拉非尼的藥理學(xué)作用機(jī)制及耐藥機(jī)制的研究較多，但對(duì)其在腫瘤中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)包括針對(duì)在肝癌細(xì)胞中的攝取動(dòng)力學(xué)研究的報(bào)道較少[6]。本研究通過觀察索拉非尼在肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞中的攝取動(dòng)力學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)索拉非尼在肝癌細(xì)胞（HepG2）中攝取量及攝取速率明顯高于正常肝細(xì)胞（LO2）。HepG2 細(xì)胞對(duì)索拉非尼的攝取速率Vmax顯著高于LO2 細(xì)胞。因此索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞具有一定的靶向性，這種攝取靶向性有利于提高治療效果并降低不良反應(yīng)發(fā)生率。

有研究顯示，一些代謝酶如CYP3A5、CYP3A4、CYP2C19、CYP2D6 及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體如P-糖蛋白、有機(jī)陽離子在介導(dǎo)索拉菲尼與其他藥物的體內(nèi)相互作用過程中扮演了重要的角色[7-8]，因此，這些代謝酶及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體在肝癌細(xì)胞中介導(dǎo)索拉非尼的攝取中可能也起著重要作用，如CYP3A5*3基因型患者中索拉非尼代謝水平極低，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的肝和腎損害[9]。圍繞這些代謝酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)索拉非尼的藥物代謝動(dòng)力學(xué)及藥效學(xué)影響，需進(jìn)一步開展相關(guān)的研究。