華 樺，劉 芳，劉 俐，羅 園，曾安琪，戴 瑛，尹竹君，趙軍寧

(1. 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院、四川省中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心國家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評價重點研究室、四川省道地藥材形成原理與品質(zhì)評價工程研究中心四川省道地藥材系統(tǒng)開發(fā)工程技術(shù)研究中心中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)四川省重點實驗室，2. 四川大學(xué)華西藥學(xué)院，3. 成都市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川 成都 610041)

俄色為薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)隴東海棠系( M.kansuensis)植物變?nèi)~海棠Malustoringoides(Rehd)Hughes.和花葉海棠Malustransitoria(Batal)Schneid.干燥葉及葉芽[1]，經(jīng)考證藏族人民有用其葉制作飲品使用的習(xí)慣，藏醫(yī)中的傳統(tǒng)用法為：取適量“俄色”，和酥油同煮后口服，因其味酸，性溫，具有消解培根的功效，可緩解“京尼薩庫”癥狀和降低人體脂肪，用于治療消化不良、高血壓病，降血脂、降血糖等[2-8]?！熬┠崴_庫”病屬現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“糖脂代謝障礙疾病”范疇。糖尿病(diabetes mellitus，DM)及代謝綜合征(metabolic syndrome, MS)都是以胰島素抵抗(insulin resistance, IR)為共同病理基礎(chǔ)，糖調(diào)節(jié)受損造成的全身性進行性疾病。本文通過研究俄色提取物對自發(fā)性2型糖尿病模型KK-Ay小鼠的血糖、胰島素耐量、血清胰島素水平、胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)、病理、胰腺組織蛋白含量等的影響，探討其對2型糖尿病胰島素抵抗的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 藥物俄色是薔薇科蘋果屬植物變?nèi)~海棠Malustoringoides(Rehd)Hughes.的葉，本研究所用的藥材由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源與種植研究所提供，并由周先建副研究員鑒定。俄色提取物，由四川省中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心制備，批號：20200527。制備工藝：取適量俄色藥材，稱定質(zhì)量，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入10倍量水，加熱微沸提取1 h，過濾，濾液保存?zhèn)溆茫瑸V渣加入10倍量水后再次加熱微沸提取1 h，過濾，合并兩次濾液，濃縮濾液，得到俄色水提物浸膏(以生藥材計，每g浸膏含生藥3.23 g)。取適量俄色提取物浸膏，加適量蒸餾水溶解后定容至相應(yīng)濃度備用。愛能(羅格列酮片)，批號：200512，規(guī)格：4 mg/片，由成都恒瑞制藥有限公司生產(chǎn)。取羅格列酮片4 mg置于研缽中研細，加入適量蒸餾水研磨均勻后定容至相應(yīng)濃度備用。

1.2 動物8周齡SPF級，♂，KK-Ay小鼠70只，8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠10只，均購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證編號：SCXK(京)2019-0008。實驗動物環(huán)境符合國家兔、大鼠、豚鼠、小鼠屏障系統(tǒng)使用設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)，通過四川省實驗動物管理委員會倫理審查，許可證號SYXK(川)2018-100。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境：溫度(20±1)℃，相對濕度60%±5%，明暗周期12 h，KK-Ay小鼠高脂飼料(蛋白質(zhì)17.5%、碳水化合物48.5%、脂肪17.9%，北京華阜康生物科技股份有限公司)喂養(yǎng)，C57小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.3 試劑Mouse INS ELISA KIT(貨號：ZC-38920)，上海茁彩生物公司；GLP-1兔單克隆抗體(批號ab133329)，abcam公司；山羊抗兔工作液(批號：SP-9001)，正常山羊血清(批號：ZLI-9021)，濃縮型DAB試劑盒(批號：K135925C)，北京中杉金橋生物有限公司；羅氏(Roche)公司TUNEL試劑盒(批號：11684795910)，瑞士羅氏公司(Roche Group)。

1.4 儀器羅氏卓越型血糖儀及配套血糖試紙(德國羅氏診斷有限公司，批號:478100)；InfiniteM200酶標(biāo)儀(Tecan公司)；轉(zhuǎn)輪式切片機(徠卡-2016)；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋機(常州郊區(qū)中威電子儀器廠)；數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0(Media Cybernetics)，Pannoramic 250型全景數(shù)字幻燈片掃描儀(3Dhisech)；SpectraMAX Plus384酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)；分析天平(最小分度值d=0.000 1 g，博特勒-托利多儀器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1分組與給藥 70只8周齡♂ SPF級KK-Ay小鼠，體質(zhì)量(18～20) g，高脂飼料喂養(yǎng)14 d后，上午十點開始禁食，禁食不禁水4 h，測定小鼠空腹血糖，血糖值大于11.1 mol·L-1的小鼠視為模型誘導(dǎo)成功。10只C57BL/6J小鼠作為正常對照組。按照空腹血糖值將50只成模的KK-Ay小鼠隨機分為模型對照組、陽性對照組(羅格列酮片2.67 mg·kg-1)和俄色提取物組(0.75、1.50、3.00 g生藥·kg-1)，共5組，每組10只。各組分別灌胃給予相應(yīng)藥物(正常對照組和模型對照組給予)，給藥體積為10 mL·kg-1，每日定時給藥1次，連續(xù)給藥35 d。

1.5.2觀察指標(biāo)

1.5.2.1 體質(zhì)量 于實驗期間每周固定時間測定1次。

1.5.2.2 血糖 于實驗期間每周測定小鼠空腹血糖值1次。所有小鼠自由飲水，禁食4 h后剪去尾端取血，用血糖儀及試紙測定各組小鼠空腹血糖值。

1.5.2.3 胰島素耐量水平測定 于給藥d 32測定小鼠胰島素耐量水平。所有小鼠禁食不禁水4 h后剪尾取血測定空腹血糖值(0 min)，測定后腹腔注射胰島素，濃度為0.5 U·kg-1，測量第15、30、60和120 min血糖水平。

1.5.2.4 血清胰島素測定 末次給藥后，所有小鼠禁食不禁水4 h，摘眼球取血，4 000 r·min-1離心10 min，收集血清，測定血清胰島素水平。

1.5.2.5 胰腺組織病理學(xué)觀察 試驗結(jié)束時，取胰腺組織固定，脫水包埋，再脫水后，用蘇木精進行染色，返藍后再用伊紅染色，接著進行梯度酒精脫水和二甲苯透明，最后用中性樹膠封固和完成切片的圖像采集，按下表分級評分標(biāo)準(zhǔn)進行胰腺組織病理評分。

1.5.2.6 胰島細胞凋亡檢測 10%的中性甲醛固定的小鼠胰腺組織，切片，脫蠟，修復(fù)，熒光TUNEL孵育液孵育，PBS沖洗，加DAPI染核15 min，PBS沖洗，甘油明膠封片，熒光顯微鏡下鏡檢。Pannoramic 250全景數(shù)字幻燈片掃描儀掃描，采集400倍圖像3張，讀片，鏡下統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算凋亡率，進行凋亡細胞分析。

1.5.2.7 胰腺組織GLP-1蛋白含量 將固定于4%多聚甲醛溶液中的胰腺組織取出進行石蠟包埋，切片，脫蠟，用檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復(fù)，用山羊血清封閉，加入一抗(GLP-1)4 ℃過夜，再加入生物素化二抗，在37 ℃溫度下孵育30 min，之后用PBS進行水洗和DAB顯色，顯色后再用蘇木精輕度復(fù)染，最后脫水并用中性樹膠封片。BA200Digital數(shù)碼三目顯微攝像系統(tǒng)進行圖像采集。

2 結(jié)果

2.1 俄色提取物對KK-Ay小鼠體質(zhì)量的影響如Tab 2、Fig 1所示，模型對照組體質(zhì)量均明顯升高，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；俄色3.00、1.50 g生藥·kg-1劑量組體質(zhì)量均明顯減輕，俄色0.75 g生藥·kg-1劑量組在給藥第2、3、4、5周體質(zhì)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。

Tab 1 Grading and scoring criteria of pancreatic tissue lesions

Tab 2 Effect of E-se on body weight of KK-Ay

Tab 3 Effect of E-se on fasting blood glucose in KK-Ay

Fig 1 Effect of E-se on body weight of KK-Ay mice

2.2 俄色提取物對KK-Ay小鼠空腹血糖的影響如Tab 3、Fig 2所示，模型對照組空腹血糖均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；俄色3.00 g生藥·kg-1g劑量組空腹血糖值均降低，1.50、0.75g生藥·kg-1劑量組在給藥第2、3、4、5周空腹血糖值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。

2.3 俄色提取物對KK-Ay小鼠胰島素耐量的影響如Tab 4、Fig 3所示，模型對照組在實驗期間的空腹血糖值均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；俄色3.00 g、0.75 g生藥·kg-1劑量組在實驗期間血糖值均降低，1.50 g生藥·kg-1組在第0、15 min血糖值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。

Fig 2 Effect of E-se on fasting blood glucose in KK-Ay mice

2.4 俄色提取物對KK-Ay小鼠血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、胰島素敏感指數(shù)的影響如Tab 5、Fig 4-6所示，模型對照組小鼠血清中胰島素濃度高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；俄色3.00 g生藥·kg-1劑量組小鼠血清胰島素濃度降低(P<0.01)。模型對照組小鼠胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment for insulin resistance index, HOMA-IR)高于正常對照組(P<0.01)；俄色3.00 g、1.50 g生藥·kg-1劑量組小鼠HOMA-IR降低(P<0.01)。模型對照組小鼠胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index, ISI)低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；俄色各劑量組小鼠ISI升高(P<0.01或P<0.05)。

Tab 4 Effect of E-se on insulin tolerance in KK-Ay

Tab 5 Effects of E-se on insulin (INS) concentrationin serum andinsulin resistance index (HOMA-IR) and insulin sensitivity index (ISI) of KK-Ay

Fig 3 Effect of E-se on insulin tolerance in KK-Ay mice

Fig 4 Effects of E-se on insulin (INS) concentration in serum of KK-Ay mice

Fig 5 Effects of E-se on insulin resistance index

Fig 6 Effects of E-se on insulin sensitivity index

2.5 俄色提取物對KK-Ay小鼠胰腺組織病理變化的影響由Tab 6、Fig 7-8可見，模型對照組小鼠胰腺組織病變分級評分高于正常對照組，差異有統(tǒng)計意義(P<0.01)；俄色3.00 g生藥·kg-1劑量組小鼠胰腺組織病變分級評分降低，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Tab 6 Effects ofE-se extract on pathological changes of pancreatic tissues in KK-Ay

Fig 7 Effects of E-se extract on pathological changes of pancreatic tissues in KK-Ay mice

2.6 俄色提取物對KK-Ay小鼠胰島細胞凋亡的影響由Tab 7、Fig 9-10可見，模型對照組胰腺組織中胰島細胞凋亡百分比高于正常對照組(P<0.01)；俄色3.00 g 、1.50 g生藥·kg-1劑量組胰島細胞凋亡百分比降低，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

Tab 7 Effect of E-se extract on islet cell apoptosis

2.7 俄色提取物對KK-Ay小鼠胰腺組織中胰高血糖素樣肽-1濃度的影響由Tab 8、Fig 11-12可見，模型對照組小鼠胰腺組織GLP-1蛋白含量低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；俄色0.75 g生藥·kg-1劑量組小鼠胰腺組織GLP-1蛋白含量升高，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；俄色3.00 g、1.50 g生藥·kg-1劑量組小鼠胰腺組織GLP-1蛋白含量升高，與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Fig 10 Effect of E-se extract on islet cell apoptosis in KK-Ay mice(HE，×400)

Fig 12 Effect of E-se extract on glucagon-like peptide-1 (GLP-1) concentration in pancreatic tissues of KK-Ay mice(immunohistochemistry，×400)

Tab 8 Effect of E-se extract on glucagon-like peptide-1 (GLP-1) concentration in pancreatic tissues of KK-Ay

Fig 8 Effects of E-se extract on pathological changes of pancreatic tissues in KK-Ay mice(HE×400)

Fig 9 Effect of E-se extract on islet cell apoptosis in KK-Ay mice

3 討論

京尼薩庫病為藏醫(yī)很早就認識的一種因飲食起居不當(dāng)，使“培根”和過盛的脂肪不能轉(zhuǎn)化成人體需要的精華，混入尿液并隨著尿液排出體外所造成的全身性疾病。藏醫(yī)認為，“京尼薩庫”病與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的由糖脂代謝紊亂引起的疾病有相同的臨床特點。胰島素調(diào)控血糖代謝功能的受損，導(dǎo)致了代償性胰島素分泌的增多，故常伴有高胰島素血癥。胰島素抵抗不僅是糖尿病的核心發(fā)病機制，也是貫穿代謝綜合征、高血脂、肥胖、動脈粥樣硬化、冠心病等多種代謝相關(guān)疾病的主線；既是連接它們的紐帶，也是它們共同的病理基礎(chǔ)。

課題組前期研究表明，俄色水提物可降低鏈脲佐菌素所致糖尿病小鼠的空腹血糖和血清胰島素水平[9-10]。KK/upj-Ay小鼠是KK自發(fā)糖尿病小鼠的同源突變近交系，具有過量飲食、中度肥胖、高血糖、胰島素抵抗等代謝異常綜合征等生理特點，常用于研究非胰島素依賴型糖尿病的模型動物[11-12]。

本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，以俄色為研究對象，采用自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠模型，觀察俄色對2型糖尿病模型KK-Ay小鼠胰島素抵抗的改善作用。結(jié)果顯示，俄色各劑量組均能降低小鼠空腹血糖；胰島素耐量試驗研究中，俄色3.00 g、0.75 g生藥·kg-1劑量組各時間點血糖值均降低；此外，俄色3.00 g生藥·kg-1劑量組可降低小鼠血清胰島素水平，提示其在一定程度上可改善KK-Ay小鼠胰島素抵抗，增加機體對胰島素的敏感性。研究表明，高血糖和高胰島素血癥的長期存在會加重靶組織的損傷，促進胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展[13]。本研究觀察俄色對胰腺組織病理和胰島細胞凋亡的影響，模型對照組小鼠胰腺組織病變分級評分顯著升高，可見胰島細胞增多、胰島細胞空泡變性、胰島細胞壞死和胰島細胞凋亡百分比增高，俄色可降低胰腺組織病變分級評分和胰島細胞凋亡百分比，提示俄色對胰腺組織和胰島細胞具有一定的保護作用。胰高血糖素樣肽是一種由腸道L細胞分泌的腸促胰島素激素，可參與糖代謝調(diào)節(jié)[14]，為進一步證實俄色對胰島素分泌的作用，結(jié)果提示俄色可增加胰腺組織中胰高血糖素樣肽水平。綜上，俄色提取物可通過降低2型糖尿病KK-Ay小鼠血糖值、降低血清胰島素水平、減少胰島細胞凋亡和增加機體對胰島素的敏感性，從而改善胰島素抵抗。