崔 京，李逸雯，羅斌玉，朱夢夢，陳可冀，劉 玥

(國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091)

動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病目前仍然嚴(yán)重威脅人類健康，已成為國人的重要死因之一[1]。陳可冀院士帶領(lǐng)研究團(tuán)隊(duì)基于中醫(yī)“血瘀”理論，結(jié)合多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，采用循證醫(yī)學(xué)的方法證實(shí)了活血化瘀法治療動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的顯著療效，并結(jié)合急性心血管事件的發(fā)生特點(diǎn)和動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的病理生理特點(diǎn)創(chuàng)新性提出“瘀毒致易損斑塊”的理論[2]及活血解毒治法的臨床應(yīng)用優(yōu)勢，為拓展血瘀證及活血化瘀研究領(lǐng)域奠定了理論與實(shí)踐支撐。

當(dāng)歸-金銀花作為清熱解毒與散瘀養(yǎng)血兼顧的配伍，在清熱活血解毒歷代名方中均有廣泛應(yīng)用，如四妙勇安湯、仙方活命飲、托里消毒散等，現(xiàn)今仍被廣泛應(yīng)用于“異病同治”多種證屬熱毒血瘀范疇的疾病，其中四妙勇安湯在動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病，尤其是辨證屬“瘀毒互結(jié)”的治療中的探究較為全面[3]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，金銀花在體外具有抗炎、抗血小板聚集的作用[4]，當(dāng)歸可以改善冠脈循環(huán)，保護(hù)心肌細(xì)胞，其有效成分阿魏酸鈉同樣被證實(shí)在抗血小板聚集方面療效確切[5]。

本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[6]對(duì)當(dāng)歸-金銀花配伍有效活性成分和動(dòng)脈粥樣硬化疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選及預(yù)測分析，并用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證篩選出的活性物質(zhì)與作用靶點(diǎn)的結(jié)合情況，為當(dāng)歸-金銀花配伍和AS的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 “當(dāng)歸-金銀花”藥物成分及潛在作用靶點(diǎn)篩選以當(dāng)歸、金銀花為關(guān)鍵詞檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)，根據(jù)口服生物利用度OB≥30%、藥物相似性DL≥0.18兩個(gè)參數(shù)對(duì)藥物成分進(jìn)行篩選，獲得活性成分及作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)對(duì)未預(yù)測到及口服利用度低但具有良好治療作用的成分及靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充。利用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對(duì)當(dāng)歸-金銀花活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化處理，限定物種為“Homo Sapiens”。

1.2 動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)靶點(diǎn)篩選以“atherosclerosis”為關(guān)鍵詞檢索Gene Cards數(shù)據(jù)庫獲取動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)靶點(diǎn)基因，并通過OMIM數(shù)據(jù)庫及Drugbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行補(bǔ)充。合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫基因靶點(diǎn)并刪除重復(fù)值，最終獲得對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 “當(dāng)歸-金銀花”與動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建根據(jù)已獲取的藥物和疾病相關(guān)靶點(diǎn)，利用Venny 2.1將當(dāng)歸-金銀花作用靶點(diǎn)與動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，得到共同靶點(diǎn)。將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 11.0數(shù)據(jù)庫，生物種類設(shè)為“Homo sapiens”，最小相互作用評(píng)分設(shè)定為>0.9，其余設(shè)置默認(rèn)并對(duì)游離節(jié)點(diǎn)進(jìn)行隱藏，構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 基因本體(Gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析利用Metascape平臺(tái)對(duì)當(dāng)歸-金銀花抗動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，物種選擇“H.sapiens”，選取P<0.01的GO生物學(xué)過程和KEGG通路，通過Omicshare和Bioinformatics平臺(tái)實(shí)現(xiàn)可視化。

1.5 “藥物核心成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將已獲得的當(dāng)歸-金銀花藥物活性成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)通路整理后導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，利用內(nèi)置分析工具進(jìn)行分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，選取度值前10位的有效成分、作用靶點(diǎn)及度值前20位的通路建立“藥物核心成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證分別選取Cytoscape 3.8.2軟件分析結(jié)果中度值前10位的有效成分與潛在作用靶點(diǎn)，在PubChem和RCSB PDB平臺(tái)獲取小分子配體和蛋白受體，以分辨率高和參考文獻(xiàn)支持為篩選條件。通過ChemOffice對(duì)小分子配體進(jìn)行能量最小化處理，PyMOL軟件對(duì)蛋白配體移除水分子、小分子配體，AutoDockTools加氫、計(jì)算電荷并設(shè)置為剛性分子。最后選中所有活性位點(diǎn)，通過AutoDockTools設(shè)置對(duì)接盒子進(jìn)行分子對(duì)接，OpenBabel軟件與PLIP平臺(tái)確定結(jié)合位點(diǎn)并進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 “當(dāng)歸-金銀花”活性化合物篩選及活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在TCMSP數(shù)據(jù)庫中按OB值和DL值進(jìn)行篩選及閱讀文獻(xiàn)補(bǔ)充[7]，共得到當(dāng)歸-金銀花藥對(duì)活性成分31種，其中當(dāng)歸有效成分11種、金銀花23種，共同成分3種(Tab 1)，靶點(diǎn)509個(gè)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，得到“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 1)，分別用不同形狀、顏色代表中藥成分及靶點(diǎn)基因。Fig 1共包含542個(gè)節(jié)點(diǎn)，820條邊，運(yùn)用軟件中Analyse Network計(jì)算，按度值大小順序排列節(jié)點(diǎn)。

Fig 1 Chinese medicine herb-compound-target network of angelica sinensis-lonicerae japonicae flos

Tab 1 Characteristic parameters of network nodes of main active components of angelica

2.2 動(dòng)脈粥樣硬化潛在靶點(diǎn)收集通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫得到動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)靶點(diǎn)4623個(gè)，按Relevance Score值從高到低排序，取前1/2的目標(biāo)靶點(diǎn)，即Relevance Score>1為動(dòng)脈粥樣硬化潛在靶點(diǎn)，再結(jié)合OMIM、Drugbank數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值，最終得到2118個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)篩選與靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治鐾ㄟ^Venny 2.1將當(dāng)歸-金銀花活性成分靶點(diǎn)與動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)取交集，并繪制韋恩圖(Fig 2)，得到共同靶點(diǎn)210個(gè)，約占靶點(diǎn)總數(shù)的8%。將共同靶點(diǎn)上傳至String 11.0平臺(tái)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置置信度>0.900，“Network Type”選擇“physical network”，清除游離節(jié)點(diǎn)，共形成248個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 266條邊，節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)，“邊”代表作用靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)(Fig 3)。

Fig 2 Ingredients of angelica sinensis-lonicerae japonicae

將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2，利用Analyse Network進(jìn)行計(jì)算，得到平均節(jié)點(diǎn)度值約為11.25，平均介度約為0.008 96，平均緊密度約為0.367，按≥2倍平均值的節(jié)點(diǎn)度值和介度、大于平均值的緊密度值篩選得到20個(gè)靶點(diǎn)，認(rèn)為是當(dāng)歸-金銀花配伍發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵靶點(diǎn)(Tab 2)。

Tab 2 Characteristic parameters of network nodes of main target gene

2.4 GO功能與KEGG通路的富集分析運(yùn)用metascape平臺(tái)對(duì)篩選到的靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋分析，共有條目3 354個(gè)，GO-BP生物過程(biological process，BP)2 961個(gè)，GO-CC細(xì)胞組成(cellular component，CC)151個(gè)，GO-MF分子功能(molecular function，MF)242個(gè)，篩選排名前10的功能(Fig 4)。

Fig 3 PPI network of angelica sinensis-lonicerae japonicae flos atherosclerosis target

Fig 4 GO enrichment analysis of potential targets of main components in angelica sinensis-lonicerae japonicae flos

結(jié)果可見生物過程涉及應(yīng)對(duì)受傷、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞死亡的積極調(diào)控、脂多糖的應(yīng)答等；細(xì)胞組成主要涉及膜筏、樹突、樹突樹、胞質(zhì)囊腔、分泌顆粒內(nèi)腔、細(xì)胞外基質(zhì)、胞質(zhì)核周區(qū)域等；分子功能主要體現(xiàn)在肽酶活力、作用于l -氨基酸肽、絲氨酸水解酶活性、酪氨酸激酶結(jié)合蛋白、絲氨酸蛋白酶內(nèi)肽酶活力、絲氨酸蛋白酶肽酶活力。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，潛在的當(dāng)歸-金銀花協(xié)同抗動(dòng)脈粥樣硬化治療靶點(diǎn)富集在250條通路上，選取排名前20通路，運(yùn)用omicshare平臺(tái)(https：//www.omicshare.com/)繪制氣泡圖行可視化分析(Fig 5)。氣泡大小表示基因數(shù)目，顏色差異代表基因富集的顯著性大小?？梢钥闯雠c當(dāng)歸-金銀花抗動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的排名靠前的關(guān)鍵通路有磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號(hào)通路(靶標(biāo)數(shù)43)、腺苷酸活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路(靶標(biāo)數(shù)37)、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化(靶標(biāo)數(shù)36)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(靶標(biāo)數(shù)35)、IL-17信號(hào)通路(靶標(biāo)數(shù)29)、細(xì)胞衰老(靶標(biāo)數(shù)28)、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路(靶標(biāo)數(shù)28)、細(xì)胞凋亡(靶標(biāo)數(shù)28)等，提示當(dāng)歸-金銀花配伍的活性成分主要是通過這些通路在抗動(dòng)脈粥樣硬化過程中發(fā)揮作用的。

Fig 5 Bubble diagram of analysis of KEGG

2.5 當(dāng)歸-金銀花活性成分-疾病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建采用Cytoscape 3.8.2軟件對(duì)篩選出的活性成分、疾病靶點(diǎn)及通路進(jìn)行可視化分析(Fig 6)。列出度值前10位的活性成分，見Tab 3。隨著技術(shù)發(fā)展，篩選藥物靶標(biāo)的方法也逐漸多樣，多種方法相結(jié)合可以相互佐證，提高篩選效率與準(zhǔn)確性。L-色氨酸(L-Tryptophane，50)、槲皮素(quercetin，39)、木犀草素(luteolin，31)、山奈酚(kaempferol， 25)、阿魏酸(ferulic acid，23)、β-胡蘿卜素(beta-carotene，21)、beta-谷甾醇(beta-sitosterol，20)、3-丁基-1(3H)-異苯并呋喃酮(3-Butylphthalide，14)、咖啡酸(caffeic acid，14)、蘆丁(rutin，14)是當(dāng)歸-金銀花配伍發(fā)揮作用的主要活性成分，前文PPI預(yù)測結(jié)果中前20位中有MAPK1、MAPK3、AKT1等3個(gè)靶點(diǎn)仍排在通路富集靶點(diǎn)的前10位中[8]，因此可能是發(fā)揮作用的主要靶點(diǎn)。

Tab 4 Characteristic parameters of network nodes of 10 potential targets

Fig 6 Network of compound-pathway-target

Tab 3 Characteristic parameters of network nodes of 20 main active components of angelica sinensis-lonicerae japonicae flos

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證根據(jù)之前分析結(jié)果，取當(dāng)歸-金銀花度值前10位有效成分與潛在作用靶點(diǎn)前10位，利用AutoDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接，運(yùn)用PyMOL軟件進(jìn)行可視化呈現(xiàn)(Fig 7、8)。結(jié)果顯示，山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、蘆丁(rutin)、beta-谷甾醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)是與疾病靶點(diǎn)結(jié)合較好的活性成分；MAPK3、AKT1、PRCKB是有效成分作用較好的疾病靶點(diǎn)。小分子配體與蛋白受體結(jié)合能越低，結(jié)合分子之間越穩(wěn)定，提示分子之間發(fā)生相互作用的可能性越大，F(xiàn)ig 8中展示了其中對(duì)接結(jié)果較好的4組。

3 討論

一直以來，AS與冠心病及急性冠脈綜合征等嚴(yán)重心血管不良事件的發(fā)生密不可分，脂蛋白代謝紊亂和炎癥是一直是受到廣泛關(guān)注的經(jīng)典理論。當(dāng)歸-金銀花是在臨床應(yīng)用中使用頻率較高的活血解毒中藥配伍，且已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中，金銀花的活性成分能夠抑制脂多糖刺激的一氧化氮(NO)和前列腺素E2(prostaglandin E2)的產(chǎn)生，顯著抑制p38 絲裂原活化蛋白激酶(mito-genactivated protein kinase，p38 MAPK)和PI3K-Akt，從而發(fā)揮抗炎的作用[9]；當(dāng)歸可以通過降低大鼠血清中NO含量，改善心肌缺血損傷[10]，其有效成分阿魏酸能夠抗血小板聚集、抑制膽固醇的合成，發(fā)揮抗血栓的功效。

本研究首先通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析了當(dāng)歸-金銀花配伍有效成分與動(dòng)脈粥樣硬化疾病相關(guān)靶點(diǎn)，初步篩選出槲皮素、木犀草素、蘆丁、阿魏酸等重要活性成分。槲皮素與山奈酚都屬于黃酮醇類化合物，槲皮素能夠降低血液中的總膽固醇和低密度脂蛋白，提高抗氧化能力，還具有降低血糖的治療潛力。木犀草素主要通過抑制炎癥與氧化應(yīng)激發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[11]，通過調(diào)節(jié)Nrf2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)保護(hù)鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的心臟組織，并且能夠通過抑制NF-κB的過度磷酸化和下調(diào)p38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)磷酸化保護(hù)小鼠心肌細(xì)胞缺血損傷，抑制心肌細(xì)胞的凋亡[12]。在心肌梗死小鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，阿魏酸具有很強(qiáng)的抗氧化和心臟保護(hù)作用，可以通過調(diào)節(jié)自噬來抑制心肌細(xì)胞凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阿魏酸可能是通過抑制炎癥因子、減少氧化低密度脂蛋白的生成，調(diào)節(jié)血脂，減少泡沫細(xì)胞形成等機(jī)制發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[13]。蘆丁能夠顯著提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，平衡心臟的氧化和抗氧化系統(tǒng)；通過增加內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮的產(chǎn)生而改善內(nèi)皮功能，減輕血管平滑肌細(xì)胞的早衰[14]，從而減輕動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)擔(dān)并穩(wěn)定斑塊。beta-谷甾醇則有利于改善脂蛋白狀況和主動(dòng)脈功能[15]，能明顯抑制TNF-α刺激的人類主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human artery endothelial cells，HAECs)中血管黏附分子1和細(xì)胞內(nèi)黏附分子1的表達(dá)，以及U937細(xì)胞與TNF-α刺激的HAEC的結(jié)合，削弱NF-κB p65的磷酸化，從而發(fā)揮藥效。

為了進(jìn)一步確證當(dāng)歸-金銀花在治療動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮作用的藥效基礎(chǔ)，接下來采用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)篩選得到的重要成分進(jìn)行驗(yàn)證。一般認(rèn)為結(jié)合能≤-5.0 kJ·mol-1時(shí)表明配體與受體結(jié)合發(fā)生作用的可能性較大，且構(gòu)象越穩(wěn)定時(shí)能量越低[16]。根據(jù)篩選結(jié)果，將前10位有效成分與前10位靶點(diǎn)蛋白分別進(jìn)行對(duì)接，發(fā)現(xiàn)MAPK3和MAPK1與重要成分的對(duì)接結(jié)果均較滿意，蘆丁與MAPK3(-10.4 kJ·mol-1)、木犀草素與MAPK3(-9.5 kJ·mol-1)、蘆丁與AKT1(-9.3 kJ·mol-1)、阿魏酸與MAPK3(-6.9 kJ·mol-1)是對(duì)接較好的組合，說明當(dāng)歸-金銀花可能通過抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化與遷移等多方面發(fā)揮作用。

本文研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)PPI及KEGG通路富集靶點(diǎn)預(yù)測均顯示MAPK1、MAPK3、AKT是當(dāng)歸-金銀花配伍作用于AS的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其次分別涉及APP、JUN、TP53與PRKCA、MAPK8、RAF1等靶點(diǎn)，說明MAPK家族成員在當(dāng)歸-金銀花抗動(dòng)脈粥樣硬化過程中扮演重要角色。經(jīng)過p38激活的MAPK通路，在大鼠心肌缺血/再灌注期間會(huì)增加不良心血管事件的發(fā)生。PRKCA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移、心肌細(xì)胞肥大和炎癥等，有研究發(fā)現(xiàn)其是小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)心肌收縮力和Ca2+穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，PRKCA過表達(dá)會(huì)降低心肌收縮力，而PRKCA缺乏則能預(yù)防心力衰竭[17]，但其在動(dòng)脈粥樣硬化中的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，PI3K-Akt信號(hào)通路與冠心病過程中的抗炎和抗凋亡有關(guān)[18]。綜合以上結(jié)果推測，當(dāng)歸-金銀花有效成分可能通過調(diào)控MAPK、PRKCA、PI3K-Akt信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎、抗細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞自噬最終起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，初步預(yù)測活血解毒中藥配伍(當(dāng)歸-金銀花)的有效成分及其在抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用中發(fā)揮作用的可能靶點(diǎn)，為后續(xù)開展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。