喻 斌，阮 鳴,2，許 立，李宏軼

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2. 南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211117；3. 江蘇南星藥業(yè)有限責(zé)任公司，江蘇 南京 210046)

腦卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是腦卒中后常見的心理障礙，也是導(dǎo)致腦卒中患者長期致殘的主要因素之一，影響27.5%～56%的腦卒中存活者[1-2]。PSD的發(fā)生可對(duì)腦梗死患者的康復(fù)產(chǎn)生不利影響，包括延緩運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，加重認(rèn)知功能障礙，甚至增加自殺的風(fēng)險(xiǎn)[2]。目前，藥物治療仍然是緩解PSD的首選。選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(如氟西汀)、5-羥色胺及去甲腎上腺素再攝取抑制劑是廣泛應(yīng)用的抗抑郁藥，但由于療效不穩(wěn)定，甚至伴有輕重不等的不良反應(yīng)，包括視力模糊、尿潴留、性功能障礙、震顫、低血壓和嚴(yán)重失眠等而限制了它們的應(yīng)用[2-3]。而傳統(tǒng)中藥在PSD的治療則越來越受到關(guān)注[4]。

川芎始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為傘形科多年生草本植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，其性溫味辛，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛之效，主要成分包括生物堿、揮發(fā)油和有機(jī)酸等，臨床廣泛應(yīng)用于心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的治療[5]。臨床研究報(bào)道，川芎能明顯改善PSD患者的抑郁、焦慮心理[6]。實(shí)驗(yàn)研究也進(jìn)一步證實(shí)了該藥，尤其是揮發(fā)油類成分在PSD治療中的積極作用[7-8]，但對(duì)于其相關(guān)治療機(jī)制卻仍不清楚。

cAMP 應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的重要細(xì)胞因子，可通過促進(jìn)下游腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的分泌，發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)及保護(hù)效應(yīng)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，cAMP-CREB-BDNF通路的下調(diào)可能和抑郁、缺血性腦卒中、亨廷頓病，大腦炎性損傷密切相關(guān)，尤其是缺血性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展。因此，結(jié)合已有研究成果，本課題組提出川芎注射液臨床改善PSD患者的認(rèn)知能力的潛在機(jī)制可能和調(diào)節(jié)cAMP-CREB-BDNF通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬利用中動(dòng)脈阻斷(middle cerebral artery occlusion，MCAO)復(fù)合慢性應(yīng)激刺激構(gòu)建大鼠PSD模型，并通過行為學(xué)、尼氏評(píng)分、neuronal nuclei(Neun)表達(dá)和cAMP-CREB-BDNF通路檢測，對(duì)川芎注射液緩解PSD的作用機(jī)制進(jìn)行深入探討。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，♂，體質(zhì)量(300～350)g，購于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2018-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)SYXK(蘇) 2018-0049。

1.2 試劑10%川芎注射液，上海長海醫(yī)院，批號(hào)：170704；兔抗鼠Neun抗體(ab177487，Abcam)；兔抗鼠cAMP抗體(ab76238，Abcam)；兔抗鼠p-CREB抗體(ab32096，Abcam)；兔抗鼠BDNF抗體(ab108319，Abcam)；兔抗鼠GAPDH抗體(10494-1-AP，武漢三鷹)；羊抗兔Alexa Fluor 488二抗(ab150077，Abcam)；羊抗兔IgG二抗(BA1056，武漢博士德)；DAPI染色試劑盒(KGA215，南京凱基)。

1.3 儀器Morris水迷宮行為學(xué)系統(tǒng)(淮北正華有限公司)，配合Any-maze 行為學(xué)分析軟件(美國Stoeling公司)；R540IP型小動(dòng)物麻醉系統(tǒng)(北京瑞沃德公司)；IX71型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；ImageQuant LAS4000 mini成像系統(tǒng)(美國GE公司)。

2 方法

2.1 分組、造模和給藥方法大鼠分為5組，即假手術(shù)組、模型組、川芎注射液低劑量組(0.1 g·kg-1)、高劑量組(0.2 g·kg-1)，每組8只。按照前述方法略加改良進(jìn)行PSD造模[9]。3%異氟烷誘導(dǎo)麻醉后再用1.5%異氟烷維持麻醉。分離頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端、頸總動(dòng)脈近心端和翼腭動(dòng)脈。距頸總動(dòng)脈分叉處插入尼龍線并向前推至18±0.5 cm，多余的線栓縫合固定于皮膚。假手術(shù)組大鼠手術(shù)過程相同，但不插入尼龍線。每日給予青霉素(ip，10萬U/只)，連續(xù)3 d。隨后每只用大鼠籠單獨(dú)飼養(yǎng)并接受28 d的慢性應(yīng)激刺激，具體包括晝夜顛倒、夾尾3 min、4 ℃水游泳5 min、160 Hz水平振蕩5 min、禁食1 d、禁水1 d、電擊2 min(30 V，電擊5 s，間隔5 s)。以上刺激重復(fù)4次以組成28次隨機(jī)刺激，1次·d-1。假手術(shù)組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。動(dòng)物在接受刺激的最后5 d同時(shí)腹腔注射給藥，1次·d-1。正常組和模型組給予等體積NS。

2.2 行為學(xué)檢測

2.2.1糖水消耗實(shí)驗(yàn)[10]實(shí)驗(yàn)前訓(xùn)練動(dòng)物飲用糖水。禁水24 h后每只大鼠給予20 mL的1%蔗糖水，1 h后取走水瓶并量取剩余體積，獲取糖水消耗體積(mL)。

2.2.2Open-field test(OFT)開場實(shí)驗(yàn)[10]自制無蓋敞箱，底面為黑白相間的64個(gè)等格(10 cm×10 cm)。將大鼠放入中心方格，計(jì)時(shí)3 min，以大鼠爬過時(shí)四肢均進(jìn)入的格子數(shù)作為水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)，以大鼠前肢離地騰空或攀附箱壁、后肢直立次數(shù)為垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)。

2.2.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 按照前期研究方法進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[10]。該實(shí)驗(yàn)由一不銹鋼圓形水池和一平臺(tái)組成，水池直徑為100 cm，水深50 cm。先在水池內(nèi)注入清水，然后加入少許墨汁使水變黑，水溫控制在(22±2) ℃。水池被分為2個(gè)區(qū)域。與站臺(tái)距離小于50 cm為近站臺(tái)區(qū)，與站臺(tái)距離大于50 cm為遠(yuǎn)站臺(tái)區(qū)。平時(shí)訓(xùn)練時(shí)間設(shè)定70 s作為逃避到平臺(tái)上的最大潛伏期，超過70 s則直接將大鼠牽引至平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠隨機(jī)放入任一象限，以尋找平臺(tái)的時(shí)間作為潛伏期，以尋找平臺(tái)游過的軌跡作為總路程，記錄大鼠總路程、潛伏期、近站臺(tái)區(qū)軌跡路程、遠(yuǎn)站臺(tái)區(qū)軌跡路程、近/遠(yuǎn)站臺(tái)區(qū)路程比。

2.3尼氏染色和Neun免疫熒光檢測 取材前12 h 禁食不禁水，3%異氟烷麻醉后脫頸椎處死大鼠，迅速以4%多聚甲醛心臟灌注固定，取左側(cè)大腦半球，經(jīng)脫水、透明、浸蠟與包埋，將蠟塊常規(guī)切片。一部分進(jìn)行尼氏染色后，對(duì)海馬CA1區(qū)尼氏體進(jìn)行計(jì)數(shù)和評(píng)分。另一部分滴加兔抗鼠Neun一抗(1 ∶400)，37 ℃孵育2 h，漂洗后加入羊抗兔二抗(Alexa Fluor 488，1 ∶200)孵育1 h，漂洗后每張片子滴加DAPI染液50～100 μL，復(fù)染后封片觀察CA1區(qū)Neun+細(xì)胞，并利用ImageJ軟件進(jìn)行熒光積分定量。

2.4 Western blot檢測cAMP, p-CREB和BDNF蛋白的表達(dá)取腦組織，分離出左側(cè)海馬組織。提取總蛋白后利用BCA法定量。以每孔20 μg上樣，并分別進(jìn)行 SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，4 ℃孵育下列一抗過夜：cAMP(1 ∶5 000)、p-CREB(1 ∶500)、BDNF(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶10 000)。TBST洗膜3次后室溫孵育二抗，再次洗膜3次，顯色成像，利用ImageJ進(jìn)行灰度和面積計(jì)算。cAMP、p-CREB和BDNF的表達(dá)分別和GAPDH進(jìn)行比值，獲取各自的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 糖水消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠糖水消耗量明顯減少(P<0.01)。與模型組相比，川芎注射液低、高劑量組均明顯升高PSD大鼠糖水飲用量(P<0.05)，見Fig 1A。

3.2 OFT實(shí)驗(yàn)結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)計(jì)數(shù)均明顯減少(P<0.01)。與模型組比較，川芎注射液低、高劑量組均明顯增加PSD大鼠以上兩種運(yùn)動(dòng)的計(jì)數(shù)(P<0.05)，見Fig 1B、C。

3.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠可見總路程、潛伏期、近站臺(tái)區(qū)軌跡路程、遠(yuǎn)站臺(tái)區(qū)軌跡路程、近/遠(yuǎn)站臺(tái)區(qū)路程比均明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，川芎注射液低、高劑量組可明顯減少游泳總路程和近站臺(tái)區(qū)軌跡路程(P<0.05，0.01)。此外，高劑量組還可進(jìn)一步減少登臺(tái)潛伏期和近/遠(yuǎn)站臺(tái)區(qū)路程比(P<0.05)，見Fig 2A、2B。

3.4 尼氏染色檢測結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠不僅可見海馬CA1區(qū)尼氏體數(shù)量的明顯減少(P<0.01)，還導(dǎo)致尼氏體形態(tài)的固縮。與模型組比較，川芎注射液低、高劑量組在明顯增加尼氏體數(shù)量(P<0.05，0.01)的同時(shí)，還可恢復(fù)尼氏體形態(tài)，提示藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞功能的保護(hù)作用，見Fig 3A、B。

Fig 1 Results of sugar consumption test and

Fig 2 Results of Morris water maze

Fig 3 Results of Nissl n=4)

Fig 4 Results of Neun immunofluorescence n=4)

Fig 5 Expressions of cAMP-p-CREB-BDNF n=4)

3.5 Neun免疫熒光檢測結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠不僅可見海馬CA1區(qū)Neun熒光積分的明顯減少(P<0.01)，DAPI染色還可見核的固縮。與模型組比較，川芎注射液低、高劑量組可明顯減少細(xì)胞核的固縮。此外高劑量組還增加Neun熒光積分(P<0.05)，顯示了藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，見Fig 4A、4B。

3.6 cAMP、p-CREB和BDNF蛋白表達(dá)結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠可見海馬組織cAMP、p-CREB和BDNF表達(dá)的明顯減少(P<0.01)。與模型組比較，川芎注射液低、高劑量組可明顯增加cAMP和p-CREB的表達(dá)(P<0.05，0.01)，高劑量組還可見BDNF表達(dá)的明顯增加(P<0.01)，提示藥物對(duì)cAMP-p-CREB-BDNF通路的上調(diào)作用，見Fig 5。

4 討論

證據(jù)表明，川芎改善PSD的機(jī)制和改善腦血流、調(diào)控凋亡基因的表達(dá)、抗自由基損傷、降低免疫炎癥反應(yīng)、降低興奮性氨基酸毒、調(diào)控核錄因子кB表達(dá)，以及促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)有關(guān)[6]。

目前，研究認(rèn)為抑郁的發(fā)病機(jī)制與海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的萎縮和壞死密切相關(guān)。長期應(yīng)激刺激可使該區(qū)域神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能和結(jié)構(gòu)缺陷，突觸傳遞障礙，從而導(dǎo)致抑郁癥時(shí)情緒和認(rèn)知異常的發(fā)生。越來越多的研究證實(shí)海馬CA1區(qū)與應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，被認(rèn)為是抑郁癥防治的重要腦區(qū)[11]。慢性應(yīng)激刺激是將動(dòng)物暴露于輕度而不可預(yù)知的外界刺激中，使其誘發(fā)類似于臨床抑郁癥的行為改變，如運(yùn)動(dòng)能力下降、蔗糖攝入減少、學(xué)習(xí)記憶能力降低以及對(duì)刺激的反應(yīng)性遲緩，故被廣泛用于動(dòng)物抑郁癥模型的建立[10]。

PSD往往伴隨著機(jī)體大腦神經(jīng)元受損，導(dǎo)致快樂體驗(yàn)?zāi)芰Φ慕档蜕踔羻适?。而大鼠模型則可見其嗜甜本性的抑制，故糖水消耗量常常用作衡量快感缺失程度的重要指標(biāo)[12]。開場實(shí)驗(yàn)則能反映動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的探索及情緒改變，其水平活動(dòng)主要體現(xiàn)情緒變化，而垂直活動(dòng)則反應(yīng)其探索欲[12]。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)作為經(jīng)典的行為學(xué)評(píng)價(jià)手段，能較為全面的評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶和觀察能力，故被廣泛用于各類神經(jīng)系統(tǒng)疾病中神經(jīng)功能的評(píng)估。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)川芎注射液低、高劑量組均明顯升高PSD大鼠糖水飲用量，增加大鼠水平和垂直運(yùn)動(dòng)計(jì)數(shù)，減少游泳總路程和近站臺(tái)區(qū)軌跡路程。高劑量組還縮短了登臺(tái)潛伏期，降低近/遠(yuǎn)站臺(tái)區(qū)路程比。以上結(jié)果提示川芎注射液不僅能改善PSD大鼠對(duì)外界環(huán)境刺激的情緒反饋，提升動(dòng)物的空間探索興趣，還能增加抑郁大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。而在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中對(duì)遠(yuǎn)臺(tái)區(qū)軌跡路程并沒有縮短，只縮短近臺(tái)區(qū)路程，提示藥物在恢復(fù)記憶能力方面更加突出。

尼氏體是神經(jīng)細(xì)胞胞體內(nèi)的嗜堿性顆粒，其在代謝功能旺盛的神經(jīng)細(xì)胞中含量豐富。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，尼氏體可減少、解體甚至消失。而在損傷恢復(fù)過程中，又重新出現(xiàn)、增多，甚至恢復(fù)至正常水平，故尼氏體形態(tài)和數(shù)量可作為神經(jīng)細(xì)胞功能狀態(tài)的標(biāo)志[13]。Neun由Mullen等于1992在小鼠腦細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)，并廣泛用作脊椎動(dòng)物成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，川芎注射液可明顯增加PSD大鼠尼氏體數(shù)量，恢復(fù)尼氏體形態(tài)，提示藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞功能的保護(hù)。

cAMP-CREB-BDNF通路在神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)和神經(jīng)功能的恢復(fù)中具有重要作用。在正常生理?xiàng)l件下，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(如5-HT、DA、NE)與細(xì)胞膜上的特定G蛋白偶聯(lián)受體相互作用，激活G蛋白。后者與GTP結(jié)合后通過C2結(jié)構(gòu)域激活腺苷酸環(huán)化酶，并促進(jìn)cAMP的合成。cAMP與PKA的調(diào)節(jié)亞單位結(jié)合，導(dǎo)致PKA的催化亞單位解離并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，PKA的催化亞單位與CREB的Ser-133位點(diǎn)結(jié)合并磷酸化CREB。隨后p-CREB與BDNF啟動(dòng)子區(qū)域的cAMP反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)BDNF的轉(zhuǎn)錄[15]。但在病理狀態(tài)下，持續(xù)的精神應(yīng)激和刺激會(huì)導(dǎo)致患者體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量降低，cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減弱，從而導(dǎo)致其下游信號(hào)分子p-CREB和BDNF表達(dá)降低。BDNF的低表達(dá)難以抵抗應(yīng)激下神經(jīng)元的損傷，這可導(dǎo)致記憶功能的缺陷、抑郁，甚至海馬體積的縮小[16-18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，川芎注射液可明顯增加cAMP、p-CREB和BDNF的表達(dá)，提示藥物對(duì)cAMP-p-CREB-BDNF通路具有上調(diào)作用，而這可能是抗PSD作用的潛在機(jī)制。

綜上所述，川芎注射液可通過上調(diào)cAMP-CREB-BDNF通路，增加BDNF的表達(dá)，進(jìn)而改善PSD大鼠行為學(xué)和神經(jīng)功能，保護(hù)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，最終改善PSD大鼠認(rèn)知功能。