樊豐夷 藍天座 楊 旸 鄧 超 張 春 羅安電

(貴州省貴陽市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，貴陽市 550004)

急性痛風性關節(jié)炎(gouty arthritis，GA)是因尿酸沉積在關節(jié)囊韌帶、滑膜、軟骨等關節(jié)組織中而引起的一種急性風濕性病變。流行病學研究表明，進食飲料、啤酒及大量紅肉、貝類、脂肪是急性GA發(fā)作的主要原因[1]。近年來，急性GA在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率呈上升趨勢[2]。在急性GA的發(fā)生和發(fā)展過程中，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor 3，NALP3)起著重要作用，NALP3炎性小體主要表達于中性粒細胞、單核巨噬細胞等初級免疫細胞，這些細胞主要位于皮膚、關節(jié)、眼睛、耳朵和胃腸上皮組織的內(nèi)表面[3]。尿酸鈉晶體(monosodium urate，MSU)可誘導NALP3炎性小體的構(gòu)象變化，一旦NALP3炎性小體被激活，可導致Caspase-1促進白細胞介素前體1β(precursor interleukin 1β，pro-IL-1β)的切割和成熟，釋放激活的白細胞介素(interleukin，IL)-1β，引發(fā)下游中性粒細胞活化，導致炎癥加劇[4]。深入研究NALP3炎性小體的信號傳導途徑，或可為有效地治療急性GA提供新的靶點。研究表明，miR-146a可以調(diào)控大鼠的1 195個靶基因，包括腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和IL-6[5]。然而miR-146a是否可以通過調(diào)節(jié)NALP3炎性小體信號傳導途徑來影響急性GA的發(fā)生和發(fā)展尚不清楚。因此，本研究探討miR-146a對急性GA大鼠模型炎癥反應的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級雄性SD大鼠40只，6～8周齡，體重(200.0±20.0)g，由成都碩達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(川)2019-031。嚴格按照動物實驗室的標準對所有大鼠進行喂養(yǎng)，大鼠自由進食和飲水。

1.1.2 主要試劑和儀器：MSU(批號：108K53098)購自美國Sigma公司；agomiR-146a(批號：miR40000830-4-5)、antagomiR-146a(批號：miR40000830-4-5)購自廣州銳博公司；RNA提取試劑盒(批號：vs18061730)購自合肥博美生物科技有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒(批號：N116)購自南京建成公司；二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(貨號：P0009)購自上海碧云天生物；GAPDH(批號：B661204)購自生工生物工程上海有限公司；IL-6(批號：ZC-36404)、IL-1β(批號：ZC-36391)和TNF-α(批號：ZC-37624)ELISA試劑盒購自上海茁彩生物公司；一抗pro-IL-1β抗體(批號：ab254360)、NALP3抗體(批號：ab263899)，內(nèi)參β-actin抗體(批號：ab8226)，以及二抗生物素化山羊抗兔IgG(批號：ab6721)均購自英國Abcam公司。TB718型生物組織包埋機購自湖北泰維電子有限公司；MK3型酶標儀購自美國Thermo公司；Tanon-5200 Multi型凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司；BA210Digital型數(shù)碼三目攝像顯微鏡購自麥克奧迪實業(yè)集團有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組和急性GA大鼠模型建立：按隨機數(shù)字表法將大鼠分為空白組、模型組、agomiR-146a組、antagomiR-146a組，每組10只。除空白組外，其余各組均采用單側(cè)踝關節(jié)腔注射200 μL MSU溶液(2.5 g/100 mL)的方法建立急性GA大鼠模型，以關節(jié)囊對側(cè)鼓起為造模成功的標準[6]，造模過程無大鼠死亡。于造模當天及造模后3 d、5 d、7 d、10 d，分別于agomiR-146a組、antagomiR-146a組大鼠踝關節(jié)腔內(nèi)注射10 μL agomiR-146a、10 μL antagomiR-146a，于空白組、模型組大鼠踝關節(jié)腔內(nèi)注射等量生理鹽水。

1.2.2 大鼠滑膜組織病理學觀察：造模后10 d踝關節(jié)腔內(nèi)注射藥物后2 h，采用頸椎脫臼法處死各組大鼠，取以受試踝關節(jié)為中心的上下1 cm部位，快速分離出踝關節(jié)滑膜組織，一部分置于-80 ℃低溫保存，另一部分置于4%多聚甲醛中固定。將置于4%多聚甲醛中固定的滑膜組織經(jīng)全自動脫水機脫水后，行包埋、制作切片，蘇木精染色10～20 min后，自來水沖洗1～3 min，然后用鹽酸酒精分化5～10 s，自來水沖洗1～3 min后，放入50 ℃的溫水中或用弱堿性水溶液返藍，直到出現(xiàn)藍色為止，自來水沖洗1～3 min，放入85%的酒精3～5 min，伊紅染色3～5 min，水洗3～5 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，采用BA210Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡觀察組織的病理變化情況。

1.2.3 ELISA檢測滑膜組織中炎癥細胞因子的表達水平：取于-80 ℃低溫保存的滑膜組織(1 cm×1 cm)，將其剪切成4 mm×4 mm大小，并置于EP管中，加入適量的組織裂解緩沖液，然后用研磨機充分粉碎。將組織置于冰上靜置15 min，然后在4 ℃下以5 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個新的EP管中，按照ELISA試劑盒的說明書檢測滑膜組織中炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6的表達水平。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測滑膜組織NALP3、TNF-α、IL-1β的mRNA表達量：取于-80 ℃低溫保存的滑膜組織50 mg，置于EP管中，用冰塊研磨機研磨組織，加入TRIzol試劑，直至總體積為1 mL，孵育5 min后，加入氯仿，猛烈搖動15 s，孵育15 min后，將水層轉(zhuǎn)移到另一根新的EP管中，然后加入異丙醇，4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，4 ℃下以5 000 r/min離心3 min，棄上清，EP管底部的沉淀即為RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過實時熒光定量PCR檢測mRNA的表達量。NALP3引物序列為5′-CGTGGTTTCCTCCTTTTGTATT-3′(正向)、5′-CGACCTCCTCTCCTCTCTTCTT-3′(反向)；TNF-α引物序列為5′-ACAAAGGTGCCGCTAACCACATGT-3′(正向)、5′-ATGCTGCTGTTTCAGTCGAAGGCA-3′(反向)；IL-1β引物序列為5′-GGGCCTCAAAGGAAAGAATC-3′(正向)、5′-CTCTGCTTGTGAGGTGCTGA-3′(反向)；GAPDH引物序列為5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAGTCA-3′(正向)、5′-CCACGACATACTCAGCACCAGCATCA-3′(反向)。PCR反應體系見表1。反應條件為94 ℃反應5 min，94 ℃反應30 s，57 ℃反應30 s，72 ℃反應30 s，共40個循環(huán)，72 ℃反應5 min。以GAPDH為對照基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 PCR反應體系

1.2.5 Western blot檢測NALP3、pro-IL-1β蛋白的表達水平：取于-80 ℃低溫保存的滑膜組織50 mg，加入RIPA裂解液(質(zhì)量比為組織 ∶裂解液=1 ∶10)，用滅菌剪刀將組織剪碎，置于碎冰上裂解10 min，收集裂解液，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min后，取上清液，用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。然后進行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜在含5%脫脂牛奶的封閉液中室溫封閉2 h后，在4 ℃下與pro-IL-1β、NALP3、β-actin一抗(1 ∶1 000)孵育過夜。用Tris緩沖鹽溶液和TBST洗滌3次(5 min/次)后，將膜與相應的二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育1 h，通過增強化學發(fā)光顯影，使用凝膠成像儀掃描及記錄數(shù)據(jù)，以β-actin為內(nèi)參計算目的蛋白的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠滑膜組織的病理學變化 空白組大鼠滑膜組織結(jié)構(gòu)清晰完整，未見明顯病理改變。模型組大鼠滑膜組織襯里下層有大量炎性細胞浸潤，可見大量淋巴細胞聚集成團，并有大量纖維組織增生，成纖維細胞核呈橢圓形。agomiR-146a組大鼠滑膜組織結(jié)構(gòu)清晰完整，襯里層由單層或雙層滑膜細胞組成，排列疏松且部分不連續(xù)，襯里下層結(jié)構(gòu)疏松，可見較多的脂肪細胞、少量成纖維細胞、巨噬細胞和少量血管組成的結(jié)締組織，無炎性細胞浸潤及纖維組織增生。antagomiR-146a組滑膜組織襯里下層可見大量炎性細胞浸潤，并有較多纖維組織增生，成纖維細胞核呈橢圓形。見圖1。

圖1 4組大鼠滑膜組織病理變化(HE染色，×400)

2.2 4組大鼠滑膜組織TNF-α、IL-1、IL-6表達水平的比較 與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織的TNF-α、IL-1、IL-6表達水平均升高(均P<0.05)；與模型組比較，agomiR-146a組大鼠滑膜組織的TNF-α、IL-1、IL-6表達水平均降低，而antagomiR-146a組上述指標升高(均P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠滑膜組織TNF-α、IL-1、IL-6表達水平的比較(x±s)

2.3 4組大鼠滑膜組織NALP3、TNF-α、IL-1β mRNA表達水平的比較 與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織的NALP3、TNF-α、IL-1β mRNA表達水平均高于空白組(均P<0.05)；與模型組比較，agomiR-146a組大鼠滑膜組織的NALP3、TNF-α、IL-1β mRNA表達水平均降低(均P<0.05)；而antagomiR-146a組大鼠滑膜組織的NALP3、TNF-α、IL-1β mRNA表達水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 4組大鼠滑膜組織NALP3、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達水平的比較(x±s)

2.4 4組大鼠滑膜組織NALP3、pro-IL-1β蛋白表達水平的比較 與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織的NALP3、pro-IL-1β蛋白表達水平均高于空白組(均P<0.05)；與模型組比較，agomiR-146a組大鼠滑膜組織的NALP3、pro-IL-1β蛋白表達水平均降低(均P<0.05)；而antagomiR-146a組大鼠滑膜組織的NALP3、pro-IL-1β蛋白表達水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表4、圖2。

表4 4組大鼠滑膜組織NALP3、pro-IL-1β蛋白表達水平的比較(x±s)

3 討 論

近年來，急性GA的發(fā)病率明顯升高，已成為中國最常見的炎癥性關節(jié)疾病，且男性的急性GA發(fā)病率遠遠高于女性[6]。因此，尋找有效治療急性GA的新靶點具有重要意義。研究表明，miR-146a在經(jīng)脂多糖刺激的人單核/巨噬細胞中表達上調(diào)；在MSU作用4 h后，miR-146a在骨髓源性巨噬細胞中的表達也上調(diào)[7-8]。在類風濕性關節(jié)炎滑膜組織中miR-146a的水平顯著降低，并且負向調(diào)節(jié)炎癥[9]。此外，miR-146a的表達與IL-1β的基因表達平行，提示miR-146a在MSU誘導的炎癥反應中起關鍵作用，其作用可能與IL-1β密切相關[10]。IL-1β可將中性粒細胞招募到滑膜和關節(jié)中[11]。pro-IL-1β是在Toll樣受體(toll-like receptors，TLR)途徑激活的基礎上合成的，NALP3炎性小體可促進其成熟[12]。有學者認為，腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)和白細胞介素1受體相關激酶1(interleukin 1 receptor-associated kinase 1，IRAK1)是TLR信號通路中公認的兩個關鍵靶基因，而miR-146a作為TLR4/IRAK1/TRAF6/核因子κB信號通路的顯性負調(diào)控因子，其被敲除后，對TRAK6和IRAK1功能的抑制作用減弱，從而促進促炎細胞因子的產(chǎn)生，加重MSU誘導的GA[13]。此外，研究表明，MSU可以觸發(fā)NALP3炎性小體的激活，最終導致IL-1β的產(chǎn)生[14]。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在miR-146a基因敲除小鼠的巨噬細胞中，NALP3炎性小體的mRNA表達水平升高。然而，miR-146a調(diào)節(jié)急性GA發(fā)生的機制尚不清楚，此外，在體內(nèi)干預miR-146a的表達是否能延緩急性GA的進展尚未明確。

本研究采用踝關節(jié)腔注射MSU的方法建立急性GA大鼠模型，并進行miR-146a表達的干預，隨后檢測GA大鼠滑膜組織中NALP3、炎癥因子的表達水平。結(jié)果顯示，miR-146a高表達明顯抑制急性GA大鼠滑膜組織中TNF-α mRNA、IL-1β mRNA和pro-IL-1β蛋白表達水平，以及炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6的表達水平，這提示miR-146a可能參與急性GA炎癥的負反饋調(diào)節(jié)。目前尚無研究表明miR-146a可直接靶向NALP3炎性小體成分，但有生物信息學研究表明NAPL3不包含miR-146a的結(jié)合位點[16]。本研究結(jié)果提示miR-146a高表達可抑制急性GA大鼠滑膜組織中NALP3 mRNA和蛋白的表達水平。由此推測，miR-146a可能通過間接靶向NALP3炎性小體來促進IL-1β的激活，從而參與急性GA的發(fā)生。但本研究中，抑制miR-146a的表達后NALP3的表達水平并無明顯變化，或許還存在一些未知的調(diào)節(jié)機制，今后仍需深入研究以探討其作用。

綜上所述，miR-146a高表達可降低急性GA模型大鼠踝關節(jié)滑膜組織的炎癥因子水平，抑制其踝關節(jié)滑膜組織NALP3的激活，其有望成為治療急性GA的新靶點。