高 娟，劉 鈺，邢海洲

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450052)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以骨髓內(nèi)惡性漿細(xì)胞的異常浸潤和積累為特征。雖然蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)藥物、自體干細(xì)胞移植等新藥或新療法的應(yīng)用顯著提高了MM患者5年生存率，但MM仍無法治愈，且具有嚴(yán)重的毒副作用和繼發(fā)癌癥風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。因此，尋找新的藥物或治療策略提高M(jìn)M治療效果、改善患者生活質(zhì)量顯得至關(guān)重要。南蛇藤為衛(wèi)矛科南蛇藤屬落葉藤狀灌木，其根莖入藥，具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)止痛、活血解毒等功效作用[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，南蛇藤通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移侵襲、凋亡、自噬、周期分布在多種人類癌癥中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用[3-4]。但南蛇藤對MM細(xì)胞生物學(xué)功能的影響尚不清楚。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類內(nèi)源性進(jìn)化保守的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本，其通過表觀遺傳修飾或微小RNA(microRNA，miRNA)調(diào)控等機(jī)制調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和mRNA翻譯在MM進(jìn)展中發(fā)揮致癌基因或抑癌基因作用，是潛在的藥物作用靶點(diǎn)[5-6]。LINC00472是位于染色體6q13上的lncRNA，據(jù)報(bào)道LINC00472表達(dá)下調(diào)與非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展和疾病復(fù)發(fā)有關(guān)，上調(diào)LINC00472表達(dá)可抑制腫瘤生長以及腫瘤細(xì)胞的侵襲行為[7]。然而，目前尚未證據(jù)表明LINC00472在MM中的功能。本研究通過觀察南蛇藤提取物、LINC00472對MM細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討南蛇藤提取物和LINC00472相互作用，為南蛇藤用于MM臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑MM細(xì)胞U-1996購于中科院上海細(xì)胞庫；小干擾RNA序列(si-RNA)、過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-RNA)、PCR引物由上海生工公司提供；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin-V-FITC/propidium iodide，PI)試劑盒購于武漢金開瑞生物公司；RNeasy Mini試劑盒購于北京天根生化科技公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix EX Taq試劑盒購于大連寶生物公司；兔源β-肌動蛋白(β-actin)、細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase-3)、磷酸化的磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphorylated phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，p-PI3K)、磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-Akt)和羊抗兔IgG購于上海艾博抗生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1南蛇藤提取物制備 參考王海波等[8]實(shí)驗(yàn)方法制備南蛇藤提取物，步驟如下：將南蛇藤莖粉碎，用95%乙醇加熱回流3次，回收溶劑后干燥，加水分散，以石油醚和乙酸乙酯分別萃取3次，回收溶劑后減壓濃縮后真空凍干，得到南蛇藤提取物。使用前加入適量二甲基亞砜稀釋溶液，用培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度，過濾除菌后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 將對數(shù)期U-1996細(xì)胞采用含0、70、140、280 mg·L-1南蛇藤提取物的RPMI-1640培養(yǎng)基在含5% CO2、37 ℃無菌恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)48 h，CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot分別檢測細(xì)胞活力、凋亡率以及CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)，確定南蛇藤提取物使用濃度(140 mg·L-1)。設(shè)置對照(normal control，NC)組(不做處理)、南蛇藤提取物組(140 mg·L-1南蛇藤提取物孵育48 h)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-LINC00472組(轉(zhuǎn)染si-LINC00472)、pcDNA-NC組(轉(zhuǎn)染pcDNA-NC)、pcDNA-LINC00472組(轉(zhuǎn)染pcDNA-LINC00472)、南蛇藤提取物+si-NC組(140 mg·L-1南蛇藤提取物孵育轉(zhuǎn)染si-NC成功細(xì)胞48 h)和南蛇藤提取物+si-LINC00472組(140 mg·L-1南蛇藤提取物孵育轉(zhuǎn)染si-LINC00472成功細(xì)胞48 h)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照Lipfectamine 2000說明書進(jìn)行。

1.2.3CCK-8法檢測細(xì)胞活力 將未轉(zhuǎn)染U-1996細(xì)胞、轉(zhuǎn)染U-1996細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種96孔板，貼壁后按照1.2.2分組加入對應(yīng)濃度的南蛇藤提取物進(jìn)行處理。結(jié)束后，每孔添加CCK-8溶液10 μL繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度(absorbance，A)值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 結(jié)合緩沖液重懸各組U-1996細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液。向100 μL細(xì)胞懸液中分別加入5 μL的Annexin V-FITC、PI室溫避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率為早期(Annexin V-FITC染色陽性，PI染色陰性)和晚期凋亡率(Annexin V-FITC和PI染色均為陽性)之和。

1.2.5實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)試劑盒檢測LINC00472表達(dá) RNeasy Mini試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反向轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Premix EX Taq試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。β-actin作為LINC00472的內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算LINC00472相對表達(dá)量。LINC00472上游5′-GATGGCAGCTGTCTCTC TCC-3′，下游5′-GGGCCTCTCTGACCGTATCT-3′；β-actin上游5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′。

1.2.6蛋白質(zhì)印記檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液提取細(xì)胞中總蛋白。4 ℃冰孵育30 min，8 000g離心10 min收集上清。總蛋白濃度用二喹啉甲酸試劑盒測定。用適量的2× 緩沖液與等體積蛋白混勻100 ℃煮沸5 min后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白分離。利用濕法轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉膜1 h，一抗室溫孵育膜1 h，二抗室溫孵育膜1 h。將增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的溶液A和溶液B在避光條件下混合后滴加到膜上，然后使用凝膠成像儀進(jìn)行曝光。Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)采集圖像，Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析。相對蛋白表達(dá)量以對應(yīng)蛋白帶灰度值與β-actin蛋白帶灰度值的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度南蛇藤提取物對U-1996細(xì)胞增殖的影響與NC組比較，南蛇藤提取物(70、140、280 mg·L-1)處理組U-1996細(xì)胞活力、CyclinD1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見Tab 1和Fig 1。

Fig 1 Expression of CyclinD1 protein detected by Western blot

2.2 南蛇藤提取物對U-1996細(xì)胞凋亡的影響與NC組比較，南蛇藤提取物(70、140、280 mg·L-1)處理組U-1996細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見Fig 2。

Fig 2 Effect of Celastrus orbiculatus extract on U-1996 cell apoptosis

2.3 南蛇藤提取物對LINC00472表達(dá)的影響與NC組比較，南蛇藤提取物組U-1996細(xì)胞LINC00472的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見Tab 2。

Tab 1 Effect of Celastrus orbiculatus extract at different concentrations on U-1996 cell proliferation

Tab 2 Effect of Celastrus orbiculatus extract on expression of LINC00472

2.4 LINC00472對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞U-1996增殖和凋亡的影響與pcDNA-NC組比較，pcDNA-LINC00472組U-1996細(xì)胞LINC00472表達(dá)明顯升高，細(xì)胞活力、CyclinD1蛋白表達(dá)明顯降低，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與si-NC組比較，si-LINC00472組U-1996細(xì)胞LINC00472表達(dá)明顯降低，細(xì)胞活力、CyclinD1蛋白表達(dá)明顯升高，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見Tab 3和Fig 3。

Fig 3 Effect of LINC00472 on proliferation and apoptosis of multiple myeloma cells U-1996

2.5 抑制LINC00472表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)南蛇藤提取物對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞U-1996增殖和凋亡的影響與南蛇藤提取物+si-NC組比較，南蛇藤提取物+si-LINC00472組U-1996細(xì)胞LINC00472表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞活力、CyclinD1蛋白表達(dá)明顯升高，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見Tab 4和Fig 4。

Tab 3 Effect of LINC00472 on proliferation and apoptosis of MULTIPLE myeloma cell U-1996

Tab 4 Inhibition of LINC00472 expression could reverse effect of Celastrus orbiculatus extract on U-1996 proliferation and apoptosis of multiple myeloma cells

Fig 4 Inhibiting LINC00472 expression could reverse effect of Celastrus orbiculatus extract on proliferation and apoptosis of multiple myeloma cells U-1996

2.6 PI3K/Akt信號通路蛋白的表達(dá)水平的變化與NC組比較，南蛇藤提取物組、pcDNA-LINC00472組U-1996細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt水平明顯降低，si-LINC00472組U-1996細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt水平明顯升高(P<0.05)；與南蛇藤提取物+si-NC組比較，南蛇藤提取物+si-LINC00472組U-1996細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt水平明顯(P<0.05)。見Tab 5和Fig 5。

Fig 5 Expression of p-PI3K and p-Akt proteins detected by Western blot

Tab 5 Expression levels of PI3K/Akt signaling pathway proteins

3 討論

南蛇藤在我國已有數(shù)千年的用藥歷史，除具有抗菌、抗炎等藥理活性，其還具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用。Hao等[9]研究顯示，南蛇藤提取物可減弱人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)程、抑制MMP表達(dá)和肌動蛋白組裝，從而抑制腫瘤細(xì)胞在體外的黏附、遷移和侵襲。Wang等[10]指出南蛇藤提取物可增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的caspase依賴性細(xì)胞凋亡凋亡途徑激活，增加順鉑治療后凋亡細(xì)胞數(shù)量，提高胃癌細(xì)胞順鉑敏感性。此外，南蛇藤提取物通過抑制腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲在肝癌中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤作用[11]。與上述報(bào)道一致，本研究結(jié)果顯示南蛇藤提取物以劑量依賴方式降低MM細(xì)胞U-1996活力和促增殖蛋白CyclinD1表達(dá)，增加細(xì)胞凋亡率和促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3表達(dá)，提示南蛇藤提取物通過調(diào)控MM細(xì)胞增殖和凋亡在MM中具有抗腫瘤作用。

lncRNA是一類內(nèi)源性長鏈非編碼RNA，其通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、自噬和耐藥等生物學(xué)過程，其表達(dá)失調(diào)與MM進(jìn)展密切相關(guān)[13-14]。本研究中南蛇藤提取物干預(yù)后U-1996細(xì)胞中LINC00472表達(dá)顯著升高，提示南蛇藤提取物的抗腫瘤作用可能與調(diào)控LINC00472表達(dá)有關(guān)。前人研究顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞中LINC00472表達(dá)降低，上調(diào)Linc00472可抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是癌癥治療的潛在靶標(biāo)[15]。肝癌中LINC00472通過靶向miR-93-5p抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]。此外，苦參堿通過上調(diào)LINC00472抑制PI3K/Akt對膀胱癌的細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移以及腫瘤形成具有抑制作用[17]。本研究中轉(zhuǎn)染pcDNA-LINC00472上調(diào)LINC00472表達(dá)可明顯降低U-1996細(xì)胞活力、CyclinD1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、Cleaved-caspase-3表達(dá)，而轉(zhuǎn)染si-LINC00472下調(diào)LINC00472表達(dá)具有相反作用，提示LINC00472在MM中具有抑癌作用?；謴?fù)實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)LINC00472還可降低南蛇藤提取物對U-1996細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，恢復(fù)細(xì)胞的增殖能力和凋亡水平，這進(jìn)一步說明南蛇藤提取物通過上調(diào)LINC00472表達(dá)在MM中發(fā)揮抗腫瘤作用。

PI3K/Akt信號通路參與MM細(xì)胞生長、存活、凋亡、遷移和耐藥，其異常激活對MM進(jìn)展具有促進(jìn)作用[18]。此外，PI3K/Akt信號通路在南蛇藤提取物調(diào)控的許多人類癌癥中起著關(guān)鍵作用。例如，南蛇藤提取物通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究顯示，南蛇藤提取物干預(yù)、上調(diào)LINC00472表達(dá)均可抑制PI3K/Akt信號通路活化，而下調(diào)LINC00472表達(dá)缺促進(jìn)激活。此外，下調(diào)LINC00472表達(dá)還可減弱南蛇藤提取物對PI3K/Akt信號通路的抑制作用，提示抑制PI3K/Akt激活是南蛇藤提取物在MM中發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制。然而，本研究僅在一個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，后續(xù)將在多種MM細(xì)胞系中驗(yàn)證南蛇藤提取物的腫瘤活性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)南蛇藤提取物通過上調(diào)LINC00472表達(dá)抑制PI3K/Akt信號通路進(jìn)而抑制MM細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這為MM的發(fā)病機(jī)制提供新的認(rèn)識，為南蛇藤提取物用于治療MM提供理論依據(jù)。