任童童，喻達(dá)輝，翟子欽，譚傳港，何積翠，尚東維，陳移波，白麗蓉*

（1北部灣大學(xué)/廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點實驗室，廣西欽州 535011；2天津農(nóng)墾渤海農(nóng)業(yè)集團(tuán)有限公司，天津 301823；3天津嘉禾田源觀賞魚養(yǎng)殖有限公司，天津 300481）

0 引言

【研究意義】線粒體基因組中存在的密碼子具有簡并性，不同的密碼子可編碼同一種氨基酸，即同義密碼子（吳憲明等，2007；惠小涵等，2020）。但同義密碼子具有偏好性，某一物種通常傾向于使用某一種或幾種同義密碼子（張志東等，2019），這種同義密碼子又被稱為最優(yōu)密碼子，究其原因可能是不同生境中密碼子的承壓能力會導(dǎo)致物種發(fā)生突變或選擇性變異（Romero et al.，2000）。因此，開展密碼子偏好性研究既能揭示物種的進(jìn)化關(guān)系，對研究自然選擇、遺傳漂變及基因重組等現(xiàn)象也具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】20世紀(jì)80年代，在針對大腸桿菌（）、芽孢桿菌（）和釀酒酵母（）的研究中，有學(xué)者證實密碼子使用偏好性與基因表達(dá)水平呈正相關(guān)（李秀璋等，2015）。隨著生物信息學(xué)新一代測序技術(shù)的發(fā)展，大量生物線粒體基因組被測定，為系統(tǒng)發(fā)育研究提供了技術(shù)支持。目前，已在藏羚羊（）和山羊（）中證實mtDNA偏向使用以A或U結(jié)尾的密碼子，而在馬（）、大熊貓（）及非洲象（）等13種動物中發(fā)現(xiàn)mtDNA偏向使用以G或C結(jié)尾的密碼子，聚類分析進(jìn)一步表明密碼子偏好性差異可用于鑒別物種親緣及物種分類研究（宋喬喬和鐘金城，2014）。馮海悅等（2018）基于密碼子偏好性對豬（）、人類（）和東北虎（）等13種哺乳動物進(jìn)行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)密碼子使用模式與親緣關(guān)系遠(yuǎn)近有關(guān)。仵麗麗等（2021）基于哺乳動物密碼子偏好性分析了新型冠狀病毒結(jié)合穿山甲ACE2受體的分子機(jī)制。在水生生物中，王佳等（2015）研究表明，扇貝和牡蠣使用量最高的密碼子均為編碼賴氨酸的AAA，使用量最低的則為編碼精氨酸的CGC；慎佩晶等（2020）基于中性分析和ENC曲線分析，證實羅氏沼蝦（）線粒體蛋白編碼基因偏好使用以A或T結(jié)尾的密碼子，尤其是以T結(jié)尾的密碼子。此外，有研究發(fā)現(xiàn)紅藻基因偏向于以A或T堿基結(jié)尾的密碼子（李國靈等，2020b），條斑紫菜（）mtDNA偏好以A或U堿基結(jié)尾的密碼子（李國靈等，2020b），而細(xì)基江蘺（）mtDNA偏好以A或U結(jié)尾的密碼子（邱春桃等，2021）。【本研究切入點】法螺（）又名鳳尾螺（蔡巖等，2004），是一種分布范圍較廣的熱帶亞熱帶大型海洋貝類，是珊瑚礁主要敵害生物棘冠海星（）的重要天敵物種，在珊瑚生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生態(tài)學(xué)作用（鄭小東和曲學(xué)存，2013）。近年來，因過度捕撈及全球變暖等影響，法螺在我國海域面臨著滅絕的危險（馮永勤等，2009），屬于瀕危海洋貝類。因此，開展法螺生物資源的保護(hù)及繁育工作刻不容緩。法螺線粒體基因組測序已完成（MT_043269.1），全長15346 bp，但有關(guān)法螺線粒體全基因組序列密碼子偏好性的研究尚無報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對法螺線粒體全基因組密碼子偏好性進(jìn)行分析，探究基因突變和自然選擇對密碼子偏好性的影響，以期為法螺屬動物類群的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及種質(zhì)資源保護(hù)與遺傳改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列材料

法螺線粒體基因組CDS（Coding DNA sequence）序列來源于NCBI數(shù)據(jù)庫（MT_043269.1），其線粒體基因組序列總長度為15346 bp，共包含37個編碼蛋白的CDS序列。由于短序列無法正確計算有效密碼子數(shù)，為減少樣本誤差，故選擇以ATG為起始密碼子的非重復(fù)且長度大于300 bp的11個CDS序列進(jìn)行密碼子偏好性分析。

1.2 數(shù)據(jù)分析

1.2.1 密碼子偏好參數(shù)計算 采用CodonW 1.4.2計算密碼子GC總含量，密碼子第1、2和3位GC含量（GC1、GC2和GC3），第1和2位密碼子平均GC含量（GC12），同義密碼子第3位GC含量（GC3），密碼子適應(yīng)指數(shù)（Codon adaption index，CAI），密碼子偏好性指數(shù)（Codon bias index，CBI），最優(yōu)密碼子使用頻率（Frequency of optimal codons，F(xiàn)OP），有效密碼子數(shù)目（Effective number of codon，ENC），同義密碼子相對使用度（Relative synonymous codon usage，RS‐CU），以及總平均親水性（Grand average of hydropa‐thy，GRAVY）（何積翠等，2022）。

1.2.2 中性繪圖分析 中性繪圖分析可初步判斷影響密碼子偏好的因素。首先根據(jù)GC1和GC2計算出平均值GC12，然后以GC3為橫坐標(biāo)、GC12為縱坐標(biāo)繪制散點圖。散點圖中每個散點代表一個基因，根據(jù)GC12和G3的關(guān)系，可判斷密碼子使用偏好是由基因突變還是自然選擇所造成，從而判斷影響密碼子偏好的因素。

1.2.3 ENC-plot繪圖 ENC-plot繪圖可進(jìn)一步確定影響密碼子偏好的因素。首先以GC3為橫坐標(biāo)、ENC為縱坐標(biāo)建立坐標(biāo)系，然后按坐標(biāo)定位各基因并形成散點圖，最后在坐標(biāo)系中添加ENC標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)每個基因點所處位置判斷影響密碼子偏好的因素，若各基因點分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線附近，代表密碼子偏好性只受基因突變壓力的影響，若基因點集中在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，表明密碼子偏好更多受自然選擇影響（王鵬良等，2018）。標(biāo)準(zhǔn)曲線公式如下：

式中，ENC為ENC期望值，ENC為ENC實際值。當(dāng)ENC與ENC接近時，表明基因密碼子受基因突變的影響；而ENC與ENC差別較大時，說明基因密碼子受自然選擇的影響（趙婉清等，2020；何積翠等，2022）。

1.2.4 RSCU對應(yīng)性分析 對應(yīng)性分析是利用CodonW的RSCU對應(yīng)分析功能，分析法螺基因組密碼子使用規(guī)律，推測導(dǎo)致密碼子偏好性發(fā)生的原因。

1.2.5 最優(yōu)密碼子確定 首先以ENC偏好性為標(biāo)準(zhǔn)排序，從排序最高端和最低端選取所參試基因的20%，分別建立高、低表達(dá)基因庫并計算RSCU差值（△RSCU），△RSCU>0.08且RSCU在高表達(dá)基因庫中>1.00的密碼子即為最優(yōu)密碼子。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子組成分析結(jié)果

法螺線粒體基因組是一個總長為15346 bp的環(huán)狀DNA分子，共包含37個編碼蛋白的CDS序列，其基因組特征如表1所示。根據(jù)密碼子偏好分析要求，選擇以ATG為起始密碼子的非重復(fù)且長度大于300 bp的11個CDS序列，利用CodonW進(jìn)行密碼子偏好性分析，結(jié)果（表2）顯示，GC總含量波動范圍在33.00%~41.60%，平均為35.81%。GC1的波動范圍在35.80%~53.10%，平均為43.54%；GC2的波動范圍在32.40%~43.40%，平均為36.11%；GC3的波動范圍在23.00%~30.60%，平均為27.79%，GC1和GC2明顯高于GC3；GC3s的波動范圍在20.90%~29.60%，平均為26.23%，表明密碼子第3位堿基以A/U（T）結(jié)尾為主。CAI的波動范圍在0.096~0.166，平均為0.137；CBI的波動范圍在-0.212~-0.086，平均為-0.133；FOP的波動范圍在0.246~0.339，平均為0.306；ENC的波動范圍在44.37~51.69，平均為47.84；GRAVY的變化范圍在0.4419~1.4727，平均為0.9501（表2）。

表1 法螺線粒體基因組特征Table 1 Characteristics of mitochondrial genome of C.tritonis

表2 法螺線粒體基因組密碼子的主要參數(shù)Table 2 Main parameters in mitochondrial genome of C.tritonis

密碼子參數(shù)的相關(guān)分析結(jié)果如表3所示，GC1與GC和CAI呈極顯著正相關(guān)（<0.01，下同），相關(guān)系數(shù)分別為0.839和0.738，與GRAVY呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.765；GC2與GC呈顯著相關(guān)（<0.05，下同），相關(guān)系數(shù)為0.679；GC3與GC3s呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.958；GC與CAI呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.727，而與GRAVY呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.720；CAI與FOP呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.676，與GRAVY也呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.679；CBI與FOP呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.866。

表3 法螺密碼子主要參數(shù)的相關(guān)分析結(jié)果Table 3 Correlation analysis of the main parameters of codons in C.tritonis

RSCU分析結(jié)果表明，RSCU>1.00的密碼子數(shù)目為28個（表4）。其中，第3位為A的堿基有14個，第3位為U的堿基有12個，第3位為C的堿基有2個。以A或U結(jié)尾的密碼子占全部的92.86%，說明法螺線粒體基因組密碼子偏好以A或U（T）結(jié)尾。

表4 法螺線粒體基因同義密碼子的相對使用度Table 4 Relative synonymous codon usage（RSCU）of mito‐chondrial genes in C.tritonis

2.2 中性繪圖分析結(jié)果

中性繪圖分析結(jié)果表明，GC3 取值范圍為23.00%~30.60%，GC12取值范圍為36.10%~44.25%。GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)為0.239，未達(dá)顯著相關(guān)水平，回歸系數(shù)為0.3884；回歸方程為=0.3884+0.2903（=0.0571），說明GC12和GC3的相關(guān)性微弱。11個基因均落在對角線上方（圖1），且沒有在對角線上或沿著對角線分布，說明GC12高于GC3，即自然選擇在法螺線粒體基因密碼子偏好性中發(fā)揮主導(dǎo)作用。

圖1 法螺線粒體基因中性繪圖分析結(jié)果Fig.1 Neutrality plot analysis of mitochondrial genes of C.tri‐tonis

2.3 ENC-plot繪圖分析結(jié)果

ENC-plot繪圖分析結(jié)果如圖2所示，大多基因（散點）落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的下方，僅有少部分基因（散點）落在標(biāo)準(zhǔn)曲線上。為進(jìn)一步準(zhǔn)確地反映差異，將數(shù)據(jù)代入公式（1）求出ENC，再代入公式（2）求出ENC，最后分析所有基因的ENC頻數(shù)分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ENC在-0.05~0之間的基因僅有1個，占總基因數(shù)的9.09%；ENC在0~0.05之間的基因有7個，占總基因數(shù)的63.64%；ENC在0.05~0.10之間的基因有2個，占總基因數(shù)的18.18%；ENC在0.10~0.15之間的基因也只有1個，占9.09%。可見，在法螺線粒體基因組密碼子偏好性的形成過程中受基因突變和自然選擇的雙重作用，但以自然選擇為主導(dǎo)。

圖2 法螺線粒體基因密碼子ENC-plot繪圖分析結(jié)果Fig.2 ENC-plot analysis of mitochondrial genes in C.tritonis

2.4 RSCU對應(yīng)性分析結(jié)果

對應(yīng)性分析結(jié)果表明，第一向量的貢獻(xiàn)率為24.98%，第二向量的貢獻(xiàn)率為16.99%，第三向量的貢獻(xiàn)率為12.4%，第四向量的貢獻(xiàn)率為11.73%，4個向量的總貢獻(xiàn)率為66.10%，即第一軸對法螺線粒體基因組密碼子偏好性形成的影響最大。第一向量與GC1和GC呈顯著正相關(guān)，對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)分別為0.702和0.606，說明GC1和GC對法螺密碼子偏性起顯著作用；與GRAVY呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.669；與其余參數(shù)的相關(guān)性未達(dá)顯著水平。為了更好地觀察密碼子偏好性，以第一向量（Axis1）為軸、第二向量（Axis2）為軸建立坐標(biāo)系，通過觀察各基因間的距離來反映RSCU，結(jié)果（圖3）顯示，、、和等4個基因的分布相對集中，其他7個基因（、、、、、和）的分布相對分散，說明、、和等4個基因的密碼子偏好性相近，與其他7個基因的密碼子偏好性相差明顯。

圖3 基于RSCU的法螺線粒體基因組密碼子對應(yīng)性分析結(jié)果Fig.3 Correspondence analysis of mitochondrial genome codon of C.tritonis based on RSCU

2.5 最優(yōu)密碼子分析結(jié)果

以△RSCU>0.08為標(biāo)準(zhǔn)，共確立獲得27個高表達(dá)密碼子（表5中帶*的密碼子），其中，0.08<△RSCU<0.30的密碼子有10個，0.30<△RSCU<0.50的密碼子有9個，△RSCU>0.50的密碼子有8個。在這些高表達(dá)密碼子中，以A結(jié)尾的密碼子有10個，以U結(jié)尾的密碼子有4個，以C結(jié)尾的密碼子有9個，以G結(jié)尾的密碼有4個。將27個高表達(dá)優(yōu)越密碼子和28個高頻密碼子進(jìn)行比對分析，選取共有的密碼子作為最優(yōu)密碼子，最后確定出11個密碼子為法螺線粒體基因組最優(yōu)密碼子（表5），分別為UUU、CUA、GUA、UAU、CAA、AAA、UCA、CCA、ACA、GCC和GCA，對應(yīng)編碼苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、纈氨酸（Val）、酪氨酸（Tyr）、谷氨酰胺（Gln）、賴氨酸（Lys）、絲氨酸（Ser）、脯氨酸（Pro）、蘇氨酸（Thr）及丙氨酸（Ala）（密碼子GCC和GCA均編碼丙氨酸），其中有1個密碼子以G或C結(jié)尾，其余的10個密碼子均以A或U結(jié)尾。

表5 法螺線粒體基因組高/低表達(dá)基因庫的同義密碼子相對使用度比較Table 5 RSCU comparison of C.tritonis mitochondrial genes in high/low expression gene library

3 討論

GC含量是DNA序列的一個重要指標(biāo)，其含量越高說明序列越穩(wěn)定。根據(jù)已有的研究可知，在魚類中黑鯛（）的GC含量為53.92%，真鯛（）的GC含量為53.49%（曹廣勇等，2019），在哺乳動物中藏羚羊的GC含量為49.3%，山羊的GC含量為49.5%，馬的GC含量為50.7%，大熊貓的GC含量為61.4%，小鼠（）的GC含量為63.5%，白頰長臂猿（）的GC 含量為63.8%（宋喬喬和鐘金城，2014）。本研究中，法螺線粒體基因組的總GC平均值為35.81%，與魚類和哺乳動物相比其GC含量相對較低，也進(jìn)一步證實高等動物的GC含量高于低等動物的GC含量。此外，法螺線粒體基因組的GC1和GC2明顯高于GC3，GC3s平均值為26.23%，表明密碼子中的第3位堿基更偏好以A/U（T）結(jié)尾。已有研究表明，在軟體動物斧文蛤（）等5種文蛤?qū)儇愵愔蠫C3s范圍在12%~26%（張志東等，2019）；在節(jié)肢動物羅氏沼蝦中，GC3s為40%（慎佩晶等，2020）；在兩棲類阿里山小鯢（）及臺灣小鯢（）等20種小鯢科動物中GC3s均小于30%（姜艷，2016）?？梢?，密碼子中的第3位堿基更偏好以A/U（T）結(jié)尾。在魚類中，張欣等（2017）研究表明，金魚（）的GC3為56.4%、斑馬魚（）的GC3為56%，均偏好以G或C結(jié)尾的密碼子；孟乾等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，斑石鯛（）的A3s為33.79%、C3s為38.58%，條石鯛（）的A3s為36.32%、C3s為38.61%，表明其偏愛使用AC結(jié)尾的密碼子。在哺乳動物中，馮海悅等（2018）研究證實，豬、獼猴（）、家犬（familiaris）、白尾鹿（ssp.）、瘤牛（）、大熊貓、山羊、東北虎及人類的GC3s范圍在60.00%~76.00%，而小家鼠（）、袋鼠熊（）、家貓（）和金錢豹（）等4種哺乳動物的GC3s范圍在44.00%~49.00%。上述分析結(jié)果表明，較低分類單元的貝類比魚類和哺乳動物等更傾向于使用嚴(yán)謹(jǐn)性較低的密碼子。

根據(jù)RSCU分析結(jié)果可知，RSCU>1.00的密碼子數(shù)目為28個，其中第3位以A/U（T）結(jié)尾的堿基有26個（占92.86%），表明法螺線粒體基因組密碼子偏愛以A或U（T）結(jié)尾。以ENC=35.00為標(biāo)準(zhǔn)線，低于35.00密碼子偏好性越強(qiáng)，高于35.00則密碼子偏好性越弱（Jiang et al.，2008），法螺線粒體蛋白編碼基因密碼子ENC波動范圍在44.37~51.69，平均為47.84，表明法螺線粒體基因組密碼子的偏好性較弱，與慎佩晶等（2020）研究報道的羅氏沼蝦ENC平均值為52.72，線粒體DNA密碼子偏好性較弱的結(jié)論相同，但與20種小鯢科動物的密碼子ENC波動范圍為36.47~42.40（姜艷，2016）及13種哺乳動物的密碼子ENC波動范圍為41.69~51.63（宋喬喬和鐘金城，2014）存在差異，即與線粒體DNA密碼子具有一定偏好性的結(jié)論不同。密碼子CAI變化范圍為0~1，數(shù)值越小表示基因密碼子適應(yīng)性越弱，偏向于高表達(dá)基因密碼子的程度也越弱（邱春桃等，2021）。在本研究中，法螺線粒體基因組密碼子CAI的平均值為0.1367，進(jìn)一步表明法螺線粒體基因組密碼子為弱偏好性密碼子。CBI是一項計算最優(yōu)密碼子使用程度的指標(biāo)，當(dāng)CBI為負(fù)值時表示最優(yōu)密碼子出現(xiàn)次數(shù)較平均使用次數(shù)還少（姜艷，2016），F(xiàn)OP的取值范圍為0~1，數(shù)值越小表示最優(yōu)密碼子被使用的頻率越小。法螺線粒體基因組密碼子的CBI和FOP數(shù)據(jù)分析結(jié)果均表明，最優(yōu)密碼子使用頻率低，從側(cè)面表明法螺線粒體基因組密碼子為弱偏好性密碼子。

從原核生物到真核生物的基因組中廣泛存在

基因密碼子使用偏好性，目前科學(xué)界普遍認(rèn)為自然選擇和基因突變是主導(dǎo)因素，其次還與基因的堿基組成、基因長度、tRNA豐度及蛋白的親疏水性等因素有關(guān)（Sloan and Taylor，2010；Behura and Sever‐son，2011；Rao et al.，2011；Benjamini and Speed，2012；Wei et al.，2014）。中性繪圖分析結(jié)果顯示，GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)為0.239，未達(dá)顯著相關(guān)水平，表明自然選擇在法螺線粒體基因組密碼子偏好性的形成過程中起主導(dǎo)作用；ENC-plot繪圖分析結(jié)果也顯示多數(shù)基因位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的下方，進(jìn)一步印證在法螺線粒體基因組密碼子偏好性的形成中自然選擇是主導(dǎo)因素，與姜艷（2016）、慎佩晶等（2020）、趙婉清等（2020）的研究結(jié)論相似。最優(yōu)密碼子確立可有效提高外源基因的表達(dá)效率。本研究根據(jù)高/低表達(dá)基因庫同義密碼子△RSCU>0.08的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出27個高表達(dá)優(yōu)越密碼子；而根據(jù)同義密碼子RS‐CU>1.00的標(biāo)準(zhǔn)，獲得28個高頻密碼子。選取兩者共有的密碼子作為最優(yōu)密碼子，最終確定11個密碼子為法螺線線粒體基因組的最優(yōu)密碼子，分別為

UUU、CUA、GUA、UAU、CAA、AAA、UCA、CCA、ACA、GCC和GCA，對應(yīng)編碼苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸及丙氨酸（密碼子GCC和GCA均編碼丙氨酸）。張志東等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，文蛤與法螺的最優(yōu)密碼子不同，但所編碼的氨基酸有5個相同，分別是亮氨酸、纈氨酸、絲氨酸、脯氨酸和丙氨酸；慎佩晶等（2020）研究表明，羅氏沼蝦的最優(yōu)密碼子有16個，共編碼氨基酸10個，其中6個與法螺的相同，分別為絲氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和脯氨酸。本研究通過對法螺密碼子偏好性進(jìn)行分析，探究基因突變和自然選擇對密碼子偏好性的影響，可為法螺屬動物類群的進(jìn)化驅(qū)動因素及種質(zhì)資源保護(hù)與遺傳改良提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

法螺線粒體基因組密碼子偏好以A/U（T）結(jié)尾，篩選確定的11個最優(yōu)密碼子（UUU、CUA、GUA、UAU、CAA、AAA、UCA、CCA、ACA、GCC和GCA）主要以A/U結(jié)尾。法螺線粒體基因組密碼子為弱偏好性密碼子，自然選擇在其偏好性的形成過程中起主導(dǎo)作用。