黃玉英，楊明偉，譚紅連，梁 正，曾 蘭，韋信賢，黃光華*，童桂香*

（1廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530021；2廣西水產(chǎn)畜牧學(xué)校，廣西南寧 530021）

0 引言

【研究意義】羅氏沼蝦野田村病毒（nodavirus，MrNV）是一種單股正鏈RNA病毒，隸屬于野田村病毒科（Nodaviridae）（黃光華等，2015），主要感染羅氏沼蝦苗種，可造成淡化后仔蝦的死亡率高達(dá)90%，患病蝦以肌肉白濁、白斑或白尾等癥狀為臨床特征，因此被稱為羅氏沼蝦白尾病（White tail disease，WTD）（姜蘭等，2002；陳之航等，2015）。WTD是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定必須申報(bào)的疫病，自報(bào)道以來(lái)曾在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛流行，發(fā)病快、死亡率高，給羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展造成極大危害，我國(guó)已將其列為二類動(dòng)物疫病（Cheng and Chen，1998；錢冬等，2002；陳之航等，2015）。十足目虹彩病毒1（Decapod iridescent virus 1，DIV1）是近年來(lái)蝦類養(yǎng)殖中新出現(xiàn)的傳染性病原，隸屬于虹彩病毒科（Iridoviridae）十足目虹彩病毒屬（）（Chen et al.，2019），可感染羅氏沼蝦、凡納濱對(duì)蝦、紅螯螯蝦、中國(guó)對(duì)蝦及青蝦等主要養(yǎng)殖蝦品種，并造成大批量死亡（Xu et al.，2016；Li et al.，2017；Qiu et al.，2017），也可感染河蝦、河蟹、螺螄及浮游生物等水生生物成為傳染源（王甘翔等，2018）。由于DIV1的多宿主特征，其傳播迅速且廣泛，DIV1疫情在我國(guó)蝦類養(yǎng)殖各區(qū)域相繼暴發(fā)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，且疫情有進(jìn)一步擴(kuò)大和加劇的趨勢(shì)，給我國(guó)蝦類養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已將DIV1引起的蝦虹彩病毒?。―ecapod iri‐descent virus 1 disease，DIV1D）定為新發(fā)疫病，并暫時(shí)參照一類疫病處置（農(nóng)漁技疫函〔2018〕95號(hào)）。WTD和DIV1D是羅氏沼蝦養(yǎng)殖中危害最嚴(yán)重的2種病毒性疾病，目前尚無(wú)特效藥物及治療方法，切斷病毒傳播途經(jīng)仍是最有效的預(yù)防措施。因此，亟待建立一種能同時(shí)鑒別MrNV和DIV1的檢測(cè)方法，為蝦苗檢疫、親蝦篩選及疾病診斷等提供更高效的技術(shù)手段。【前人研究進(jìn)展】目前，針對(duì)MrNV的檢測(cè)方法有膠體金試紙條、ELISA、RT-PCR、熒光定量RT-PCR及RT-LAMP 等（Romestand and Bonami，2003；Sri Widada et al.，2003；Pillai et al.，2006；童桂香等，2012；黃光華等，2015），關(guān)于DIV1的檢測(cè)方法已報(bào)道有套式PCR、熒光定量PCR、LAMP和RPA等（Qiu et al.，2017，2018；韋信賢等，2020；鄒瑩等，2020；Tong et al.，2022）。這些檢測(cè)方法在實(shí)際檢測(cè)工作中各具優(yōu)缺點(diǎn)，RT-PCR需進(jìn)行PCR和電泳分析，且敏感性較低；套氏PCR敏感性高，但需進(jìn)行兩輪PCR及電泳分析，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，且多次開(kāi)蓋操作易造成交叉污染；ELISA準(zhǔn)確性高，但操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)；LAMP靈敏、快速，但易出現(xiàn)假陽(yáng)性。相對(duì)而言，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高、檢測(cè)速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為實(shí)驗(yàn)室診斷最常用的檢測(cè)方法（鐘江華等，2011；隗黎麗，2012）。多重?zé)晒舛縋CR是在熒光定量PCR的基礎(chǔ)上，利用幾種不同熒光基團(tuán)的組合，結(jié)合儀器對(duì)不同通道熒光的檢測(cè)能力實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)靶標(biāo)的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)分析，應(yīng)用于病原檢測(cè)時(shí)可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原進(jìn)行同步檢測(cè)，具有簡(jiǎn)便、高效、檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)。姜利霞等（2021）建立了可同時(shí)檢測(cè)牛皰疹病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛副流感病毒3型和牛病毒性腹瀉病毒單一或混合感染的四重?zé)晒舛縋CR；史喜菊等（2021）建立了可用于偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2等3種病毒混合感染檢測(cè)和鑒別診斷的三重?zé)晒舛縋CR；王然等（2021）建立了可快速檢測(cè)6種常見(jiàn)下呼吸道感染病原菌的多重?zé)晒舛縋CR?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】MrNV和DIV1是羅氏沼蝦養(yǎng)殖中危害最嚴(yán)重的傳染性病原，但目前主要是采用MrNV和DIV1的單重?zé)晒舛縋CR分別進(jìn)行檢測(cè)，操作繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，因此亟待建立一種能同時(shí)檢測(cè)MrNV和DIV1的二重?zé)晒舛縋CR，實(shí)現(xiàn)對(duì)羅氏沼蝦WTD和DIV1D的快速診斷及科學(xué)防控?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用TaqMan-MGB探針技術(shù)建立能同時(shí)檢測(cè)MrNV和DIV1的二重?zé)晒舛縋CR，以提高M(jìn)rNV和DIV1檢測(cè)的效率，為WTD和DIV1D的臨床診斷及疫情監(jiān)測(cè)提供一種更簡(jiǎn)便和高效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

MrNV、DIV1、白斑綜合征病毒（WSSV）、蝦肝腸胞蟲(chóng)（EHP）、傳染性皮下和造血器官壞死病毒（IHHNV）陽(yáng)性材料由廣西水生動(dòng)物疫病監(jiān)控中心實(shí)驗(yàn)室保存提供；無(wú)MrNV和DIV1感染的羅氏沼蝦由國(guó)家級(jí)廣西南寧羅氏沼蝦良種場(chǎng)提供；117份羅氏沼蝦樣品為2020年采自廣西南寧、柳州和百色等地的養(yǎng)殖場(chǎng)。2×F8 Fast Long PCR MasterMix、病毒基因組DNA/RNA核酸快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物技術(shù)有限公司；pGM-T載體、氨芐青霉素、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞及瓊脂糖購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒及DNase I購(gòu)自Fermentas 公司；DL500 DNA Marker、I、EASY Dilution（for Real Time PCR）和OneStep PrimeScriptRT-PCR Kit（Perfect Real Time）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備為安捷倫公司的Mx3005P熒光定量PCR儀。

1.2 MrNV和DIV1二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立

1.2.1 引物與探針設(shè)計(jì)及合成 MrNV的衣殼蛋白（Capsid protein，CP）基因和DIV1的主衣殼蛋白（Major capsid protein，MCP）基因均為病毒主要功能基因，且其序列含有多個(gè)保守區(qū)域（Tidona et al.，1998），故選取MrNV的CP基因（MrNV-CP）和DIV1的MCP基因（DIV1-MCP）為檢測(cè)目標(biāo)基因。采用Primer Express v3.0分別在MrNV-CP基因（HQ287005）和DIV1-MCP基因（KY681039）的保守區(qū)域設(shè)計(jì)多組特異性引物和TaqMan-MGB探針，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其中，MrNV和DIV1探針的5'端分別標(biāo)記HEX和FAM熒光染料、3'端均標(biāo)記MGB基團(tuán)。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)測(cè)試篩選，各選擇一套效果較好的引物及TapMan-MGB探針（表1）用于二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立。

1.2.2 病毒核酸提取及標(biāo)準(zhǔn)品制備 取陽(yáng)性病料組織按1∶2（w/v）的比例加入生理鹽水，勻漿，離心收集200.0 μL上清液，按照病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒說(shuō)明分別提取MrNV、DIV1、WSSV、IHHNV和EHP的核酸，最后加50.0 μL洗脫緩沖液溶解，病毒DNA置于-20 ℃冰箱保存，病毒RNA置于-70 ℃冰箱保存。參照黃光華等（2015）的方法，制備重組質(zhì)粒pGM-T-CP和pGM-T-MCP；提取pGM-T-CP質(zhì)粒DNA，以I單酶切使質(zhì)粒線性化后采用瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化；以線性化pGM-T-CP質(zhì)粒DNA為模板，T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA為檢測(cè)MrNV的標(biāo)準(zhǔn)品RNA，pGM-T-MCP質(zhì)粒DNA則直接作為檢測(cè)DIV1的標(biāo)準(zhǔn)品DNA。使用核酸蛋白分析儀分別測(cè)定MrNV標(biāo)準(zhǔn)品RNA和DIV1標(biāo)準(zhǔn)品DNA的純度和濃度，并換算成拷貝數(shù)：拷貝數(shù)（Copies/μL）=6.02×10×（ng/μL×10）÷（RNA長(zhǎng)度×340）/（DNA長(zhǎng)度×660）；采用10倍梯度稀釋，將標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋成1.0×10~1.0×10Copies/μL，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 二重?zé)晒舛縋CR退火溫度優(yōu)化 參考各引物的退火溫度（Tm），以1.0×10、1.0×10和1.0×10Copies/μL等3個(gè)濃度的MrNV標(biāo)準(zhǔn)品RNA和DIV1標(biāo)準(zhǔn)品DNA等比混合液為模板，按1 ℃的梯度在58~62 ℃范圍內(nèi)分別進(jìn)行二重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增，以獲得較低值及較高相對(duì)熒光強(qiáng)度增加值（ΔRn）時(shí)的退火溫度最佳。

1.2.4 二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)體系優(yōu)化 選擇1.0×10、1.0×10和1.0×10Copies/μL等3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品RNA/DNA為模板，參考黃國(guó)秋等（2017）的方法，先進(jìn)行單個(gè)病毒檢測(cè)體系優(yōu)化；再以濃度為1.0×10Copies/μL的2種標(biāo)準(zhǔn)品等比混合液為模板，進(jìn)行二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)體系優(yōu)化，以確定最佳的引物和探針濃度。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及敏感性試驗(yàn) 取2.0 μL的10倍梯度系列稀釋MrNV標(biāo)準(zhǔn)品RNA和DIV1標(biāo)準(zhǔn)品DNA同梯度等比混合液（1.0×10~1.0×10Copies/μL）為模板，以優(yōu)化后的二重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行；參考韋信賢等（2020）的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)方程，并判斷方法的敏感性。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 運(yùn)用優(yōu)化后的二重?zé)晒舛縋CR對(duì)MrNV、DIV1、WSSV、IHHNV和EHP的核酸進(jìn)行檢測(cè)，觀察有無(wú)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線及值，評(píng)價(jià)方法的特異性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 以1.0×10、1.0×10和1.0×10Copies/μL等3個(gè)梯度的MrNV標(biāo)準(zhǔn)品RNA和DIV1標(biāo)準(zhǔn)品DNA同梯度等比混合液為模板，分別在第1 d、第7 d和第14 d進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行；計(jì)算組內(nèi)及組間值的變異系數(shù)（CV），評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品和二重?zé)晒舛縋CR的穩(wěn)定性。

1.3 二重?zé)晒舛縋CR臨床應(yīng)用

取300 mg臨床樣品按1.2.2的方法提取病毒核酸，分別用二重?zé)晒舛縋CR和套式PCR（DB 45/T 942—2013和SC/T 7237—2020）對(duì)117份羅氏沼蝦臨床樣品進(jìn)行MrNV和DIV1檢測(cè)，比較2種方法檢測(cè)結(jié)果的吻合度，評(píng)價(jià)二重?zé)晒舛縋CR對(duì)臨床樣品檢測(cè)的可靠性和實(shí)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備及鑒定結(jié)果

分別以MrNV標(biāo)準(zhǔn)品RNA和DIV1標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均可獲得相應(yīng)的目的片段（圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后克隆至pGM-T載體上，經(jīng)PCR篩選、測(cè)序鑒定和BLAST同源比對(duì)，證實(shí)目的片段已正確插入pGM-T載體，表明重組質(zhì)粒pGM-TCP和pGM-T-MCP構(gòu)建成功。分別提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，其中以pGM-T-CP質(zhì)粒線性化DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA濃度為7.6 ng/μL，換算成拷貝數(shù)為4.3×10Copies/μL，OD/OD為1.93，符合標(biāo)準(zhǔn)品的要求；pGM-T-MCP質(zhì)粒的DNA濃度為113 ng/μL，換算成拷貝數(shù)為3.2×10Copies/μL，OD/OD為1.86，也可作為試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 二重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

對(duì)二重?zé)晒舛縋CR的退火溫度、引物和探針使用終濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定反應(yīng)體系20.0 μL：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ10.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4 μL，ExHS（5 U/μL）0.4 μL，MrNV 上、下游引物MrNV-qF/MrNV-qR（10 μmol/L）各0.8 μL和探針MrNV-qP（5 μmol/L）1.2 μL，DIV1上、下游引物DIV1-qF/DIV1-qR（10 μmol/L）及探針DIV1-qP（5 μmol/L）各0.8 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，核酸模板2.0 μL，滅菌DEPC水補(bǔ)足至20.0 μL。以健康無(wú)MrNV和DIV1感染羅氏沼蝦肝胰腺組織提取的核酸為陰性對(duì)照，以滅菌DEPC水為空白對(duì)照。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增操作，其中，反轉(zhuǎn)錄程序：42 ℃5 min，95 ℃10 s；熒光定量PCR擴(kuò)增程序：95 ℃5 s，60 ℃45 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

2.3 二重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用優(yōu)化后的二重?zé)晒舛縋CR對(duì)10倍系列梯度的MrNV標(biāo)準(zhǔn)品RNA和DIV1標(biāo)準(zhǔn)品DNA同梯度等比混合液（1.0×10~1.0×10Copies/μL）進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果（圖2）顯示，高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線呈典型的S形，低濃度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線因擴(kuò)增未達(dá)平臺(tái)期而呈半S形，陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。利用Mx3005P熒光定量PCR儀自帶的軟件進(jìn)行分析，橫坐標(biāo)為起始拷貝數(shù)（）對(duì)數(shù)、縱坐標(biāo)為值（）繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：=-3.558×lg（）+41.85，Eff.（擴(kuò)增效率）和RSq（相關(guān)系數(shù)方值）分別為91.0%和0.994；=-3.489×lg（）+43.53，Eff.和RSq分別為93.5%和0.994?？梢?jiàn)，應(yīng)用TaqMan-MGB探針建立的二重?zé)晒舛縋CR對(duì)MrNV標(biāo)準(zhǔn)品RNA和DIV1標(biāo)準(zhǔn)品DNA均具有很高的擴(kuò)增效率，制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，能實(shí)現(xiàn)同時(shí)定量分析MrNV和DIV1。

2.4 二重?zé)晒舛縋CR的敏感性

二重?zé)晒舛縋CR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，MrNV標(biāo)準(zhǔn)品RNA模板為100和10 Copies/反應(yīng)時(shí)，3 個(gè)平行試驗(yàn)的值分別為34.00、34.23、34.35和37.15、37.46、37.69；DIV1標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板為100和10 Copies/反應(yīng)時(shí)，3個(gè)平行試驗(yàn)的值分別為34.95、34.99、35.36和37.25、38.40、38.87，且均獲得明顯的擴(kuò)增曲線（圖4和圖5），說(shuō)明二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)MrNV和DIV1的靈敏度均低至10 Copies/反應(yīng)。但在實(shí)際應(yīng)用中，為保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，建議以值35.00為界限，當(dāng)值≤35.00且有擴(kuò)增曲線，判定為MrNV或DIV1陽(yáng)性；值>35.00同時(shí)有擴(kuò)增曲線，需重復(fù)檢測(cè)1次，若結(jié)果一致判定為MrNV或DIV1陽(yáng)性，重復(fù)結(jié)果無(wú)擴(kuò)增曲線則判定為MrNV或DIV1陰性。

2.5 二重?zé)晒舛縋CR的特異性

以建立的二重?zé)晒舛縋CR對(duì)蝦類常見(jiàn)主要病原MrNV、DIV1、WSSV、IHHNV和EHP的核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖6）顯示只有MrNV和DIV1出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，對(duì)應(yīng)的值分別為20.69和21.60，判為陽(yáng)性；WSSV、IHHNV、EHP及陰性對(duì)照、空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判為陰性。說(shuō)明建立的二重?zé)晒舛縋CR對(duì)MrNV和DIV1具有較強(qiáng)的特異性。

2.6 二重?zé)晒舛縋CR的重復(fù)性

以3個(gè)不同濃度（1.0×10、1.0×10和1.0×10Copies/μL）MrNV標(biāo)準(zhǔn)品RNA和DIV1標(biāo)準(zhǔn)品DNA等比混合液為模板的重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明，二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)MrNV的組內(nèi)試驗(yàn)變異系數(shù)為0.31%~0.93%，組間試驗(yàn)變異系數(shù)為0.96%~1.33%；二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)DIV1的組內(nèi)試驗(yàn)變異系數(shù)為0.35%~0.81%，組間試驗(yàn)變異系數(shù)為0.78%~1.04%。表明以建立的二重?zé)晒舛縋CR對(duì)MrNV和DIV1進(jìn)行檢測(cè)具有較好的重復(fù)性，同時(shí)證實(shí)制備的MrNV標(biāo)準(zhǔn)品RNA和DIV1標(biāo)準(zhǔn)品DNA均具有很好的穩(wěn)定性，可作為標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照使用。

2.7 二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)臨床樣品的適用性

應(yīng)用建立的二重?zé)晒舛縋CR和國(guó)內(nèi)現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)的套式PCR分別對(duì)117份羅氏沼蝦臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表3和表4所示。在MrNV檢測(cè)（表3）中，有6份樣品用2種方法檢測(cè)均呈陽(yáng)性，值為19.37~34.13，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線=-3.558×lg（）+41.85計(jì)算，得知MrNV拷貝數(shù)在1.48×10~2.08×10Copies/反應(yīng)，羅氏沼蝦組織中的MrNV含量為3.7×10~5.2×10Copies/mg；有1份樣品的二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)呈陽(yáng)性而套式PCR檢測(cè)呈陰性，值為36.71，MrNV拷貝數(shù)為28 Copies/反應(yīng)，羅氏沼蝦組織中的MrNV含量約7 Copies/mg；有110份樣品經(jīng)2種方法檢測(cè)均呈陰性，即2種檢測(cè)方法的符合率為99.15%。

在DIV1檢測(cè)（表4）中，有11份樣品經(jīng)2種方法檢測(cè)均呈陽(yáng)性，值為17.12~34.89，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線=-3.489×lg（）+43.53計(jì)算，得知DIV1拷貝數(shù)在2.99×10~3.71×10Copies/反應(yīng)，羅氏沼蝦組織中的DIV1含量為7.5×10~9.3×10Copies/mg；有2份樣品的二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)呈陽(yáng)性而套式PCR檢測(cè)呈陰性，值分別為36.43和37.16，DIV1拷貝數(shù)為108和67 Copies/反應(yīng)，羅氏沼蝦組織中的DIV1含量約27和17 Copies/mg；有103份樣品經(jīng)2種方法檢測(cè)均呈陰性，即2種檢測(cè)方法的符合率為97.44%。

3 討論

羅氏沼蝦具有抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣及市場(chǎng)價(jià)格穩(wěn)定等特點(diǎn)，是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主要蝦品種。近年來(lái)，由于對(duì)蝦養(yǎng)殖病害頻發(fā)、養(yǎng)成率低、風(fēng)險(xiǎn)高，許多對(duì)蝦養(yǎng)殖戶轉(zhuǎn)養(yǎng)羅氏沼蝦，加上稻田、藕田及魚(yú)蝦混養(yǎng)等養(yǎng)殖模式的推廣，羅氏沼蝦養(yǎng)殖掀起小高潮，其病害問(wèn)題也引起廣泛關(guān)注（羅福廣等，2022；羅紅等，2022）。近幾年對(duì)羅氏沼蝦病害的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，MrNV和DIV1已成為羅氏沼蝦養(yǎng)殖中危害最嚴(yán)重的病毒性病原（李清和陳家勇，2020；羅紅等，2022）；對(duì)親蝦和苗種進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，切斷病毒傳入途經(jīng)，是目前預(yù)防病毒病最有效的防控措施。因此，快速、準(zhǔn)確檢測(cè)MrNV和DIV1對(duì)有效防控WTD和DIV1D暴發(fā)與流行具有重要意義。PCR是病毒核酸檢測(cè)最理想的方法，分別針對(duì)MrNV和DIV1的套式PCR、熒光定量PCR均已有研究報(bào)道（童桂香等，2012；黃光華等，2015；Qiu et al.，2018；韋信賢等，2020）；但在羅氏沼蝦的親蝦篩選、苗種檢疫及疫病監(jiān)測(cè)等實(shí)際檢測(cè)工作中采用單重?zé)晒舛縋CR對(duì)MrNV和DIV1進(jìn)行檢測(cè)存在操作繁瑣、耗時(shí)耗力等局限，因此亟需研發(fā)出一種能同時(shí)檢測(cè)MrNV和DIV1的二重?zé)晒舛縋CR，以提高M(jìn)rNV和DIV1的檢測(cè)效率。

本研究根據(jù)MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因?yàn)椴《局饕δ芑蚯冶Ｊ匦愿叩奶攸c(diǎn)，以及Taq‐Man-MGB探針的優(yōu)勢(shì)（韋信賢等，2010），分別在MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物及TaqMan-MGB探針；并制備重組質(zhì)粒pGM-T-CP和pGM-T-MCP，分 別 以pGM-TCP質(zhì)粒DNA體外轉(zhuǎn)錄合成的RNA和pGM-TMCP質(zhì)粒DNA為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)退火溫度及引物和探針使用濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立能同時(shí)檢測(cè)MrNV和DIV1的二重?zé)晒舛縋CR。結(jié)果表明，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄合成的MrNV標(biāo)準(zhǔn)RNA及制備的DIV1標(biāo)準(zhǔn)DNA純度高、穩(wěn)定性好，可作為標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照；起始模板在1×10~1×10Copies/反應(yīng)時(shí)，核酸模板濃度對(duì)數(shù)與值具有良好的線性關(guān)系，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能準(zhǔn)確反映目的產(chǎn)物的擴(kuò)增效果；進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的檢測(cè)靈敏度可達(dá)10 Copies/反應(yīng)，對(duì)羅氏沼蝦組織的檢測(cè)靈敏度約10 Copies/mg；且與其他蝦類的常見(jiàn)病原無(wú)交叉反應(yīng)，組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于2.00%，具有較好的重復(fù)性。此外，擴(kuò)增過(guò)程和產(chǎn)物分析同步完成，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程能控制在1 h左右。可見(jiàn)，建立的二重?zé)晒舛縋CR具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，可滿足臨床上同時(shí)檢測(cè)MrNV和DIV1的需求。

應(yīng)用建立的二重?zé)晒舛縋CR和國(guó)內(nèi)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的套式PCR同時(shí)對(duì)117份羅氏沼蝦臨床樣品進(jìn)行MrNV和DIV1檢測(cè)，結(jié)果顯示，對(duì)MrNV檢測(cè)的符合率為99.15%，對(duì)DIV1檢測(cè)的符合率為97.44%，同為陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的樣品含目標(biāo)病毒拷貝數(shù)較高（>100 Copies/mg），而檢測(cè)結(jié)果不一致的樣品含目標(biāo)病毒拷貝數(shù)較低（<100 Copies/mg）；此外，部分目標(biāo)病毒拷貝數(shù)低的樣品采用二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)呈陽(yáng)性，而套式PCR檢測(cè)呈陰性，說(shuō)明采用二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)目標(biāo)病毒拷貝數(shù)較低樣品時(shí)較套式PCR具有更高的靈敏度，可為WTD和DIV1D的臨床診斷及病原常規(guī)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)保障。在DIV1檢測(cè)中，存在套式PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性而二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)呈陰性的樣品，因此在二重?zé)晒舛縋CR的實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)弱陽(yáng)性樣品（值>35.00）的重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線時(shí)，可采用套式PCR進(jìn)行再次驗(yàn)證，以防漏檢，確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性。羅氏沼蝦臨床樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，2020年MrNV和DIV1的陽(yáng)性檢出率分別為6.0%和11.0%，即MrNV和DIV1感染在養(yǎng)殖羅氏沼蝦中存在零星流行，尤其是病毒在蝦體中呈潛伏期感染應(yīng)引起相關(guān)管理部門(mén)和從業(yè)者的重視和警惕。

4 結(jié)論

結(jié)合TaqMan-MGB探針技術(shù)建立的二重?zé)晒舛縋CR能同時(shí)檢測(cè)MrNV和DIV1，且具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，可為WTD和DIV1D的臨床診斷及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)保障。