陳小霞，謝彩杏，，梁毅鋒，，秦百君，楊 昕，鄭日輝，陳國忠

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530001)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是由多種病因引起胰酶激活，繼以胰腺局部炎性反應(yīng)為主要特征，伴或不伴其他器官功能改變的常見消化系統(tǒng)危重病。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的豐富，我國AP的發(fā)病率不斷增加，總體病死率達(dá)5%～10%，具有發(fā)病急、病情重和并發(fā)癥多等特點(diǎn)[1]。在AP急性期，機(jī)體腸道功能紊亂常引起腸粘膜屏障功能障礙，使患者出現(xiàn)腸麻痹、腸梗阻、全身炎癥反應(yīng)綜合癥，甚至是多器官功能障礙綜合征。因此，及時(shí)進(jìn)行早期干預(yù)是防止AP發(fā)生轉(zhuǎn)變、惡化的首要任務(wù)。但是，目前在AP早期，西醫(yī)以非手術(shù)的對癥治療為主，預(yù)后較差，常因治療不徹底導(dǎo)致復(fù)發(fā)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AP病理性質(zhì)以里、實(shí)、熱證為主?；静C(jī)是“腑氣不通”，各種致病因素引起氣機(jī)不暢，痰濕內(nèi)蘊(yùn)，郁久化熱，久則血瘀、濁毒漸生，有形邪實(shí)阻滯中焦，從而導(dǎo)致“腑氣不通，不通則痛”[2]。大黃具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒等功效，正契合AP的病理特點(diǎn)。如《神農(nóng)本草經(jīng)》所言：“大黃，主下瘀血，血閉寒熱，破癥，積聚，留飲宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷”。并且課題組在中醫(yī)復(fù)方治療AP的520篇文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，以大黃為君結(jié)合病理因素進(jìn)行配伍和組方的較多，根據(jù)“急則治標(biāo)”的原則，將大黃貫穿于AP治療的始終，可極大程度地降低患者手術(shù)率、病死率及復(fù)發(fā)率[3]。而且現(xiàn)代藥理研究也提示，以單味中藥，如生大黃內(nèi)服或灌腸可以明顯調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群，抑制腸道炎癥反應(yīng)[4]；加入大黃的復(fù)方制劑，如清胰湯、大承氣湯等類方均有緩解腸麻痹等作用。但是，大黃成分多、傳統(tǒng)功效和現(xiàn)代藥理機(jī)制復(fù)雜，當(dāng)前研究局限于單一方向，在AP中的作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)分析的新方法，能從分子水平觀察藥物活性成分、蛋白質(zhì)、基因和疾病之間的相互關(guān)系，有利于系統(tǒng)性闡明大黃的藥物療效和治療AP的規(guī)律，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供研究基礎(chǔ)，為藥物的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1本文所使用的工具如下 (1)數(shù)據(jù)庫：TCMSP v2.3、TCMID、Swiss Target Prediction、Uniprot Updated to 2020、Gene Cards v1.5、OMIM Updated to 2020、STRING v11.0、Metascape Update to 2020-09-16、PubChem、PDB；(2)軟件：UltraEdit v22.20.0.43、Perl語言v5.26、R語言v4.0.3、Cytoscape v3.6.0、Chem 3D v14.0、AutoDock Vina v1.1.2、Autodock Tools v1.5.6、Pymol v1.7。

1.2 提取大黃活性成分和靶點(diǎn)(1)在TCMSP和TCMID數(shù)據(jù)庫中檢索大黃的活性成分，并將前者的中藥成分按關(guān)鍵ADME屬性值：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18篩選，綜合考慮藥理活性和機(jī)體利用度[5]；(2)在TCMSP和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中查詢大黃的靶點(diǎn)；(3)通過查詢中國知網(wǎng)、PubMed數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充大黃最新的活性成分和靶點(diǎn)；(4)匯總上述大黃活性成分和靶點(diǎn)，去除重復(fù)值；(5)運(yùn)用Perl語言在Uniprot數(shù)據(jù)庫中將靶點(diǎn)名稱進(jìn)行基因名稱轉(zhuǎn)換，靶點(diǎn)為其他物種基因或無對應(yīng)關(guān)系則刪除；(6)用Cytoscape軟件構(gòu)建大黃“活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，用network analyzer插件進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.3 提取AP的靶點(diǎn)、大黃與AP的共同靶點(diǎn)以“Acute pancreatitis”為關(guān)鍵詞，在常用疾病數(shù)據(jù)庫GeneCards、OMIM中檢索AP的靶點(diǎn)，去除重復(fù)值，并與1.2所得大黃的靶點(diǎn)取交集。

1.4 構(gòu)建大黃治療AP的“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)在Cytoscape軟件中用文本文檔和Excel文件構(gòu)建大黃與AP的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并進(jìn)行拓?fù)浞治?，突出大黃治療AP關(guān)鍵的活性成分和靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)STRING是根據(jù)已知蛋白相互作用進(jìn)行預(yù)測的數(shù)據(jù)庫。將1.3所得的大黃與AP的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入，物種限制為人類，隱藏游離點(diǎn)，設(shè)定置信度>0.4，其他保持默認(rèn)設(shè)置，導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.6 基因本體(gene ontology，GO)生物過程富集分析Metascape數(shù)據(jù)庫是一個(gè)功能強(qiáng)大、更新快、覆蓋廣的基因功能注釋分析工具，能分析大批量的基因或蛋白功能。將1.3所得的大黃與AP共同靶點(diǎn)導(dǎo)入，限定物種為人類，P≤0.01。

1.7 京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析將1.3所得的大黃與AP共同靶點(diǎn)導(dǎo)入R語言，獲得KEGG通路富集結(jié)果，并借助R語言對關(guān)鍵靶點(diǎn)和關(guān)鍵通路進(jìn)行分析。

1.8 分子對接驗(yàn)證(1)小分子化合物處理：將1.2和1.4中得到的大黃關(guān)鍵活性成分取交集，選取排名前三的，和目前治療AP的主要西藥：奧曲肽、加貝酯，在PubChem中分別下載sdf格式，導(dǎo)入Autodock Tools轉(zhuǎn)存為pdbqt格式。(2)大分子蛋白處理：將1.4和1.5中大黃的關(guān)鍵靶點(diǎn)取交集，選取排名第一的在PDB數(shù)據(jù)庫下載其pdb格式：人源蛋白優(yōu)先；有蛋白與配體的復(fù)合物；最好蛋白的配體與AMD的結(jié)構(gòu)類似。再導(dǎo)入Pymol中去除水分子、分離配體，在Autodock Tools中加氫、加電荷，轉(zhuǎn)存為pdbqt格式。(3)設(shè)置活性口袋，利用Autodock Vina進(jìn)行分子對接，計(jì)算結(jié)合能。

2 結(jié)果

2.1 研究步驟在TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中分別檢索大黃的活性成分及靶點(diǎn)，在Gene Cards、OMIM數(shù)據(jù)庫篩選AP靶點(diǎn)，并獲得大黃與AP共同靶點(diǎn)。然后分別將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析、R語言進(jìn)行KEGG富集分析、STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。另外，通過Cytoscape軟件分別構(gòu)建大黃“活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、大黃治療AP的“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，篩選出大黃治療AP的核心活性成分及靶點(diǎn)。最后通過分子對接初步驗(yàn)證其結(jié)合能力。

2.2 大黃的活性成分和靶點(diǎn)在TCMSP和TCMID數(shù)據(jù)庫中共得到192個(gè)大黃活性成分，查閱文獻(xiàn)補(bǔ)充后去除重復(fù)值，最終得到16個(gè)，詳見Tab 1。在TCMSP和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中得到大黃的靶點(diǎn)去重后剩645個(gè)。然后運(yùn)用Perl語言在Uniprot數(shù)據(jù)庫中將靶點(diǎn)名稱進(jìn)行基因名稱轉(zhuǎn)換，將所得的大黃活性成分和轉(zhuǎn)換后的靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，導(dǎo)入Cytoscape軟件，形成由62個(gè)節(jié)點(diǎn)(表示大黃的活性成分和靶點(diǎn))，81條邊(表示成分與靶點(diǎn)之間的相互作用)構(gòu)建的大黃“活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，平均節(jié)點(diǎn)值為1.3。并進(jìn)行拓?fù)浞治?，設(shè)置Degree≥平均節(jié)點(diǎn)值(即≥2)，突出大黃自身關(guān)鍵的活性成分和靶點(diǎn)。

Tab 1 Rhubarb active ingredient list

2.3 AP的靶點(diǎn)、大黃與AP共同靶點(diǎn)在GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到AP靶點(diǎn)1 700個(gè)，將靶點(diǎn)相關(guān)性評分設(shè)定為≥中位數(shù)值(即≥5.12)，保留相關(guān)性較大的靶點(diǎn)[6]。同時(shí)，在OMIM數(shù)據(jù)庫得到182個(gè)，與2.2所得大黃的靶點(diǎn)取交集，在微生信平臺(tái)構(gòu)圖，得到31個(gè)大黃與AP共同靶點(diǎn)。

2.4 大黃治療AP的“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)將2.2所得的31個(gè)共同靶點(diǎn)運(yùn)用Perl語言映射出對應(yīng)的大黃活性成分，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)和屬性文件導(dǎo)入Cytoscape軟件，得到由38個(gè)節(jié)點(diǎn)和54條邊構(gòu)建成的網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jié)點(diǎn)按Degree值進(jìn)行排序。然后計(jì)算所有節(jié)點(diǎn)的Degree值、中心度值(Betweenness centrality，BC)、緊密中心度(Closeness centrality，CC)的平均節(jié)點(diǎn)值進(jìn)一步篩選，當(dāng)設(shè)置Degree≥2，BC≥0.12，CC≥0.40時(shí)，選出綜合條件最高的前三個(gè)。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)在STRING數(shù)據(jù)庫得到由27個(gè)節(jié)點(diǎn)，135條邊構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)浞治?，設(shè)置Degree≥5(平均節(jié)點(diǎn)值為5)，突出相互作用密切的靶點(diǎn)。由Fig 5可見，CASP3、JUN、HSP90AA1等為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

Fig 1 Rhubarb “active ingredient-drug target” network

Fig 2 Common target of rhubarb and AP

Fig 3 The “active ingredient-disease target” network of rhubarb in treatment of AP

Fig 4 PPI network

Fig 5 GO enrichment analysis

Fig 6 KEGG enrichment analysis

Fig 7 p53 signaling pathway

Fig 8 Molecular docking binding energy

Fig 9 A detailed simulation diagram of molecular docking

2.6 GO富集分析在Metascape數(shù)據(jù)庫中得到137個(gè)細(xì)胞生物過程，根據(jù)Count值將前20個(gè)導(dǎo)出，其中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)富集的術(shù)語(term)，相似度>0.3的term通過邊連接，匯聚成功能團(tuán)，根據(jù)功能團(tuán)的score設(shè)置邊的透明度，突出重要性。其中主要包括對有毒物質(zhì)的反應(yīng)(response to toxic substance)、節(jié)律過程(rhythmic process)、對非生物刺激的反應(yīng)(cellular response to abiotic stimulus)、對氧氣水平的反應(yīng)(response to oxygen levels)、活性氧代謝(reactive oxygen species metabolic process)、DNA損傷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction in response to DNA damage)、凋亡信號(hào)通路(apoptotic signaling pathway)等。

2.7 KEGG富集分析在R語言運(yùn)行數(shù)據(jù)后得到87條信號(hào)通路，根據(jù)Count值展示前20條陽性率較高的通路，縱坐標(biāo)表示信號(hào)通路，橫坐標(biāo)表示富集倍數(shù)，氣泡大小表示富集基因的數(shù)量，不同顏色表示P值大小。在國內(nèi)外文獻(xiàn)，如中國知網(wǎng)、PubMed等查閱與AP相關(guān)且顯著富集的通路，可知所得的乙型肝炎(Hepatitis B)、p53信號(hào)通路(p53 signaling pathway)、IL-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、細(xì)胞周期(cell cycle)、凋亡(apoptosis)等與AP相關(guān)。其中，結(jié)合文章所得關(guān)鍵靶點(diǎn)對排名靠前且與AP有密切聯(lián)系的p53信號(hào)通路進(jìn)一步構(gòu)圖分析。

2.8 分子對接模型課題組綜合考慮藥物本身作用及藥物治療疾病作用兩方面，取2.2大黃“活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)和2.4大黃治療AP的“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)排名前三的大黃活性成分、2.4大黃治療AP的“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)和2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)排名前五的交集靶點(diǎn)作為大黃治療AP的核心活性成分及靶點(diǎn)。將2.2和2.4的大黃活性成分取交集可知，大黃治療AP主要且核心的前3個(gè)活性成分為beta-sitosterol、aloe-emodin、EUPATIN。將2.4和2.5的靶點(diǎn)取交集可知，大黃治療AP核心的靶點(diǎn)蛋白為HSP90AA1?；诖耍n題組認(rèn)為beta-sitosterol(PubChem CID：222284)、aloe-emodin(PubChem CID：10207)、EUPATIN(PubChem CID：5317287)作用于HSP90AA1(PDB ID:3q6n)是大黃治療AP的關(guān)鍵，并通過分子對接進(jìn)行初步驗(yàn)證。而目前治療AP的奧曲肽(Octreotide)(PubChem CID：448601)、加貝酯(Gabexate)(PubChem CID：3447)作為分子對接的陽性對照，同樣進(jìn)行相同操作。Autodock Vina軟件中結(jié)合能<-5 kcal·mol-1說明小分子與大分子結(jié)合性很好，且值越小表示越可能自發(fā)結(jié)合。本次對接結(jié)合能均<-5 kcal·mol-1，并且beta-sitosterol、aloe-emodin、EUPATIN的結(jié)合能明顯小于兩個(gè)西藥的結(jié)合能。將結(jié)合能最低的前二組對接細(xì)節(jié)展示，可見小分子結(jié)合在蛋白的活性口袋，并且aloe-emodin與HSP90AA1活性位點(diǎn)的TYR-364、ARG-346、ARG-345、ARG-386形成5個(gè)氫鍵相互作用，EUPATIN與HSP90AA1活性位點(diǎn)的PHE-369、ARG-386形成2個(gè)氫鍵相互作用，氫鍵通過原子間的虛線連接，提示分析所得的大黃關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)之間結(jié)合性很好、構(gòu)象穩(wěn)定和生物活性高。

3 討論

中醫(yī)將AP歸屬于“腹痛”“胰癉”等范疇，在利用大黃治療AP的臨床實(shí)踐中有著歷史悠久且獨(dú)具特色的經(jīng)驗(yàn)。利用系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接對其在AP中發(fā)揮的作用機(jī)制進(jìn)行分析，將能較大程度的在大黃多個(gè)靶點(diǎn)、多個(gè)通路中預(yù)測與AP密切聯(lián)系的靶點(diǎn)、通路，從而提高臨床實(shí)驗(yàn)效率，在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中獲得重大突破，為臨床用藥增加中醫(yī)自信。

在本文中，課題組綜合結(jié)果分析可知，大黃治療AP主要且核心的前3個(gè)活性成分為β-谷固醇(beta-sitosterol)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、澤蘭黃醇(EUPATIN)，即是大黃本身主要的活性成分，也是大黃治療AP核心的藥效成分。beta-sitosterol是一種最常見的的天然植物固醇，能影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，參與調(diào)節(jié)膜的相關(guān)代謝，具有降脂、抗炎等生物活性[7]。其通過減少腸道對膽固醇的吸收，能減少胰腺中游離脂肪酸的大量積累，避免活性氧簇和活性氮簇大量生成，從而抑制氧化應(yīng)激機(jī)制啟動(dòng)，減少對胰腺細(xì)胞的脂毒性和炎性損傷[8]。另外，促炎和抗炎細(xì)胞因子的平衡對于AP炎癥的進(jìn)展至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道，beta-sitosterol可下降TNF-α、IL-1β、IL-2等促炎細(xì)胞因子水平，升高IL-10和TGF-β等抗炎細(xì)胞因子水平，并降低VEGF和NF-kB表達(dá)，增加HO-1，Nrf-2表達(dá)，即抑制NF-kB，激活HO-1/Nrf-2途徑，從而表現(xiàn)出減輕組織炎癥水腫，改善微循環(huán)障礙的作用[9]。表明beta-sitosterol有通過降脂、抗氧化應(yīng)激和抗炎，降低高脂血癥胰腺炎往重癥發(fā)展的趨勢。眾所周知，aloe-emodin存在于蘆薈、大黃等多種中藥中，是大黃蒽醌類屬中較為重要的部分，初步證明本文2.1中預(yù)測大黃活性成分的可靠性。其通過清除氧自由基，減少脂質(zhì)過氧化物的堆積，避免了脂質(zhì)過氧化損傷，達(dá)到降低血脂目的的同時(shí)，還防止了胰腺組織的壞死[10]。并且，Gao等[11]發(fā)現(xiàn)，aloe-emodin能通過Nrf2/HO-1信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制NLRP3炎性體激活，抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，下調(diào)caspase-1水平，有效地保護(hù)大鼠免受AP損傷。這正是對aloe-emodin治療AP機(jī)制的進(jìn)一步探索。另一方面，NO由NOS的酶家族產(chǎn)生，不僅在胰島中表達(dá)，也在胰腺外分泌區(qū)室和脈管系統(tǒng)中，而黃花蒿屬植物中的多甲氧基黃酮類化合物EUPATIN已明確具有減少NO的作用，能明顯降低AP大鼠的p65、iNOS、IL-6表達(dá)，減弱巨噬細(xì)胞中NF-κB依賴性炎癥，從而緩解AP早期的炎癥因子風(fēng)暴[12]。在2.8的分子對接中beta-sitosterol、aloe-emodin、EUPATIN與AP的主要靶點(diǎn)HSP90AA1結(jié)合能明顯小于兩個(gè)西藥的結(jié)合能，正是大黃在治療AP中生物活性較高的體現(xiàn)。此外，HSP90AA1是HSP90家族最重要的熱激蛋白之一，是真核生物必不可少的伴侶蛋白，能調(diào)節(jié)蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞信號(hào)蛋白的穩(wěn)定性和活性，并與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或信息處理有關(guān)的蛋白質(zhì)保持聯(lián)系[13]。其在中毒、缺氧等應(yīng)激條件下會(huì)被激活，能被IL-2、NF-kB或RELA誘導(dǎo)表達(dá)，與急性損傷和炎癥相關(guān)，常提示預(yù)后不良[14]。這就產(chǎn)生了一個(gè)陽性的反饋回路，易在炎癥部位引起炎癥性風(fēng)暴。然而目前大量的研究表明，抑制HSP90AA1可通過泛素-蛋白酶途徑和NF-kB信號(hào)通路增加其伴侶蛋白質(zhì)降解，阻斷信號(hào)通路的激活，并引起巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞因子的后續(xù)損失，顯著減輕炎癥反應(yīng)[15]。

另一方面，對GO富集分析的137個(gè)細(xì)胞生物過程分析得知，有毒物質(zhì)、非生物刺激、氧氣水平、活性氧的代謝、DNA損傷、凋亡等大多與AP的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。KEGG富集分析中得到87條信號(hào)通路中顯著富集在p53信號(hào)通路。p53位于17p染色體上，是細(xì)胞生存或凋亡的“分子開關(guān)”，可調(diào)節(jié)DNA修復(fù)、細(xì)胞增殖和凋亡等，在DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[16]。正常情況下，p53與MDM2的產(chǎn)物相互作用且保持在較低水平。當(dāng)細(xì)胞受有毒物質(zhì)等刺激時(shí)，發(fā)生DNA損傷，ATM識(shí)別受損的DNA分子進(jìn)而磷酸化Chk2，活化的Chk2又進(jìn)一步磷酸化PARC，從而增加p53蛋白的表達(dá)[17]；另外，ATM也可直接磷酸化激活p53。當(dāng)活化的p53蛋白積累到一定水平時(shí)，可轉(zhuǎn)錄激活促凋亡基因，如Bax、Caspse 9及Caspse 3，也可轉(zhuǎn)錄抑制抗凋亡基因，如Bcl-2，誘導(dǎo)線粒體途徑和死亡受體途徑的細(xì)胞凋亡[18]。而靶點(diǎn)HSP90AA1作為伴侶蛋白，從上面的分析知道，被大黃關(guān)鍵成分抑制后可阻止p53信號(hào)通路泛素化降解，抑制AP發(fā)展。

綜上所知，大黃的beta-sitosterol等核心活性成分可通過HSP90AA1等疾病靶點(diǎn)干預(yù)p53信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡等過程，緩解AP的炎癥反應(yīng)。同時(shí)受有毒物質(zhì)、非生物刺激、氧氣水平等生物過程影響。